JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لثقافة جليوبلاستوما المستمدة من المريض الخلايا ضمن الحيوية أورثوجونالي الانضباطي مصممة لتقليد الدماغ مصفوفة ثلاثية الأبعاد. ويوفر هذا النهج في المختبر، المنهاج التجريبي الذي يحافظ على العديد من الخصائص في فيفو جليوبلاستوما الخلايا فقدت عادة في الثقافة.

Abstract

جليوبلاستوما (GBM) هو سرطان الجهاز العصبي المركزي الأكثر شيوعاً، ومع ذلك الأكثر فتكاً. في السنوات الأخيرة، ركزت العديد من الدراسات على كيف المصفوفة خارج الخلية (ECM) البيئة الدماغ فريدة من نوعها، مثل حمض الهيالورونيك (ها)، يسهل تطور الخليج للحاسبات الآلية والغزو. ومع ذلك، تتضمن معظم نماذج الثقافة في المختبر خلايا الخليج للحاسبات الآلية خارج إطار إدارة المحتوى في المؤسسة. تكثيفها مورين GBM الخلايا تستخدم عادة كذلك. بيد أن النماذج في فيفو تجعل من الصعب على عزل مساهمات السمات الفردية لمعقدة وورم المكروية لسلوك الورم. هنا، يمكننا وصف منصة ثقافة المستندة إلى المائية، وثلاثي الأبعاد (3D) ها أن يسمح للباحثين بشكل مستقل تغيير تركيز هكتار وصلابة. ارتفاع الوزن الجزيئي هكتار والبولي إيثيلين غليكول (شماعة) تتألف الهلاميات المائية، التي كروسلينكيد عن طريق إضافة مايكل من نوع حضور الخلايا الحية. الثقافات 3D المائية المستمدة من المريض GBM الخلايا معرض السلامة وانتشار معدلات جيدة أو أفضل منها، عند مثقف جليوماسفيريس القياسية. كما يتيح نظام المائية إدماج الببتيدات ECM mimetic لعزل آثار التفاعلات ECM الخلية المحددة. الهلاميات المائية تكون شفافة بصريا بحيث يمكن تصويرها خلايا حية في ثقافة 3D. وأخيراً، ها المائية الثقافات متوافقة مع التقنيات القياسية للتحليلات الجزيئية والخلوية، بما في ذلك بكر، النشاف الغربية وكريوسيكتيونينج متبوعاً تلطيخ الفلورة.

Introduction

نظم الثقافة (3D) ثلاثي الأبعاد الخص التفاعلات بين الخلايا وهذه المصفوفة خارج الخلية المحيطة بها (ECM) في الأنسجة الأصلية أفضل من على نظرائهم ثنائي الأبعاد (2D)1،2. التقدم في مجال هندسة الأنسجة قد أسفرت عن منصات ثقافة متطورة، 3D التي تمكن التحقيقات التي تسيطر عليها في المكونات المادية والكيميائية 1) كيف مصفوفة المكروية تؤثر على سلوك الخلية و 2) فعالية جديدة العلاجية استراتيجيات لعدد من الأمراض، بما في ذلك السرطان2. بينما نماذج في المختبر لا مراعاة للعوامل النظامية، مثل إشارات المناعي، والغدد الصماء، وهكذا لا يمكن أن تحل تماما في فيفو نماذج، أنها توفر العديد من المزايا بما في ذلك إمكانية تكرار نتائج، التحكم التجريبية، القدرة على تحمل التكاليف والسرعة. هنا، يمكننا وصف استخدام المخ mimetic الهلاميات المائية في 3D التي التقاط ثقافات خلايا ورم الدماغ المستمدة من المريض العديد من جوانب فسيولوجية الورم، على وجه الخصوص، القوى المحركة للحصول على معاملة المقاومة3. مقارنة بالأساليب الأخرى في المختبر ، هذه الثقافات تمثل أفضل النماذج في فيفو الورم والملاحظات السريرية3.

جليوبلاستوما (GBM) هو السرطان الأكثر تواترا والفتاكة التي تنشأ في الدماغ، مع متوسط بقاء فقط 1-2 سنوات4،5. في السنوات الأخيرة، ركزت العديد من الدراسات على تأثير البيئة مصفوفة ورم في GBM6،،من78. تم الإبلاغ عن ECM الدماغ فريدة تؤثر الهجرة الخلية الخليج للحاسبات الآلية والانتشار والمقاومة العلاجية6،،من78،9،10،11 , 12-حمض الهيالورونيك (ها) هو glycosaminoglycan وفيرة (هفوة) في الدماغ، حيث يتفاعل مع غيره الكمامات ومش بروتيوجليكانس لتشكيل المائية مثل13. وأفادت الدراسات العديد من أوفيريكسبريشن هكتار في الخليج للحاسبات الآلية الأورام وآثاره اللاحقة على السرطان التقدم8،9،13،،من1415،16 ،17. مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة الأخرى تؤثر أيضا على الخليج للحاسبات الآلية الورم النمو وغزو6،7،،من1518. على سبيل المثال، حمل هيتيروديميريزيشن مستقبلات إنتغرين سطح الخلية من خلال الربط بالتسلسل "إدارات" فيبرونيكتين وفيترونيكتين، والتي هي عادة overexpressed في الخليج للحاسبات الآلية، والشروع في الشلالات الإشارات المعقدة التي تعزز بقاء الورم19 ،،من2021. بالإضافة إلى التأثيرات البيوكيميائية، تؤثر الخصائص الفيزيائية للمصفوفة الأنسجة أيضا GBM التقدم22،23.

اكتساب مقاومة للعلاج المستمر أحد الدوافع الرئيسية للخليج للحاسبات الآلية الفتك4. المخدرات يظهر نتائج واعدة في 2D أو جليوماسفيري نماذج فشلت في الدراسات الحيوانية اللاحقة والحالات السريرية3، مشيراً إلى أن آثار العوامل ميكرونفيرونمينتال ساهم مساهمة كبيرة في الخليج للحاسبات الآلية الورم استجابة1. بينما يمكن أن توفر نماذج حيوانية 3D، الناحية الفسيولوجية المناسبة المكروية للخلايا المريض إكسينوجرافتيد وتوليد النتائج ذات الصلة سريرياً24،25، تعقد الدماغ المكروية في فيفو يجعل من التحدي لتحديد الميزات، بما في ذلك التفاعلات الخلية-مصفوفة، النتائج البيولوجية الرئيسية المحددة. تحديد الأهداف العلاجية الجديدة ستستفيد من استخدام منصات الثقافة المبسطة التي يتم تعريف الخصائص الفيزيائية والكيميائية الحيوية.

وخلافا لنماذج مادة بيولوجية تم الإبلاغ عنها سابقا من الخليج للحاسبات الآلية ورم المكروية26،27 التي لم تحقق صحيح التحكم الفردية ملامح البيوكيميائية والفيزيائية إدارة المحتوى في المؤسسة، منهاج مادة بيولوجية متعامد تمكن هنا ذكرت فصل مساهمات متعددة الميزات المستقلة إلى الخليج للحاسبات الآلية خلية النمط الظاهري. نقدم هنا، نظام المائية المستندة إلى ها، أورثوجونالي الانضباطي، للثقافة 3D من الخلايا GBM المستمدة من المريض. الهلاميات المائية تتشكل من مكونين البوليمر: ها 1) النشطة وخامل 2) بيولوجيا البولي إثيلين غليكول (الربط). الوتد مادة متوافق حيويا وماء مستخدمة على نطاق واسع مع البروتين منخفض الامتزاز والحد الأدنى الاستمناع28. هنا، هي فونكتيوناليزيد حوالي 5% مويتيس حمض الغلوكورونيك على سلاسل هكتار مع جماعات ثيول لتمكين crosslinking إلى متاحة تجارياً 4-ذراع-شماعة إنهاء مع ماليميديس عن طريق إضافة مايكل من نوع. في شكله الأكثر شيوعاً في الجسم، توجد هكتار في سلاسل عالية الوزن الجزيئي (حمو). هنا، ودرجة منخفضة من التعديل "حمو هكتار" (500-750 كاتشين) يساعد على الحفاظ على التفاعلات أصلي هكتار ولها مستقبلات الخلية، بما في ذلك CD4429. عن طريق استبدال ثيول شماعة لهكتار-ثيول مع المحافظة على نسبة مولى ثابتة من إجمالي ثيولس إلى ماليميديس، يمكن انفصلت تركيز هكتار من الخواص الميكانيكية الهلاميات المائية الناتجة عن ذلك. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام ضوابط المقايسة متزاوجة الببتيدات منتهية سيستين لعدد متوسط محددة من الأسلحة تم إنهاء ماليميدي في كل 4-الذراع-شماعة. دمج الببتيدات المشتقة من إدارة المحتوى في المؤسسة، ولاصقة يمكن من التفاعلات مع إينتيجرينس في الخلايا المستزرعة، من خلالها الإشارات الكيميائية الحيوية والكيميائية هي ترانسدوسيد1. إضافة ماليميدي-ثيول يحدث بسرعة كبيرة تحت الظروف الفسيولوجية، تقليل الوقت المطلوب لتغليف الخلايا وبقاء الخلايا المستمدة من المريض إلى أقصى حد. وعلاوة على ذلك، الثقافات المائية يمكن أن يعامل مثل عينة نموذجية من الأنسجة ومتوافقة مع تقنيات توصيف القياسية بما في ذلك النشاف الغربية والتدفق الخلوي وتلطيخ الفلورة. البروتوكول التالي يصف الإجراءات لاختلاق الهلاميات المائية، إنشاء ثقافات 3D المستمدة من المريض الخلايا الخليج للحاسبات الآلية والتقنيات لتحليل الكيمياء الحيوية.

Protocol

نفذت جميع الخطوات جمع الأنسجة البشرية تحت البروتوكولات المعتمدة مؤسسياً.

1-ثيوليشن حمض الهيالورونيك

ملاحظة: يتم ذكر نسب المولى فيما يتعلق بالعدد الإجمالي لمجموعات كاربوكسيلات ما لم يحدد خلاف ذلك.

  1. حل 500 ملغ من الصوديوم hyaluronate (هكتار، كاتشين 500-750) في 10 ملغ/مل في الماء المقطر، منزوع (DiH2س) في اﻷوتوكﻻف تعقيمها، 250 مل قارورة Erlenmeyer. إثارة الحل (~ 200 لفة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة بالكامل حل ها. استخدام شريط إثارة ولوحة إثارة المغناطيسية للحفاظ على رد فعل التحريك أثناء إجراء ثيوليشن.
  2. استخدام حمض الهيدروكلوريك 0.1 M (HCl)، ضبط الأس الهيدروجيني حل 5.5 هكتار. تزن بملغ 69.6 (0.25 × نسبة المولى) 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) كاربودييميدي (EDC).
    ملاحظة: على الرغم من أن تنمية الصادرات أونديسولفيد يمكن أن تضاف مباشرة إلى الحل هكتار، أنه من الأسهل عادة بحل المؤسسة أولاً في 1 مل من DiH2س وثم إضافة الحل تنمية الصادرات بسرعة إلى حل ها. قبل انحلال في 1 مل DiH2س يمكن أيضا أن يتم مع N-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS) وديهيدروتشولوريدي سيستاميني قبل إضافة إلى رد الفعل في خطوات 1.3 و 1.4.
  3. إضافة 17.9 مغ (0.125 × نسبة المولى) لدائرة الصحة الوطنية لرد الفعل. ضبط الأس الهيدروجيني للحل رد فعل إلى 5.5 باستخدام 0.1 M HCl واحتضان التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
  4. إضافة مغ 70.0 (0.25 × نسبة المولى) من هيدروكلوريد سيستاميني إلى حل رد فعل. استخدام هيدروكسيد الصوديوم 0.1 M (هيدروكسيد الصوديوم) لضبط الأس الهيدروجيني إلى 6.25. تبني رد الفعل في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها مع التحريك.
  5. اليوم التالي، استخدم 1 م هيدروكسيد الصوديوم لضبط درجة حموضة حل رد فعل حوالي 8. إضافة مغ 192 (4 × نسبة المولى) من ديثيوثريتول (DTT) إلى رد فعل. ضبط درجة الحموضة إلى 8 بعد إضافة القيمة وترك إثارة لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  6. استخدم 1 M HCl لضبط الأس الهيدروجيني إلى 4. نقل الخليط رد كامل في الغشاء غارقة قبل الغسيل الكلوي (الوزن الجزيئي الوقف حول كاتشين 13) ودياليزي ضد DiH2س قبل تعديلها لدرجة الحموضة 4.
    ملاحظة: يجب أن يكون حجم DiH2س للغسيل الكلوي على الأقل 40 مرة حجم الحل ها ريكتيد (مثلاً، عينة 50 مل في 2 لتر من DiH2س، الأس الهيدروجيني 4).
  7. استبدال الحل الغسيل الكلوي (DiH2س، ودرجة الحموضة 4) مرتين يوميا لمدة 3 أيام في درجة حرارة الغرفة.
  8. تصفية حل دياليزيد عن طريق غشاء 0.22 ميكرومتر، فراغ يحركها عامل التصفية. فلاش تجميد حل ثيولاتيد هكتار في نيتروجين سائل. استخدام ليوفيليزير لتجميد العينات الجافة أكثر من 2 يوما. ثيولاتيد ها في شكل الجافة يمكن تخزينها في مجفف فاكوومسيليد في-20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل.
  9. لتحديد درجة ثيوليشن، استخدم الاختبار ل Ellman و/أو بروتون الرنين المغناطيسي الطيفي30،31.

2-إعداد مواد كروسلينكينج

  1. حل ثيولاتيد هكتار في التركيز المطلوب (في هذا المثال، 13.3 مغ/مل) في حبيس مخزنة المالحة (20 مم حبيس هانك في المحلول الملحي ملح متوازن (حبس) المخزن المؤقت، وتعديلها لتندرج ضمن الرقم الهيدروجيني من 8-9) في قنينة العنبر لتقليل التعرض للضوء المحيط. يبقى الحل مع التحريك باستمرار.
    ملاحظة: قد تحدث تشكيل ثنائي كبريتيد السندات بين ثيولس مترافق لهكتار إذا كان pH فوق 8، الحل تركيز مرتفع للغاية، أو الحل هو ترك إثارة لفترة طويلة جداً قبل جيليشن. لتجنب هذه المشكلة، استخدم أدناه 15 ملغ/مل ثيولاتيد هكتار ويحل ثيولاتيد هكتار خلال ساعتين من تشكيل الهلاميات المائية.
  2. حل 4-الذراع-شماعة-ماليميدي (شماعة-القانون النموذجي للتحكيم، كاتشين 20) و 4-الذراع-شماعة-ثيول (شماعة-ثيول, كاتشين 20) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، الرقم الهيدروجيني 7.4، لإعداد 50 ملغم/مل شماعة-القانون النموذجي للتحكيم وشماعة-ثيول حلول الأسهم.
    ملاحظة: يستغرق على الأقل 1 ساعة بالكامل حل الكواشف الوتد.
  3. في حالة إضافة الببتيدات المشتقة من إدارة المحتوى في المؤسسة، حل الببتيدات المحتوية على سيستين في برنامج تلفزيوني أن يعد حلاً أسهم.
    ملاحظة: استخدم تركيز مخزون من 2-4 مم.
  4. قوالب مطاط السيليكون نقع في الإيثانول عن 20 دقيقة على الأقل لتنظيف لهم، ومن ثم اﻷوتوكﻻف لهم للتعقيم.

3-Hydrogel Crosslinking وتغليف خلية

ملاحظة: على سبيل مثال هنا، هو التغليف أربع فرد والهلاميات المائية ميليلتر 80 مع 0.5% (w/v) هكتار ومعامل ضاغطة للجيش الشعبي الكوري 1 وصف3. يرجى الاطلاع على الجدول 1 للمثال الوصفات التي تسفر عن الهلاميات المائية مع خصائص مختلفة: الهلاميات المائية هما إدراج الببتيد إنتغرين-ربط إدارات والهلاميات المائية هما إدماج قبعات سيستئين كعنصر تحكم سلبية للنشاط الببتيد. بذر تركيز الخلايا GBM المستمدة من المريض 500,000 خلايا/مل.

  1. تمييع الحل الأسهم شماعة-القانون النموذجي للتحكيم (50 ملغ/مل، من الخطوة 2، 2) إلى 12.5 ملغ/مل بإضافة 40 ميليلتر من الحل المخزون إلى 120 ميليلتر PBS. تقسيم الحل المخفف إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنبوبين حيث يحتوي كل أنبوب ميليلتر 80.
  2. إضافة 16 ميليلتر للأوراق المالية حل إدارات (2.8 مم، من الخطوة 2، 3) بأنبوب واحد وميليلتر 16 حل سيستين الأسهم (2.8 مم، من الخطوة 2، 3) للأنبوب الثاني. دوامة المزيج. وضع الحلول شماعة-القانون النموذجي للتحكيم-إدارات أو شماعة-القانون النموذجي للتحكيم-CYS على الجليد حتى استخدامها في الخطوة 3، 9.
    ملاحظة: الإجراء كما هو موضح هنا غلة الهلاميات المائية مع ميكرومتر ~ 140 من الببتيد. وهذا يعادل تقريبا 1 من كل الأسلحة شماعة المتاحة 8 محتلا مع ببتيد. وهذا يمكن أن تختلف عن طريق تغيير نسبة الببتيدات سيستين منتهية إلى المجموعات المتاحة ماليميدي المولى. وبصفة عامة، يمكن تحقيق أقصى تركيز ميكرومتر 280 من الببتيد بينما لا يزال يترك أعدادا كافية من ماليميدي المجموعات المتوفرة ل crosslinking المائية.
  3. تمييع الحل ثيول شماعة الأسهم (50 ملغ/مل، من الخطوة 2، 2) إلى 5 ملغ/مل بخلط 4 ميليلتر من 50 ملغم/مل الحل الأسهم مع 36 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. إضافة 120 ميليلتر من المذاب، ثيولاتيد هكتار من الخطوة 2، 1 إلى الخليط.
    ملاحظة: الحلول "حمو ها" لزجة جداً. وبالتالي، نوصي باستخدام تلميح ميكروبيبيتي الفوهة واسعة لنقل الحلول. ماصة ببطء لتجنب حل الخلاف على الجدران من نصيحة ميكروبيبيتي وتحسين دقة القياس.
  4. وضع قوالب نظيفة وجافة (أعد في الخطوة 2، 4) في كل بئر من صفيحة 12-جيدا-ثقافة الأنسجة المعالجة. استخدام نهاية نظيفة وحادة من طرف ماصة، اضغط على جل العفن وختم الاختيار المزدوجة بين قوالب وأسفل اللوحة جيدا.
    ملاحظة: التحقق من الختم مرة أخرى الحق قبل التغليف لمنع التسرب.
  5. ممر مثقف GBM الخلايا وتنأى إلى الخلايا المفردة وتحديد تركيز الخلية كما تم وصفه سابقا3.
    ملاحظة: لا يمكن فصل بعض خطوط الخليج للحاسبات الآلية إلى الخلايا المفردة. في هذه الحالة، يمكن أن يتم تغليف جليوماسفيريس كله. ومع ذلك، تعد خلايا مفردة معزولة بعد عد الخلايا المحددة تحسين إمكانية تكرار نتائج. بروتوكول باساجينج جليوماسفيري يختلف بين مختبرات مختلفة والعديد من هؤلاء يحتمل متوافقة مع تغليف المائية.
    1. (مستحسن) جليوماسفيريس الطرد المركزي في 500 غرام x 5 كحد أدنى لإزالة المادة طافية وإضافة 1 مل إنزيم تفكك خلية إلى خلية بيليه. ثم احتضانها لمدة 5 دقائق، التنصت على أنبوب تحرض بلطف.
    2. إضافة 4 مل من إكمال الثقافة المتوسطة (50 نانوغرام/مل مماثلة، 20 نانوغرام/مل صندوق الأجيال القادمة-2, 25 ميكروغرام/مل الهيبارين وتكملة مجموعة ال 21 والبنسلين/ستربتوميسين 1% في DMEM/F12) للخلايا.
    3. الطرد المركزي مرة أخرى في ز x 500 لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية. وأخيراً، ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل الوسط كاملة وتمرير الخلايا مع وقف التنفيذ من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر. المياه والصرف الصحي (مستحسن) المصفاة مع مل 4 إضافية من المتوسط كاملة إلى أقصى حد عدد الخلايا استردادها.
  6. تقدير تركيز الخلايا في تعليق استخدام هيموسيتوميتير. تقسيم الخلية تعليق 2 أنابيب الطرد المركزي، حيث يحتوي كل أنبوب خلايا ~ 80,000. الطرد المركزي في ز x 500 لمدة 5 دقائق؛ عموما، سوف تشكل الخلايا 80,000 2 80 ميليلتر الهلاميات المائية.
  7. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه واحد في 80 ميليلتر من حل شماعة-القانون النموذجي للتحكيم-إدارات وبيليه ثاني في ميليلتر 80 الحل CYS-شماعة-القانون النموذجي للتحكيم (إعدادها في الخطوة 3، 1).
  8. استخدام 200 ميليلتر، نصيحة ميكروبيبيتي واسعة الفوهة، الاستغناء عن 40 ميليلتر لحل ها (من الخطوة 3، 3 أعلاه) إلى كل العفن سيليكون المطاط (كما أعدت في الخطوة 3، 4).
  9. استخدام 200 ميليلتر، نصيحة الفوهة على نطاق ميكروبيبيتي، خلط ميليلتر 40 شماعة-القانون النموذجي للتحكيم-CYS أو شماعة-القانون النموذجي للتحكيم-إدارات الخلية الحل مع الحل هكتار في القالب. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً بسرعة لا تزيد عن 10 مرات. كرر لكل ثقافة جل يجري إعدادها.
    ملاحظة: هذه الخطوة تأخذ الممارسة، منذ جيليشن الأولى يحدث بسرعة (خلال 30 ثانية). "الماصة؛" صعودا وهبوطاً بينما تتحرك في التلميح إلى مواقع مختلفة في قوالب لضمان حتى خلط. دائماً نصيحة أدناه مستوى السائل لتجنب تكوين فقاعات الهواء. عدم ميكس تلميح مرات كثيرة كما قد الحصول على شكل هلام داخل ميكروبيبيتي الحل. ويمكن الجمع بين الوتد-القانون النموذجي للتحكيم-CYS وشماعة-القانون النموذجي للتحكيم-إدارات في نسب متفاوتة لتحقيق تركيز الببتيد إدارات المرجوة.
  10. ضع لوحة البئر الذي يحتوي على خلايا مغلفة جل إلى حاضنة ثقافة خلية 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق لضمان الانتهاء من رد فعل.
  11. إضافة 2-2.5 مل من الثقافة المتوسطة لكل بئر بتشكيل المواد الهلامية. استخدام عقيمة، 2 ميليلتر ماصة تلميح أو الجزئي-البسط، لفصل بلطف العفن وجل. استخدام الملقط المعقم قبل إزالة القالب من لوحة جيدا. ضع لوحة جيدا مرة أخرى إلى الخلية الحاضنة (37 درجة مئوية و 5 في المائة من أول أكسيد الكربون2) للثقافة والتجارب المستقبلية.
    ملاحظة: سحب القالب رأسياً إلى أعلى لتجنب إلحاق الضرر بثقافات هلام. وبصفة عامة، ينبغي استبدال المتوسطة في جل الثقافات كل 3-4 أيام. الحرص على عدم نضح الهلاميات المائية عند إزالة المتوسطة. إذا كان هذا مشكلة، نوصي باستخدام ماصة نقل بلاستيك. إذا كان من المعتزم الإضاءة الحيوية التصوير لتعقب عدد الخلايا، يجب أن ترانسدوسيد الخلايا GBM مع lentivirus ترميز مؤثرا التعبير لوسيفراس قبل التغليف، كما هو موضح سابقا3. للتصوير بالإضاءة الحيوية، إضافة 1 ملم د-لوسيفرين للثقافة المتوسطة ح 1 قبل تصوير التﻷلؤ.

4-إعداد النشاف الغربية

  1. تشيل أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل على الجليد (1 كل العينات هلام). بارد للطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية.
  2. إزالة المتوسطة من لوحات جيدا. نقل المواد الهلامية في أنابيب ميكروسينتريفوجي بريشيليد.
  3. إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت ريبا مع مثبطات البروتياز/الفوسفاتيز x 1.
  4. استخدام المحاقن 1 مل بإبرة ز 20، تفريق الجل عن طريق دفع الخليط كله من خلال إبرة على الأقل 20 مرة.
  5. فلاش تدور العينة باستخدام ميكروسينتريفوجي أعلى مقاعد البدلاء ومكان العينة مرة أخرى على الجليد.
  6. دوامة عينات بإيجاز كل 5 دقائق لمجموعة من 20 دقيقة.
  7. عينات من أجهزة الطرد المركزي في 14000 ز س لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  8. نقل المادة طافية إلى أنابيب ميكروسينتريفوجي الجديدة، مبردة مسبقاً وتخزينها في-20 درجة مئوية (قصيرة الأجل) أو و-80 درجة مئوية (طويلة الأجل). إجراء التفريد جل استخدام إجراءات معيارية، كما هو موضح سابقا3.

5-استخراج الخلايا المفردة من الثقافات المائية للتدفق الخلوي

  1. إزالة ثقافة جل المتوسطة ونقل (من الخطوة 3.11) في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
  2. احتضان جل مع 500 ميليلتر إنزيم تفكك الخلية (مثل تريبل إكسبرس) في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، أحياناً يسددها أنبوب تحرض.
  3. نقل الخليط في أنبوب 50 مل الطرد مركزي مع 5 مل متوسطة كاملة. ضع الأنبوب على الجليد.
  4. إرفاق إبرة 20 غرام على حقنه 10 مل. بلطف بتعليق خلية صعودا وهبوطاً من خلال سحب الإبرة 8 مرات.
  5. تدفق الخليط من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 70 في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي جديدة. تطبيق 5 مل إضافية من المتوسطة كاملة من خلال مصفاة لجمع أي الخلايا المتبقية.
  6. الطرد المركزي العينة في ز 400 x 5 الحد الأدنى إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت المطلوب للتدفق الخلوي (باستخدام البروتوكولات القياسية3).

6-تجميد الهلاميات المائية لتقطيع

  1. إزالة المتوسطة من الثقافات هلام (من الخطوة 3.11).
  2. احتضان جل الثقافات مع 2 مل من 4% بارافورمالدهيد (PFA) في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    تنبيه: منهاج عمل بيجين سامة ويجب أن تعالج بعناية.
  3. في اليوم التالي، إزالة منهاج عمل بيجين. إضافة 2 مل من محلول السكروز 5% في برنامج تلفزيوني للهلام واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
  4. استبدال 5% من محلول السكروز مع 2 مل من محلول السكروز 20% في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 30 دقيقة.
  5. استبدال محلول السكروز مع 2 مل الطازجة السكروز 20% في برنامج تلفزيوني واحتضانها 30 دقيقة إضافية.
  6. لمرة ثالثة، يحل محل محلول السكروز مع 2 مل الطازجة السكروز 20% في برنامج تلفزيوني. احتضان عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  7. إعداد السكروز 20% في مجمع "خفض درجة الحرارة المثلى" (OCT).
    ملاحظة: نظراً للزوجة OCT، تفكك السكروز يمكن أن يستغرق بعض الوقت (حتى بين عشية وضحاها). من المستحسن وضع الخليط على شاكر خلال حل للحفاظ على الانفعالات.
  8. إزالة محلول السكروز 20% في اليوم التالي، وصب بلطف السكروز 20% في أكتوبر حل أكثر من الهلام. تأكد من تغطية جيل كامل. تبني في 4 درجات مئوية عن ح 3.
  9. نقل الهلام داخل المركز من العفن التضمين استخدام ملعقة كبيرة، شقة؛ وهذا يجب أن يتم بعناية لتجنب إتلاف الهلام.
  10. بارد 2-ميثيلبوتاني داخل كريوتشامبير مع وجود فائض ثلج الجاف.
  11. ملء القالب التضمين مع أكتوبر خالصة (لا السكروز). تعبئة لأسفل الحافة العلوية للقالب.
  12. تجميد العينة المائية بالانغماس في تبريد 2-ميثيلبوتاني وثم الانتقال إلى تمزيقها.
  13. قسم العينة باستخدام كريوستات؛ ينصح سمك الباب 10-18 ميكرومتر وتقطيع درجة الحرارة حوالي-26 درجة مئوية.
  14. تنفيذ الإجراءات القياسية إيمونوستينينج على ثقافة جل مقطعة، كما هو موضح سابقا3.
    ملاحظة: يعرف PFA مهيجة ومسرطنة. الرجاء معالجة والتخلص منها منهاج العمل وفقا للمعايير المعمول بها محلياً والأنظمة.

7-مجموع الجيش الملكي النيبالي الاستخراج من العينات في المائية

ملاحظة: هنا، يمكننا وصف بروتوكول باستخدام تجاري كيت (انظر الجدول للمواد) لاستخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا المائية المستزرعة. المخازن المؤقتة وجميع المواد متوفرة داخل مجموعة المواد المستخدمة.

  1. إزالة الثقافة المتوسطة. استخدام ماصة نقل P1000 مع نصيحة تحمل على نطاق نقل الثقافة المائية إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة.
  2. إضافة 350 ميليلتر من المخزن المؤقت RLT للثقافة المائية.
  3. باستخدام إبرة ز 20 المرفقة بحقنه 1 مل، اجاد الجل عن طريق دفع الخليط كله من خلال إبرة على الأقل 20 مرة.
  4. تحويل المزيج كله إلى عمود الخالطون توضع في أنبوب جمع 2 مل. الطرد المركزي في 13,000 س ز 2 دقيقة.
  5. نقل المادة طافية في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.5 نظيفة. احرص على عدم تعكير متسرعا جل في الجزء السفلي.
  6. خلط العينة ليستي مع 350 ميليلتر من الإيثانول 100%. نقل جميع العينة إلى مكان عمود (من kit) تدور في أنبوب جمع 2 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 13,000 س ز.
  7. للحصول على الخطوات اللاحقة لتنقية الحمض النووي الريبي لبكر، اتبع البروتوكول العام التي توفرها الشركة المصنعة لمجموعة.
    ملاحظة: حالما يتم استخراج الحمض النووي الريبي، يمكن استخدام البروتوكولات القياسية لبكر.

النتائج

لكل دفعة من ثيولاتيد هكتار، درجة ثيوليشن وينبغي التحقق من استخدام ح1-الرنين المغناطيسي أو الاختبار Ellman. ها التعديل باستخدام الإجراء الموضح هنا دائماً يولد ~ 5% ثيولاتيون (يعرف بأنه نسبة المولى من ثيولس إلى disaccharides هكتار) (الشكل 1).

Discussion

يتطلب توليد بيانات استنساخه باستخدام هذا النظام ثلاثي الأبعاد الثقافة: 1) تتفق ثيوليشن دفعة لدفعة من ها، 2) الممارسة لتحقيق كفاءة خلط السلائف المائية والتعامل مع hydrogel الثقافات لمنع الضرر و 3) الأمثل البذر كثافة لكل خط الخلية المستخدمة.

عند نسبة وزن خاص من ها المطلوب هو في الما...

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (R21NS093199)، وجائزة 3R "قوس جامعة كاليفورنيا". نتوجه بالشكر الخالص إلى المختبر للدكتور هارلي كورنبلوم لتوفير خطوط الخلية HK301 و HK157. كما نشكر جامعة كاليفورنيا الأنسجة المختبرية الأساسية علم الأمراض (تبكل) على كريوسيكتيونينج، مرفق الأساسية المتقدمة الخفيفة الميكروسكوب/التحليل الطيفي (الزكاة) في معهد نانوسيستيمس كاليفورنيا (الهوية) في جامعة كاليفورنيا لاستخدام المجهر [كنفوكل]، معهد جامعة كاليفورنيا دمدم التصوير الجزيئي لاستخدام نظام التصوير إيفيس، جامعة كاليفورنيا الجزيئية الأجهزة مركز (MIC) لتوفير التحليل الطيفي الرنين المغناطيسي، والتدفق الخلوي الأساسية في جونسون شاملة سرطان مركز (جككك) في جامعة كاليفورنيا لتوفير التهوية لتدفق الخلوي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
pH meterThermo FisherN/AAny pH meter that has pH 2-10 sensitivity
Stir plateThermo FisherN/AGeneral lab equipment
Erlenmeyer flask (125mL)Thermo FisherFB-501-125
dialysis tubesThermo Fisher21-152-14
2L polypropylene beakerThermo FisherS01916
sodium hyaluronanLifecoreHA700k-5500-750 kDa range
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)Thermo FisherPI-22980
N-hydroxysuccinimide (NHS)sigma aldrich130672-5G
Hydrochloric acid (HCl)Thermo FisherSA48-500
Sodium hydroxide (NaOH)Thermo FisherSS266-1
Cystamine dihydrochlorideThermo FisherAC111770250
Dithiolthreitol (DTT)Thermo FisherBP172-25
Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acidSigma AldrichD218200-1G
Deuterated water (deuterium oxide)Thermo FisherAC166301000
0.22µm vacuum driven filterCellTreat229706
Phosphate buffered saline (PBS)Thermo FisherP32080-100T
Hanks' balanced salt saline (HBSS)Thermo FisherMT-21-022-CV
4-arm-PEG-maleimideJenKem TechnologyA7029-1molecular weight around 20kDa
4-arm-PEG-thiolJenKem TechnologyA7039-1molecular weight around 20kDa
L-Cysteine sigma aldrichC7880-100G
RGD ECM mimetic peptideGenscript BiotechN/ACustom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated
silicone moldsSigma AldrichGBL664201-25EAUse razor blade to cut into single pieces
complete culture mediumVariousVariousDMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs
patient derived GBM cellN/AN/A
20G needleBD medical305175
1mL syringeThermo Fisher14-823-434
10mL syringeBD medical302995
RIPA BufferThermo FisherPI-89901
protease/phosphatase inhibitor mini tabletsigma aldrich5892970001
vortex shakerThermo Fisher12-814-5Q
TrypLE expressThermo Fisher12604013
70µm cell strainerThermo Fisher22-363-548
ParaformaldehydeThermo FisherAC416785000Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4
D-sucroseThermo FisherBP220-1
Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compoundThermo FisherNC9373881
Cell culture incubatorThermo FisherN/AAny General One with 5% CO2 and 37C
fridge/freezerThermo FisherN/AAny General Lab equipment with -20C and -80C capacity
Disposable embedding moldsThermo Fisher12-20
LyapholizerLabconcoN/AAny -105C freeze dryers
HEPESThermo FisherBP310-500
Amber vialKimble Chase60912D-2
Wide orifice pipette tipsThermo Fisher9405120
2-methylbutaneThermo Fisher03551-4
Dry IceN/AN/A

References

  1. Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. . Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. , (2017).
  2. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  3. Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3d culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
  4. Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).
  5. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2006 - 2010. Journal of Neuro-Oncology. 15 (6), 788-796 (2013).
  6. Bellail, A. C., Hunter, S. B., Brat, D. J., Tan, C., Van Meir, E. G. Microregional extracellular matrix heterogeneity in brain modulates glioma cell invasion. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (6), 1046-1069 (2004).
  7. Zamecnik, J. The extracellular space and matrix of gliomas. Acta Neuropathologica. 110 (5), 435-442 (2005).
  8. Jadin, L., et al. Hyaluronan expression in primary and secondary brain tumors. Annals of translational medicine. 3 (6), (2015).
  9. Park, J. B., Kwak, H. J., Lee, S. H. Role of hyaluronan in glioma invasion. Cell adhesion & migration. 2 (3), 202-207 (2008).
  10. Pedron, S., et al. Spatially graded hydrogels for preclinical testing of glioblastoma anticancer therapeutics. MRS communications. 7 (3), 442-449 (2017).
  11. Jiglaire, C. J., et al. Ex vivo cultures of glioblastoma in three-dimensional hydrogel maintain the original tumor growth behavior and are suitable for preclinical drug and radiation sensitivity screening. Experimental cell research. 321 (2), 99-108 (2014).
  12. Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
  13. Day, A. J., Prestwich, G. D. Hyaluronan-binding proteins: tying up the giant. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 4585-4588 (2002).
  14. Wiranowska, M., Tresser, N., Saporta, S. The effect of interferon and anti-CD44 antibody on mouse glioma invasiveness in vitro. Anticancer Research. 18 (5A), 3331-3338 (1998).
  15. Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. GLIA. 59 (8), 1169-1180 (2011).
  16. Gilg, A. G., et al. Targeting hyaluronan interactions in malignant gliomas and their drug-resistant multipotent progenitors. Clinical Cancer Research. 14 (6), 1804-1813 (2008).
  17. Misra, S., Hascall, V. C., Markwald, R. R., Ghatak, S. Interactions between hyaluronan and its receptors (CD44, RHAMM) regulate the activities of inflammation and cancer. Frontiers in immunology. 6, 201 (2015).
  18. Varga, I., et al. Expression of invasion-related extracellular matrix molecules in human glioblastoma versus intracerebral lung adenocarcinoma metastasis. Zentralblatt fur Neurochirurgie. 71 (4), 173-180 (2010).
  19. Guo, W., Giancotti, F. G. Integrin signalling during tumour progression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 816-826 (2004).
  20. Bello, L., et al. αvβ3 and αvβ5 integrin expression in glioma periphery. Neurosurgery. 49 (2), 380-390 (2001).
  21. Chamberlain, M. C., Cloughsey, T., Reardon, D. A., Wen, P. Y. A novel treatment for glioblastoma: integrin inhibition. Expert review of neurotherapeutics. 12 (4), 421-435 (2012).
  22. Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
  23. Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
  24. Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
  25. Oh, Y. T., et al. Translational validation of personalized treatment strategy based on genetic characteristics of glioblastoma. PloS one. 9 (8), e103327 (2014).
  26. Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. C. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
  27. Wang, C., Tong, X., Yang, F. Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels. Molecular pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).
  28. Zhu, J. Bioactive modification of poly(ethylene glycol) hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 31 (17), 4639-4656 (2010).
  29. Stern, R., Asari, A. A., Sugahara, K. N. Hyaluronan fragments: an information-rich system. European journal of cell biology. 85 (8), 699-715 (2006).
  30. Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Ellman's reagent: 5, 5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)-a reexamination. Analytical biochemistry. 94 (1), 75-81 (1979).
  31. Jin, R., et al. Synthesis and characterization of hyaluronic acid-poly (ethylene glycol) hydrogels via Michael addition: An injectable biomaterial for cartilage repair. Acta biomaterialia. 6 (6), 1968-1977 (2010).
  32. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of visualized experiments. 41, 3-7 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

138 3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved