JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, üç boyutlu kültür glioblastoma hasta elde edilen hücre içinde uygun tunable Biyomalzeme beyin matris taklit etmek için tasarlanmış bir protokol mevcut. Bu yaklaşım bir vitro, in vivo glioblastoma hücre kültüründe genellikle kayıp birçok özelliklerini korur deneysel platformu sağlar.

Özet

Glioblastoma (GBM) en yaygın henüz en ölümcül, merkezi sinir sistemi kanseri de öyle. Son yıllarda, birçok çalışma nasıl benzersiz beyin çevre, hyaluronik asit (HA), gibi hücre dışı matriks (ECM) GBM ilerleme ve işgal kolaylaştırır üzerinde odaklanmıştır. Ancak, çoğu vitro kültür modelleri dışında bir ECM kapsamında GBM hücre içerir. GBM hücre fare xenografts de yaygın olarak kullanılır. Ancak, in vivo modelleri karmaşık tümör microenvironment tümör davranış özelliklerini tek tek katkılarıyla ayırmak zor hale. Burada, araştırmacılar bağımsız olarak HA konsantrasyon ve sertliği değiştirmek sağlar bir HA hidrojel tabanlı, üç boyutlu (3D) kültür platformu açıklayın. Yüksek molekül ağırlıklı HA ve Polietilen glikol (PEG) çapraz Michael-türü ek huzurunda canlı hücreleri ile olan hydrogels oluştururlar. Hasta kaynaklı GBM hücreleri sergi canlılığı ve nükleer silahların yayılmasına karşı 3D hidrojel kültürleri oranları kadar iyi, ya da standart olarak gliomaspheres kültürlü zaman daha iyi. Hidrojel sistem ayrıca belirli hücre-ECM etkileşimleri etkileri yalıtmak için ECM mimetic peptidler birleşmesiyle sağlar. Böylece canlı hücreleri 3D kültüründe görüntüsü Hydrogels optik saydamdır. Son olarak, HA hidrojel kültürler moleküler ve hücresel analizleri, PCR, Western blot ve ayirt boyama tarafından takip cryosectioning gibi standart teknikleri ile uyumludur.

Giriş

Üç boyutlu (3D) kültür sistemleri yerli dokularda onların iki boyutlu (2D) karşılıkları1,2daha iyi hücreleri ve onların çevreleyen hücre dışı matriks (ECM) arasındaki etkileşimler özetlemek. Doku mühendisliği gelişmeler yeni 1) nasıl kimyasal ve fiziksel bileşenleri kontrollü soruşturmalar matris microenvironment etkileyen hücre davranışları ve 2) etkinliğini sağlayan gelişmiş, 3D kültür platformlar vermiştir terapötik hastalıkları, kanserler2de dahil olmak üzere bir dizi için stratejiler. Vitro modelleri sinyalleri, endokrin ve bağışıklık gibi sistemik faktörler sorumlu olamadığınız ve böylece tamamen vivo içinde modelleri yerini alamaz iken, tekrarlanabilirlik, deneysel kontrol dahil olmak üzere çeşitli avantajları sağladıkları, uygun fiyatta ve hız. Burada, beyin mimetic hydrogels hangi 3D kültürler hasta kaynaklı Beyin tümör hücrelerinin tümör fizyolojisi, özellikle, tedavi direnç3edinme dinamikleri, bir çok yönünü yakalamak nasıl kullanılacağını açıklar. Diğer vitro yöntemlerine göre bu kültürler daha iyi vivo içinde tümör modelleri ve klinik gözlemler3temsil eder.

Glioblastoma (GBM) sadece 1-2 yıl4,5medyan sağkalım ile beyin kaynaklanan en sık ve öldürücü kanser olduğunu. Son yıllarda, birçok çalışma tümör matris çevre GBM6,7,8etkisi üzerinde odaklanmıştır. Benzersiz beyin ECM GBM hücre göç, yayılmasını önleme ve tedavi direnci6,7,8,9,10,11 etkiler bildirilmiştir , 12. hyaluronik asit (HA) nerede diğer GAGs ile etkileşim ve proteoglikanlar forma hidrojel benzeri bir kafes13beyin içinde bir bol glikozaminoglikan (GAG) olduğunu. Birçok çalışma GBM tümörler HA overexpression ve sonraki etkileri kanser ilerleme8,9,13,14,15,16 bildirdin ,17. Diğer ECM bileşenleri de GBM tümör büyüme ve işgal6,7,15,18etkiler. Örneğin, genellikle GBM içinde overexpressed, fibronektin ve vitronectin, heterodimerization hücre yüzey integrin reseptörlerinin bağlama "RGD" diziye aracılığıyla teşvik ve tümör hayatta kalma19 teşvik karmaşık sinyalleşme cascades başlatmak ,20,21. Biyokimyasal etkileri yanı sıra doku matris fiziksel özellikleri de GBM ilerleme22,23etkiler.

Sürekli terapiler direnç GBM ölümcül4ana sürücülerden biri değil. 2D veya gliomasphere modellerinde umut verici sonuçlar uyuşturucu sonraki hayvan çalışmaları ve klinik durumlarda3microenvironmental faktörlerin etkileri önemli ölçüde GBM tümör yanıt1olarak katkıda gösteren, başarısız oldu. Hayvan modelleri 3D sağlarken, fizyolojik microenvironment xenografted hasta hücrelere uygun ve klinik sonuçları24,25, beyin microenvironment in vivo karmaşıklığı oluşturmak Bu hücre-matris arasındaki etkileşimleri dahil olmak üzere özellikleri, belirli anahtar biyolojik sonuçları olduğunu belirlemek için zor yapar. Yeni tedavi hedefleri tanımlaması Biyokimya ve biyofizik özelliklerini tanımlandığı Basitleştirilmiş kültür platformlar kullanımından yararlanacaktır.

GBM tümör microenvironment26,27 daha önce bildirilen biomaterial modellerinin hangi özelliklerini tek tek fiziksel ve biyokimyasal ECM, biomaterial platformu üzerinde doğru dik kontrol elde değil GBM hücre fenotip birden çok bağımsız özellikleri katkıların bildirilen burada etkinleştirir ayırımı. Burada, hasta kaynaklı GBM hücre 3D kültür için bir HA tabanlı, uygun tunable hidrojel sistemi mevcut. Hydrogels iki polimer bileşenlerinden oluşan: 1) biyolojik olarak aktif HA ve 2) biyolojik olarak inert Polietilen glikol (PEG). PEG düşük protein adsorpsiyon ve en az immünojenisite28ile bulunan yaygın olarak kullanılan biyouyumlu ve hidrofil malzemesidir. Burada, HA ile zincir glucuronic asit moieties yaklaşık % 5'i thiol gruplarla crosslinking bir piyasada bulunan 4-kol-maleimides yolu ile Michael-türü ek ile sona PEG için etkinleştirmek için functionalized. Vücuttaki en genel haliyle, HA yüksek molekül ağırlıklı (HMW) zincirler içinde bulunmaktadır. Burada, düşük derece HMW HA (500-750 kDa) değişiklik HA ve CD4429dahil olmak üzere onun hücre reseptörleri yerli etkileşimler korumak için yardımcı olur. PEG-thiol HA-thiol için toplam thiols maleimides için bir sabit molar oranını koruyarak yerine kullanarak, HA konsantrasyonu elde edilen hydrogels mekanik özelliklerinden decoupled. Ayrıca, her 4-kol-PEG maleimide sonlandırılmış kollarda Ortalama sayıda peptidler sistein sonlandırılmış çekimlerine stokiometrik denetimleri kullanılabilir. ECM kaynaklı, yapışkanlı peptidler birleşmesiyle integrinler kültürlü hücrelerde, hangi aracılığıyla kimyasal ve biyokimyasal transduced1sinyaller ile etkileşim sağlar. Maleimide-thiol yanı sıra çok hızlı bir şekilde hücre saklama ve hasta elde edilen hücre maximizing hayatta kalmak için gereken süreyi en aza indirerek fizyolojik koşullar altında gerçekleşir. Ayrıca, hidrojel kültürler tipik doku örneği gibi tedavi edilebilir ve Western blot, akış sitometresi ve ayirt boyama gibi standart karakterizasyonu teknikleri ile uyumlu değildir. Aşağıdaki iletişim kuralı hydrogels, 3D kültürleri hasta kaynaklı GBM hücreleri ve biyokimyasal analiz teknikleri kurulması imalatı için yordamlar açıklanır.

Protokol

Tüm insan dokusu koleksiyonu adımları kurumsal olarak onaylanmış protokolleri altında yapılmıştır.

1. hyaluronik asit Thiolation

Not: Molar oranları aksi belirtilmedikçe karboksilat Grup toplam sayısı ile ilgili olarak ifade edilir.

  1. Sodyum hyaluronate (HA, 500-750 kDa) 500 mg 10 mg/mL deiyonize, distile su (DiH2O), 250 mL Erlenmeyer flask steril bir Otoklav içinde geçiyoruz. HA tamamen erimesi 2 saat oda sıcaklığında çözüm (~ 200 devir/dakika) karıştırın. Bir heyecan bar ve manyetik heyecan plaka thiolation işlem sırasında karıştırarak tepki tutmak için kullanın.
  2. 0.1 M hidroklorik asit (HCl) kullanarak, pH 5.5 HA çözeltinin ayarlayın. 69,6 mg (molar oranı x 0,25) 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) tartmak.
    Not: her ne kadar undissolved EDC HA çözüm doğrudan eklenebilir, EDC, ilk 1 mL DiH2O dağıtılması ve daha sonra hızlı bir şekilde EDC çözüm HA ekleyin genellikle daha kolaydır. Öncesi fesih DiH 1 ml2O da N-hydroxysuccinimide (NHS) ve cystamine dihydrocholoride ile adım 1.3 ve 1.4 tepki eklemeden önce yapılabilir.
  3. 17.9 mg (molar oranı x 0.125) NHS için tepki ekleyin. 45 dakika oda sıcaklığında tepki kuluçkaya ve pH 5.5 0.1 M HCl kullanarak tepki çözeltinin ayarlayın.
  4. 70.0 mg (molar oranı x 0,25) cystamine dihydrochloride tepki çözüm ekleyin. 0.1 M sodyum hidroksit (NaOH) pH 6,25 için ayarlamak için kullanın. Gecede karıştırma sırasında oda sıcaklığında tepki kuluçkaya.
  5. Ertesi gün, 1 M NaOH pH 8 için tepki çözeltinin ayarlamak için kullanın. 192 mg (4 molar oranı x) dithiothreitol (DTT) için tepki ekleyin. PH 8 başa DTT eklenmesinden sonra ayarlamak ve karıştırma için 1-2 saat oda sıcaklığında bırakın.
  6. 1 M HCl pH 4'e ayarlamak için kullanın. Tüm reaksiyon karışım öncesi diyaliz membran (moleküler ağırlık kesme 13 kDa çevresinde) içine aktarmak ve DiH karşı diyaliz2O önceden ayarlanmış pH 4.
    Not: En az 40 kez tepki HA çözüm (Örneğin, 2 L / DiH2O, pH 4 50 mL örnek) hacmi DiH2O diyaliz için hacmi olmalıdır.
  7. Diyaliz çözüm (DiH2O, pH 4) iki kere oda sıcaklığında 3 gün boyunca her gün değiştirin.
  8. Diyaliz solution'ı 0,22 µm Membran Vakum tahrikli filtre filtre. Donma çözüm thiolated HA sıvı azot, flash. Kuru örnekleri 2 gün içinde dondurmak için bir lyophilizer kullanın. Thiolated HA kuru formunda bir Kasa'da desiccator-20 ° C'de en az 6 ay süreyle saklanabilir.
  9. Thiolation derecesini belirlemek için Ellman'ın test ve/veya proton NMR spektroskopisi30,31kullanın.

2. Crosslinking malzemelerin hazırlanması

  1. Thiolated HA, HEPES arabelleğe alınmış serum fizyolojik (20 mM HEPES Hank'in dengeli tuz tuz çözeltisi (HBSS) arabelleği, pH 8-9 içinde düşmeye düzeltilmiş) içinde (Bu örnekte, 13,3 mg/mL) konsantrasyon istenen ortam ışığa maruz kalma en aza indirmek için bir kehribar şişe geçiyoruz. Sürekli karıştırarak çözüm tutmak.
    Not: Disülfür bağları HA Birleşik thiols arasında oluşumu pH 8 olduğunu, çözüm konsantrasyonu çok yüksek olduğunu, ya da çözüm için çok uzun süre önce jelleşme karıştırarak kaldıysa oluşabilir. Bu sorunu önlemek için 15 mg/mL thiolated HA kullanın ve thiolated HA hydrogels oluşturan 2 saat içinde çözülür.
  2. 4-kol-PEG-maleimide (PEG-Mal, 20 kDa) ve 4-kol-PEG-thiol (PEG-thiol, 20 kDa) 50 mg/mL PEG-Mal ve PEG-thiol hisse senedi çözümleri hazırlamak için fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7.4, içinde çözülür.
    Not: Bu tam olarak PEG reaktifler çözülmeye en az 1 saat alır.
  3. Eğer ECM kaynaklı peptidler ekleyerek, sistein içeren peptidler içinde hisse senedi bir çözüm hazırlamak için PBS çözülür.
    Not: bir hisse senedi toplama 2-4 mm kullanın.
  4. Emmek silikon kauçuk etanol için en az 20 dk için temiz onları ve sonra Otoklav içinde onları sterilizasyon için kalıplar.

3. hidrojel Crosslinking ve hücre kapsülleme

Not: örnek olarak, dört kişi, 80 µL hydrogels %0,5 (w/v) HA ve 1 kPa basınç modülü encapsulation açıklanan3işte. Tablo 1 hydrogels değişen özellikleri ile verim örnek yemek tarifleri için bakınız: integrin bağlama peptid RGD birleştiren iki hydrogels ve iki hydrogels peptid etkinliği için bir negatif kontrol olarak sistein caps ekleme. GBM hücre hasta elde edilen konsantrasyon tohum 500.000 hücreler/ml'dir.

  1. PEG-Mal stok çözüm (50 mg/mL, adım 2.2) 12.5 mg/ml 120 µL PBS'ye hisse senedi çözüm 40 µL ekleyerek sulandırmak. Böylece her tüp 80 µL seyreltilmiş çözüm iki 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine bölünmüş.
  2. 16 µL stokunun RGD çözüm (adım 2,3 2,8 mM) bir tüp ve hisse senedi sistein çözüm (adım 2,3 2,8 mM) ikinci tüp 16 µL ekleyin. Girdap karıştırmak için. PEG-Mal-RGD veya PEG-Mal-CYS çözümler adım 3.9 kullanımda kadar buza koyun.
    Not: burada verimleri hydrogels peptid ~ 140 µM ile açıklandığı yordam. Bu yaklaşık 1 8 her kullanılabilir PEG silah ile bir peptid işgal dışında için eşdeğerdir. Bu peptidler sistein sonlandırılmış kullanılabilir maleimide gruplarına molar oranını değiştirerek değiştirilebilir. Genel olarak, peptid 280 µM maksimum konsantrasyon hala maleimide grupların hidrojel crosslinking için kullanılabilir yeterli sayıda bırakarak elde edilebilir.
  3. 5 mg/ml PEG-thiol hisse senedi çözüm (50 mg/mL, adım 2.2) olarak 50 mg/mL 4 µL hisse senedi çözüm PBS 36 µL ile karıştırılarak sulandırmak. Çözünmüş, thiolated HA, 120 µL 2.1 adımından karışıma ekleyin.
    Not: HMW HA çözümleri çok yapışkan. Böylece, geniş orifis micropipette uç çözümler aktarmak için kullanmanızı öneririz. Yavaş yavaş çözüm micropipette ipucu duvarlara yapışmasını önlemek için ve ölçüm doğruluğu artırmak için pipet.
  4. Temiz, Kuru kalıpları (2.4 adımda hazırlanan) doku kültürü tedavi 12-şey plaka her kuyunun içine yerleştirin. Pipet Ucu, temiz, künt sonuna kullanarak, jel kalıp ve iki kez kontrol sızdırmazlık kalıpları ve alt iyi plaka arasında basın.
    Not: daha önce Şu kapsülleme kaçağı önlemek için kontrol.
  5. Kültürlü GBM hücreleri geçiş, tek kişilik hücrelere ayırmak ve hücre konsantrasyonu daha önce3açıklandığı gibi belirlemek.
    Not: Bazı GBM satır tek hücrelere ayrışmış olamaz. Bu durumda, tüm gliomaspheres saklanmış. Ancak, tekrarlanabilirlik geliştirmek için kesin hücre sayımı sonra Disosiye tek hücreleri hazırlayın. Gliomasphere passaging için protokol farklı labs arasında değişir ve bunların çoğu büyük olasılıkla hidrojel kapsülleme ile uyumludur.
    1. (Önerilen) Santrifüj gliomaspheres 5 dakika süreyle 500 x g de süpernatant çıkarın ve 1 mL hücre ayrılma enzim hücre Pelet ekleyin. Daha sonra hafifçe dokunarak kışkırtmak için tüp 5 min için kuluçkaya.
    2. Tam kültür orta (50 ng/mL EGF, 20 ng/mL FGF-2, 25 µg/mL heparin, G21 ek ve % 1 penisilin/streptomisin DMEM/F12) 4 mL hücrelere ekleyin.
    3. 500 x g 5 min için de yine santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. Son olarak, hücre pelet 1 mL tam orta resuspend ve askıya alınan hücreler 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek. (Önerilen) yıkama süzgeç hücre sayısını en üst düzeye çıkarmak için tam orta bir ek 4 mL ile kurtarıldı.
  6. Hücrelerde bir hemasitometre kullanarak süspansiyon konsantrasyon tahmin ediyoruz. Hücre süspansiyon burada her tüpün ~ 80.000 hücreleri içeren 2 santrifüj tüpler içine bölünmüş. 500 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi; Genel olarak, 80.000 hücreleri 2 80 µL hydrogels kadar yapacak.
  7. Süpernatant kaldırmak ve bir Pelet 80 µL PEG-MAL-RGD çözüm ve ikinci bir Pelet 80 µL PEG-MAL-CYS çözüm (3.1 adımda hazırlanan) içinde resuspend.
  8. Bir 200 µL, geniş orifis micropipette ipucu kullanarak, HA çözümden (yukarıdaki adım 3.3) 40 µL (3,4 adımda hazırlanırken) her kauçuk silikon kalıp içine dağıtmak.
  9. Bir 200 µL, geniş orifis micropipette ipucu kullanarak, 40 µL PEG-MAL-CYS veya PEG-MAL-RGD hücre çözümü HA çözüm kalıp ile karıştırın. Yukarı ve aşağı hızlı bir şekilde en fazla 10 kez pipet. Hazırlıklı olmak her jel kültür için yineleyin.
    Not: ilk jelleşme hızlı bir şekilde oluşur bu yana bu adımı pratik, ister (30 içinde s). Yukarı ve aşağı kalıpları bile karıştırma sağlamak için farklı konumlarda için belgili tanımlık uç hareket ederken pipet. Her zaman ipucu hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için sıvı seviyesinin altında tutun. Çözüm çok kez jel micropipette içinde oluşan gibi ipucu mix yapmak. PEG-MAL-CYS ve PEG-MAL-RGD istenen RGD peptid toplama ulaşmak için değişen oranlarıyla birleştirilebilir.
  10. 5-10 dakika tepki tamamlanmasını sağlamak 37 ° C hücre kültür kuluçka içine jel kapsüllenmiş hücreleri içeren iyi plaka yerleştirin.
  11. 2-2.5 mL kültür ortamının her şey ile kurulan jelleri ekleyin. Bir steril, 2 µL pipet ucu veya mikro-spatula, nazikçe kalıp ve jel ayırmak için kullanın. Önceden sterilize forseps kalıp iyi plaka kaldırmak için kullanın. Hücre inkübatör (37 ° C ve % 5 CO2) kültür ve gelecekteki deneyler için iyi plakasına geri yerleştirin.
    Not: jel kültürler zarar önlemek için kalıp dikey olarak yukarı doğru çekin. Genel olarak, jel kültürler ortamda her 3-4 günde değiştirilmelidir. Hydrogels orta kaldırırken Aspire değil için dikkat ediniz. Bir sorun olursa, bir plastik transfer pipet kullanmanızı öneririz. Eğer cep numarasını izlemek için Imaging bioluminescence planlanmış, GBM hücreleri yapısal kodlama luciferase ifadesinden önce kapsülleme, yukarıda açıklanan3olarak lentivirus ile transduced gerekir. Bioluminescence görüntüleme için kültür orta ışıldama görüntüleme önce 1 h D-biyoluminesans 1 mM ekleyin.

4. lysate hazırlığı Batı kurutma

  1. Üzerine buz (1 jel örnekleri başına) 1.5 mL microcentrifuge boruları, sakin ol. Serin santrifüj ile 4 ° c
  2. Orta iyi plakaları kaldırın. Jelleri prechilled microcentrifuge tüpler içine aktarın.
  3. RIPA arabelleği 1 x proteaz/fosfataz inhibitörleri ile 100 µL ekleyin.
  4. 1 mL 20 G iğne ile kullanarak, jel kadar en az 20 kez iğne tüm karışımı iterek kır.
  5. Spin tezgah en iyi microcentrifuge ve örnek geri buza yer kullanarak örnek flash.
  6. Girdap kısaca her 5 dk toplam 20 dk örnekler.
  7. Santrifüj örnekleri 4 ° C'de 15 dakika 14000 x g de
  8. Yeni, önceden soğutulmuş microcentrifuge tüpler süpernatant aktarın ve depolayın (kısa vadeli)-20 ° C'de veya ve-80 ° C (uzun vadeli). Jel Elektroforez standart prosedürler, yukarıda açıklanan3kullanarak gerçekleştirin.

5. açılan tek hücreler için akış sitometresi hidrojel kültürlerden

  1. Orta ve transfer jel Kültür (Kimden adım 3.11) 1.5 mL microcentrifuge tüpüne kaldırın.
  2. Jel hücre ayrılma enzim (Örneğin, TrypLE Express) zaman zaman kışkırtmak için tüp flicking 5 min için 37 ° C'de 500 µL ile kuluçkaya.
  3. Karışımı bir 50 mL santrifüj tüpü ile 5 mL tam orta içine aktarın. Tüp buza koyun.
  4. 20 G iğne bir 10 mL şırınga üzerine ekleyin. Yavaşça hücre süspansiyon 8 kere iğne ile yukarı ve aşağı çekin.
  5. Karışımı bir yeni 50 mL santrifüj tüpüne 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla akış. Bir ek 5 mL tam orta de kalan hücreleri toplamak için süzgeç aracılığıyla uygulanır.
  6. 5 dk. süpernatant kaldırmak ve Pelet istenen arabelleği akış sitometresi (standart protokolleri3kullanarak) için resuspend örneği 400 x g'santrifüj kapasitesi.

6. Hydrogels kesit için dondurma

  1. Orta jel kültürler (Kimden adım 3.11) kaldırın.
  2. %4 paraformaldehyde (PFA) 2 mL jel kültürlerle gecede 4 ° C'de kuluçkaya.
    Dikkat: PFA toksik ve dikkatle ele alınması gerekir.
  3. Ertesi gün, İngiltere'de yılın kaldırın. 2 mL % 5 sükroz PBS içinde jeller için ekleyin ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
  4. PBS % 20 sukroz 2 mL % 5 sükroz çözüm yerine ve 30 dk için kuluçkaya.
  5. PBS taze % 20 sukroz 2 mL sukroz çözüm yerine ve ek bir 30 dk için kuluçkaya.
  6. Üçüncü kez, PBS taze % 20 sukroz 2 mL sukroz çözüm yerine. 4 ° C'de gecede kuluçkaya.
  7. En iyi kesim ısı (OCT) bileşik % 20 sükroz hazırlayın.
    Not: nedeniyle viskozite, Ekim, sukroz dağılması biraz sürebilir (en fazla bir gecede) zaman. Biz karışımı bir shaker ajitasyon korumak için dağılması sırasında koyarak öneririz.
  8. Ertesi gün, % 20 sükroz çözümü kaldırmak ve yavaşça % 20 sükroz OCT çözümde jel dökün. Tüm jel karşılamak emin olun. 3 h için 4 ° C'de kuluçkaya.
  9. Jel büyük, düz bir spatula kullanarak bir gömme kalıp merkezine transfer; Bu jel zarar görmesini önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.
  10. Serin 2 methylbutane aşırı kuru buz ile bir Kriyo içinde.
  11. Gömme kalıp saf OCT (sukroz) ile doldurun. İçin sadece kalıp üst kenarını doldurun.
  12. Hidrojel örnek daldırma tarafından soğutmalı 2-methylbutane içinde dondurmak ve kesit için devam edin.
  13. Bölüm bir cryostat kullanarak örnek; 10-18 µm kalınlığı bölümünde ve yaklaşık-26 ° c parça sıcaklık önerilir.
  14. Standart immunostaining yordamları kesitli jel kültür, yukarıda açıklanan3olarak gerçekleştirmek.
    Not: PFA tahriş edici ve kanserojen bilinir. Lütfen idare ve yerel olarak geçerli standartlara ve düzenlemelere göre İngiltere'de yılın atmayın.

7. Toplam RNA çekme--dan hidrojel örnekleri

Not: Burada, bir ticari bir iletişim kuralı'nı tarif (malzemeleri tablo görmek) Toplam RNA kültürlü hidrojel hücrelerden ayıklamak için kit. Arabellekleri ve tüm malzeme kullanılan kiti içinde mevcuttur.

  1. Kültür orta kaldırın. P1000 transfer pipet wide-geçişli ucuyla hidrojel kültür 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarmak için kullanın.
  2. 350 µL arabelleği RLT hidrojel kültür ekleyin.
  3. 1 mL şırınga bağlı 20 G iğne kullanarak, jel en az 20 kez iğne tüm karışımı iterek bile olmamalı.
  4. Tüm karışımı bir 2 mL toplama tüpü homogenizer sütun içine aktarın. 13.000 x g 2 min için de santrifüj kapasitesi.
  5. Süpernatant temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. Jel çökelti alt bozmamaya dikkat edin.
  6. Lysate örnek % 100 etanol 350 µL ile karıştırın. Tüm örnek bir spin sütundan (kit) yerde 2 mL toplama tüp aktarın. Santrifüj 13.000 x g, 1 dk için.
  7. Seti üreticisi tarafından sağlanan genel protokol uygun RNA arıtma PCR için sonraki adımları izleyin.
    Not: RNA ayıklandıktan sonra PCR standart protokoller kullanılabilir.

Sonuçlar

1H -NMR veya bir Ellman'ın testi kullanarak thiolated HA her toplu işlem için thiolation derecesini doğrulanması gerekir. HA burada sürekli olarak açıklanan yordamı kullanarak değişiklik (thiols HA disakkarit için molar oranı olarak tanımlanır) ~ %5 thiolation oluşturur (Şekil 1).

Bu yeni kültür platformu kurma büyük ölçekli deneyler uygulamak önce...

Tartışmalar

Bu 3D kültür sistemi kullanarak tekrarlanabilir veri nesil gerektirir: 1) tutarlı toplu iş toplu iş thiolation ha, verimli hidrojel öncüleri karıştırma ve hidrojel işleme elde etmek için pratik 2) zarar önlemek için kültürler ve optimize edilmiş 3) tohum kullanılan her hücre kültürünü yoğunluğu.

HA belirli ağırlık yüzdesi hidrojel istendiğinde, crosslink yoğunluk thiolation ha derecesini belirler. Toplu iş toplu iş değişim en aza indirmek için HA her thiolat...

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

Bu eser NIH (R21NS093199) ve UCLA ARC 3R's ödül fon ile desteklenmiştir. En içten teşekkürlerimizi Dr Harley Kornblum HK301 ve HK157 hücre hatları sağlanması için laboratuara gidin. Biz Ayrıca UCLA doku patoloji çekirdek Laboratuvarı (TPCL) cryosectioning için gelişmiş ışık mikroskobu/spektroskopisi çekirdek tesisi (sadaka) UCLA California Nanosystems Enstitüsü (CNSI) içinde confocal mikroskop, UCLA Institute for Crump kullanımı için teşekkür ederiz IVIS görüntüleme sistemi, UCLA moleküler araçları Merkezi (manyetik rezonans spektroskopi ve akış sitometresi çekirdek içinde Jonsson kapsamlı Kanser Merkezi (JCCC) UCLA akışı için araçları sağlamak için sağlamak için mikrofon) kullanmak için moleküler görüntüleme sitometresi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
pH meterThermo FisherN/AAny pH meter that has pH 2-10 sensitivity
Stir plateThermo FisherN/AGeneral lab equipment
Erlenmeyer flask (125mL)Thermo FisherFB-501-125
dialysis tubesThermo Fisher21-152-14
2L polypropylene beakerThermo FisherS01916
sodium hyaluronanLifecoreHA700k-5500-750 kDa range
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)Thermo FisherPI-22980
N-hydroxysuccinimide (NHS)sigma aldrich130672-5G
Hydrochloric acid (HCl)Thermo FisherSA48-500
Sodium hydroxide (NaOH)Thermo FisherSS266-1
Cystamine dihydrochlorideThermo FisherAC111770250
Dithiolthreitol (DTT)Thermo FisherBP172-25
Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acidSigma AldrichD218200-1G
Deuterated water (deuterium oxide)Thermo FisherAC166301000
0.22µm vacuum driven filterCellTreat229706
Phosphate buffered saline (PBS)Thermo FisherP32080-100T
Hanks' balanced salt saline (HBSS)Thermo FisherMT-21-022-CV
4-arm-PEG-maleimideJenKem TechnologyA7029-1molecular weight around 20kDa
4-arm-PEG-thiolJenKem TechnologyA7039-1molecular weight around 20kDa
L-Cysteine sigma aldrichC7880-100G
RGD ECM mimetic peptideGenscript BiotechN/ACustom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated
silicone moldsSigma AldrichGBL664201-25EAUse razor blade to cut into single pieces
complete culture mediumVariousVariousDMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs
patient derived GBM cellN/AN/A
20G needleBD medical305175
1mL syringeThermo Fisher14-823-434
10mL syringeBD medical302995
RIPA BufferThermo FisherPI-89901
protease/phosphatase inhibitor mini tabletsigma aldrich5892970001
vortex shakerThermo Fisher12-814-5Q
TrypLE expressThermo Fisher12604013
70µm cell strainerThermo Fisher22-363-548
ParaformaldehydeThermo FisherAC416785000Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4
D-sucroseThermo FisherBP220-1
Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compoundThermo FisherNC9373881
Cell culture incubatorThermo FisherN/AAny General One with 5% CO2 and 37C
fridge/freezerThermo FisherN/AAny General Lab equipment with -20C and -80C capacity
Disposable embedding moldsThermo Fisher12-20
LyapholizerLabconcoN/AAny -105C freeze dryers
HEPESThermo FisherBP310-500
Amber vialKimble Chase60912D-2
Wide orifice pipette tipsThermo Fisher9405120
2-methylbutaneThermo Fisher03551-4
Dry IceN/AN/A

Referanslar

  1. Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. . Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. , (2017).
  2. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  3. Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3d culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
  4. Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).
  5. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2006 - 2010. Journal of Neuro-Oncology. 15 (6), 788-796 (2013).
  6. Bellail, A. C., Hunter, S. B., Brat, D. J., Tan, C., Van Meir, E. G. Microregional extracellular matrix heterogeneity in brain modulates glioma cell invasion. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (6), 1046-1069 (2004).
  7. Zamecnik, J. The extracellular space and matrix of gliomas. Acta Neuropathologica. 110 (5), 435-442 (2005).
  8. Jadin, L., et al. Hyaluronan expression in primary and secondary brain tumors. Annals of translational medicine. 3 (6), (2015).
  9. Park, J. B., Kwak, H. J., Lee, S. H. Role of hyaluronan in glioma invasion. Cell adhesion & migration. 2 (3), 202-207 (2008).
  10. Pedron, S., et al. Spatially graded hydrogels for preclinical testing of glioblastoma anticancer therapeutics. MRS communications. 7 (3), 442-449 (2017).
  11. Jiglaire, C. J., et al. Ex vivo cultures of glioblastoma in three-dimensional hydrogel maintain the original tumor growth behavior and are suitable for preclinical drug and radiation sensitivity screening. Experimental cell research. 321 (2), 99-108 (2014).
  12. Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
  13. Day, A. J., Prestwich, G. D. Hyaluronan-binding proteins: tying up the giant. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 4585-4588 (2002).
  14. Wiranowska, M., Tresser, N., Saporta, S. The effect of interferon and anti-CD44 antibody on mouse glioma invasiveness in vitro. Anticancer Research. 18 (5A), 3331-3338 (1998).
  15. Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. GLIA. 59 (8), 1169-1180 (2011).
  16. Gilg, A. G., et al. Targeting hyaluronan interactions in malignant gliomas and their drug-resistant multipotent progenitors. Clinical Cancer Research. 14 (6), 1804-1813 (2008).
  17. Misra, S., Hascall, V. C., Markwald, R. R., Ghatak, S. Interactions between hyaluronan and its receptors (CD44, RHAMM) regulate the activities of inflammation and cancer. Frontiers in immunology. 6, 201 (2015).
  18. Varga, I., et al. Expression of invasion-related extracellular matrix molecules in human glioblastoma versus intracerebral lung adenocarcinoma metastasis. Zentralblatt fur Neurochirurgie. 71 (4), 173-180 (2010).
  19. Guo, W., Giancotti, F. G. Integrin signalling during tumour progression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 816-826 (2004).
  20. Bello, L., et al. αvβ3 and αvβ5 integrin expression in glioma periphery. Neurosurgery. 49 (2), 380-390 (2001).
  21. Chamberlain, M. C., Cloughsey, T., Reardon, D. A., Wen, P. Y. A novel treatment for glioblastoma: integrin inhibition. Expert review of neurotherapeutics. 12 (4), 421-435 (2012).
  22. Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
  23. Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
  24. Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
  25. Oh, Y. T., et al. Translational validation of personalized treatment strategy based on genetic characteristics of glioblastoma. PloS one. 9 (8), e103327 (2014).
  26. Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. C. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
  27. Wang, C., Tong, X., Yang, F. Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels. Molecular pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).
  28. Zhu, J. Bioactive modification of poly(ethylene glycol) hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 31 (17), 4639-4656 (2010).
  29. Stern, R., Asari, A. A., Sugahara, K. N. Hyaluronan fragments: an information-rich system. European journal of cell biology. 85 (8), 699-715 (2006).
  30. Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Ellman's reagent: 5, 5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)-a reexamination. Analytical biochemistry. 94 (1), 75-81 (1979).
  31. Jin, R., et al. Synthesis and characterization of hyaluronic acid-poly (ethylene glycol) hydrogels via Michael addition: An injectable biomaterial for cartilage repair. Acta biomaterialia. 6 (6), 1968-1977 (2010).
  32. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of visualized experiments. 41, 3-7 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendisliksay 138hyaluronik asit3D k lt rglioblastomamicroenvironmenth cre d matriksbiomaterialmechanobiologyila direnci

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır