Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، بروتوكول بسرعة وتكاثر توليد مستضد أرتيسيفيكال القابلة للتحلل بيولوجيا من وحي، وعرض الخلايا (آبك) مع الانضباطي الحجم والشكل والعرض التقديمي البروتين السطحي للخلية T التوسع السابقين فيفو أو الحية .

Abstract

مستضد الاصطناعي عرض الخلايا (آبك) منصة واعدة للتحوير المناعي نظراً لقدرتها القوية لتحفيز خلايا تي. ركائز اللاخلوي توفر مزايا رئيسية على aAPC يستند إلى الخلية، بما في ذلك مراقبة دقيقة لمعلمات عرض الإشارات والخصائص الفيزيائية لسطح آبك تعدل تفاعلاته مع خلايا تي. آبك مصنوع من جسيمات متباين، جسيمات ارتفاعات خاصة، قد ثبت أن يكون أكثر فعالية من نظرائهم كروية في تحفيز خلايا تي بسبب زيادة الربط وأكبر من المساحة المتوفرة للخلية T الاتصال، كذلك كما أن انخفاض الإقبال غير محدد وتعزيز خصائص الحرائك الدوائية. وعلى الرغم من الاهتمام المتزايد بالجسيمات متباين، مقبولة على نطاق واسع حتى أساليب توليد جسيمات متباين مثل تمتد غشاء رقيق يمكن أن يكون تحديا لتنفيذ واستخدام تكاثر.

وتحقيقا لهذه الغاية، وصف بروتوكول لتصنيع سريع وموحد للتحلل aAPC المستندة إلى الجسيمات متباين مع الانضباطي الحجم، الشكل، وإشارة العرض التقديمي لخلية تي توسع السابقين فيفو أو في فيفو، جنبا إلى جنب مع أساليب تميز حجمها ومورفولوجيا، والبروتين السطحي المحتوى، وتقييم الوظائف الخاصة بهم. هذا النهج إلى اختﻻق aAPC متباين للتحجيم واستنساخه، مما يجعله مثاليا لتوليد آبك إيمونوثيرابيس "الجاهزة للاستخدام".

Introduction

مستضد الاصطناعي عرض الخلايا (آبك) أظهرت الوعد كوكلاء immunomodulatory نظراً لأنها يمكن أن تولد استجابة قوية محددة مستضد T خلية. الأساسية لهذه الأنظمة الأساسية هي قدرتها على كفاءة تقديم إشارات حاسمة لتنشيط الخلية T. AAPC اللاخلوي بديل جذاب ليستند إلى الخلية آبك لأنها أسهل وأقل تكلفة اختﻻق وتواجه تحديات أقل أثناء الصعود والترجمة، والتخفيف من المخاطر المرتبطة بالعلاجات المستندة إلى الخلية. AAPC اللاخلوي تسمح أيضا بدرجة عالية من السيطرة على إشارة عرض المعلمات والخصائص الفيزيائية للسطح التي سوف تتفاعل مع خلايا تي1.

يجب أن الخص آبك على الأقل ضرورية لتنشيط الخلية تي إشارتين. إشارة 1 يوفر الاعتراف مستضد ويحدث عندما تسلم مستقبلات خلية تي (تكر) ويشترك مع فئة MHC I أو II تحمل مستضد المشابهة لها، بلغت ذروتها في إشارة عن طريق تكر المعقدة. لتجاوز شرط التحديد مستضد، نظم aAPC غالباً ما تتحمل جسم [مونوكلونل] ناهضة ضد مستقبلات CD3، الذي يحفز المجمع تكر نونسبيسيفيكالي. المؤتلف أشكال MHC، لا سيما مولتيميرس MHC، استخدمت أيضا على سطح آبك لتوفير خصوصية مستضد2،3. هو إشارة 2 إشارة كوستيمولاتوري أن يوجه نشاط الخلايا T. توفير كوستيموليشن اللازمة لتنشيط الخلية T، هو حفز مستقبلات CD28 عموما مع جسم ناهضة عرضت على السطح آبك، على الرغم من أن مستقبلات كوستيمولاتوري أخرى مثل 4-1BB كانت مستهدفة بنجاح4. يتم عادة المعطل تداولها البروتينات إشارة 1 و 2 على سطح جسيمات صلبة توليف آبك. تاريخيا، وقد كانت ملفقة aAPC من مجموعة متنوعة من المواد، بما في ذلك البوليستيرين4،5 والحديد ديكستران6. استخدام أحدث أنظمة البوليمرات القابلة للتحلل الحيوي مثل بولي (حمض اللبن-co-الجليكوليك) (بلجا) لتوليد آبك التي يمكن بسهولة إضافة إلى إشارة البروتينات وهي مناسبة للإدارة المباشرة في فيفو، ويمكن تسهيل الإفراج عن المطرد تغليف السيتوكينات أو العوامل القابلة للذوبان لزيادة تنشيط الخلية تي7،8.

بالإضافة إلى وجود بروتينات الإشارات الضرورية، مشاركة مستقبلات على مساحة كبيرة بما فيه الكفاية خلال التفاعل خلية آبك/T ضروري لتنشيط الخلية T. وهكذا، البارامترات الفيزيائية ل aAPC مثل الحجم والشكل جذريا يغير مجال الاتصال المتاحة ويؤثر على قدرتها على حفز خلايا تي. أظهرت aAPC ميكرون الحجم لتكون أكثر فعالية في تحفيز خلايا تي من9،النظراء النانو على10. ومع ذلك، يمكن أن يكون نانو-آبك بيوديستريبوشن متفوقة وأفضل الصرف إلى الغدد الليمفاوية التي يمكن أن تعزز بها الأداء في فيفو أكثر من الصغرى-آبك11. الشكل متغير آخر للفائدة في النظم المستندة إلى الجسيمات آبك. مؤخرا أظهرت aAPC متباين يكون أكثر فعالية من الجسيمات الخواص في تحفيز خلايا تي، يرجع ذلك أساسا إلى تعزيز التفاعل مع الخلايا الهدف مقترنا مع الخلية غير محددة انخفاض الإقبال. ربط خلايا تفضيلي المحور الطويل للجسيمات ارتفاعات، وأكبر نصف قطر انحناء سطح تملق والسماح لمزيد من الاتصال بين أعبك وخلية T12. كما يثبط المحور الطويل للجسيمات ارتفاعات البلعمه، أسفر عن وقت التداول زيادة مقارنة بجسيمات كروية بعد في فيفو الإدارة12،13. وبسبب هذه المزايا، التوسط الجسيمات ارتفاعات أكبر توسع محددة مستضد تي الخلايا في المختبر و في فيفو مقارنة بجسيمات كروية، لاحظ تأثير في الجزئي ونانوسكاليس12، 13. وهناك استراتيجيات مختلفة لاختلاق الجسيمات متباين، ولكن تمتد غشاء رقيق أسلوب بسيط ومقبول على نطاق واسع تستخدم لتوليد مجموعة من الجسيمات المتنوعة الأشكال14. بعد التوليف، ويلقي في الأفلام الجسيمات وامتدت في أبعاد واحد أو اثنين في درجة حرارة فوق درجة حرارة التحول الزجاجي للمواد الجسيمات. ثم يتم حل الفيلم لاسترداد الجسيمات. وعلى الرغم من تزايد الاهتمام في جزيئات متباين، النهج الحالي لتصنيع آبك على أساس الجسيمات في معظمها تقتصر على نظم الخواص، وأساليب تغيير الشكل الجسيمات يمكن أن تكون صعبة التنفيذ، غير متوافقة مع بعض التوليف aAPC استراتيجيات، والافتقار إلى الدقة وإمكانية تكرار نتائج15. لدينا تقنية تمتد من غشاء رقيق يمكن تنفيذها يدوياً أو بطريقة إليه لسرعة توليد متباين الجزيئات توليفها من مجموعة متنوعة من البوليمرات القابلة للتحلل الحيوي، امتدت إلى نسبة العرض إلى الارتفاع المطلوب في واحد أو اثنين من أبعاد15.

يستند عملنا السابق، قمنا بتطوير نهج قائم على الجسيمات القابلة للتحلل الحيوي جنبا إلى جنب مع تقنية تمتد غشاء رقيق تحجيم سرعة توليد aAPC مع الانضباطي الحجم والشكل بطريقة موحدة للخلية T التوسع السابقين فيفو أو في فيفو. يمكن استخدام استراتيجيتنا تصريف البروتين لزوجين protein(s) أي اهتمام لمجموعات الكربوكسيل على سطح الجسيمات في كثافة المرجوة، يعطي هذا النظام آبك بدرجة عالية من المرونة. كما يصف لنا طرق لوصف حجم ومورفولوجيا، والمحتوى من آبك سطح البروتين، وتقييم تلك الوظائف في المختبر. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لتوسيع نطاق الخلايا المناعية السابقين فيفو أو في فيفو لمجموعة متنوعة من التطبيقات إيمونوثيرابيوتيك.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة جون هوبكنز.

1-تصنيع جسيمات كروية بلجا لحجم الانضباطي

  1. إعداد مواد تخليق الجسيمات
    1. إعداد 5% w/w البولي فينيل الكحول (PVA) الحل.
      1. إضافة 500 مل مياه (DI) إلى قارورة Erlenmeyer مع شريط إثارة مغناطيسية ووضع على صفيحة محرض في درجة حرارة 500 لفة في الدقيقة ومراقبة مع الحرارة. غطاء قارورة مع ورق ألمونيوم لمنع التبخر.
      2. عندما تصل درجة حرارة المياه إلى حوالي 70 درجة مئوية، إضافة إجمالي 25 جرام من بولي في دفعات صغيرة مع مرور الوقت، في انتظار بولي حل قبل إضافة المزيد.
      3. حالما يتم حل جميع بولي (عادة 30-60 دقيقة)، تتيح حل تصفية بارد وعقيمة. تخزين في 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل.
    2. إعداد الفيلم يلقي الحل من 10% w/w بولي ووالغليسيرول w/w 2%.
      1. إضافة 500 مل مياه دي قارورة Erlenmeyer مع شريط إثارة مغناطيسية. إضافة 8 مل الجلسرين في درجة حرارة الغرفة ومزيج من تريتوريشن.
      2. ضع قارورة على صفيحة محرض في درجة حرارة 500 لفة في الدقيقة ومراقبة مع الحرارة. غطاء قارورة مع ورق ألمونيوم لمنع التبخر.
      3. عندما حل درجة حرارة تصل إلى حوالي 70 درجة مئوية، إضافة إجمالي 50 جرام من بولي في دفعات صغيرة مع مرور الوقت، في انتظار بولي حل قبل إضافة المزيد.
      4. حالما يتم حل جميع بولي (عادة 60 دقيقة)، تتيح حل بارد والعقيمة تصفية باستخدام نظام تصفية فراغ أعلى زجاجة مع حجم مسام 0.22 ميكرومتر. تخزين في درجة حرارة الغرفة لاستخدامها في المستقبل.
    3. تعد حلاً بولي 50 مل 1% w/w. إضافة 40 مل من المياه دي و 10 مل من 5% بولي الحل (صنع في 1.1.1) كوب 100-150 مل.
    4. تعد حلاً بولي 100 مل 0.5% w/w. إضافة 90 مل من المياه دي و 10 مل من محلول بولي 5% إلى كوب 150-250 مل.
    5. إضافة شريط إثارة مغناطيسية إلى 0.5% بولي الحل والمكان في غطاء كيميائية على لوحة ضجة في درجة حرارة الغرفة 500 لفة في الدقيقة.
  2. يمثل التوليف
    1. وزنها إلى 100 مغ بولي (حمض اللبن-co-الجليكوليك) (بلجا) إلى القنينة التﻷلؤ وتذوب في 5 مل الميثان (DCM). دوامة بلجا حل.
    2. ضع الخالطون في الحل بولي 1% 50 مل حيث الخالطون أقرب إلى الجزء السفلي من الكأس ممكن دون لمسها. قم بتشغيل الخالطون وضبط بالسرعة المرجوة – دورة في الدقيقة 3,200 عن 5 ميكرومترات قطرها الجسيمات، 5,000 لفة في الدقيقة ل 3 ميكرومتر، 15000 لفة في الدقيقة ل 1 ميكرومتر (زيادة تجانس سرعة انخفاض حجم الجسيمات). مرة واحدة في السرعة المرجوة، إضافة حل بلجا للكأس ومجانسة لمدة 1 دقيقة.
    3. بعد التجانس، من أجل 1 ٪ بولي، بلجا يمثل الحل إلى الحل بولي 0.5% 100 مل على لوحة ضجة وآثاره لمدة 4 ساعات على الأقل لتبخر المذيبات في غطاء كيميائية.
    4. أغسل الجسيمات 3 مرات في المياه دي.
      1. صب الحل الجسيمات في أنابيب مخروطية 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 3000 x ز لمدة 5 دقائق. صب المادة طافية وإضافة حوالي 20 مل مياه دي.
      2. ريسوسبيند الجسيمات فورتيكسينج. وبمجرد حراكه، تملأ الأنابيب المخروطية إلى 50 مل مع المياه دي.
      3. أغسل مرة أخرى بنفس الطريقة مرتين أخريين.
  3. توليف نانوحبيبات
    1. تزن بملغ 200 من بلجا إلى قنينة التﻷلؤ وتذوب في 5 مل DCM. دوامة بلجا حل.
    2. ضع كوب مع محلول بولي 1% 50 مل في حاوية مليئة بالجليد. مكان التحقيق سونيكاتور في الكأس مقربة من أسفل قدر الإمكان دون لمس. تبدأ sonication وإضافة حل بلجا فورا إلى الكأس. Sonicate بقوة 12 ث لمدة دقيقتين لتوليد جسيمات نانوية مع قطرها تقريبي من 200 نانومتر.
    3. وبعد سونيكيشن، من أجل 1 ٪ بولي، بلجا نانوحبيبات الحل إلى حل بولي 0.5% 100 مل على لوحة ضجة وآثاره لمدة 4 ساعات على الأقل لتبخر المذيبات في غطاء كيميائية.
    4. من أجل الحل الجسيمات في أنابيب مخروطية 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 3,000 س ز لمدة 5 دقائق لإزالة المجهرية الدقيقة. إزالة المادة طافية وتصب في أنابيب الطرد المركزي عالية السرعة.
    5. أغسل الجسيمات 3 مرات مع المياه دي. الطرد المركزي في 40,000 س ز لمدة 15 دقيقة. صب المادة طافية وريسوسبيند في المياه دي قبل فورتيكسينج. أغسل مرة أخرى بنفس الطريقة مرتين أخريين.

2-تصنيع جزيئات البوليمر للشكل الانضباطي

  1. بعد الغسيل بلجا جسيمات ريسوسبيند ثلاث مرات، الجسيمات في حوالي 1 مل مياه دي. إضافة حل الصب الفيلم إلى جزيئات لتركيز الجسيمات النهائية للجسيمات 2.5 ملغ/مل.
  2. "الماصة؛" تعليق الجسيمات في مختبرين مل 10 إلى 75 × 50 مم أطباق بيتري مستطيلة تمتد أحادي البعد أو في مختبرين 15 مل في أطباق بتري مربعة 100 × 100 ملم لتمتد ثنائي الأبعاد. إزالة فقاعات ماصة أما أو فقاعات دفع إلى الجانب وترك الأفلام الجافة بين عشية وضحاها في غطاء كيميائية.
  3. أفلام مرة واحدة قد جفت وإزالة الأفلام من البلاستيك الأطباق بملاقط وقطع الحواف من الأفلام مع المقص. حفظ الحواف في أنبوب 50 مل مخروطية لاستخدامها كجسيمات كروية.
    1. تحميل فيلم على رقيقة الآلي تمتد الجهاز قبل تركيب فيلم على كتل الألومنيوم. لتمتد د 1، جبل الفيلم على كتل الألومنيوم من محور واحد من نقالة (الشكل 2) عن طريق وضع اثنين حواف قصيرة للفيلم ما بين قطعتين من مطاط النيوبرين. استخدام مفتاح ألن، المسمار قبضة معدنية على رأس مطاطية لعقد الفيلم في المكان. لتمتد 2D، جبل كافة الحواف الأربع على أربع كتل الألومنيوم لتمتد على كلا محاور (الشكل 2).
    2. قياس وتسجيل طول الفيلم ما بين كتل الألومنيوم في محور واحد لتمتد د 1 أو كل محاور لتمتد 2D. حساب المسافة المطلوبة على امتداد الفيلم في اتجاه واحد أو اثنين استناداً إلى امتداد إضعاف المطلوب.
    3. ضع الجهاز تمتد تحميل الفيلم في فرن عند 90 درجة مئوية وجلب الفيلم لدرجة حرارة أكثر من 10 دقائق. ضع كوب كبيرة في الفرن مع كمية صغيرة من الماء.
    4. تمتد الفيلم.
    5. عندما يتم الانتهاء من التمدد، إزالة الجهاز تمتد من الفرن والسماح لتبرد الفيلم إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
    6. لتمتد د 1، قص الفيلم خارج الجهاز تمتد عند الحواف. لتمتد 2D، قص وحفظ مركز مربعة من الفيلم الذي صورة موحدة تمتد على كلا محاور. ضع الأفلام في أنابيب مخروطية الشكل مع الأفلام 2 كل أنبوب وتجاهل بقية الفيلم.
    7. إضافة حوالي 25 مل مياه دي كل الأنبوبة المخروطية ودوامه حتى يتم حل هذه الأفلام.
    8. حالما يتم حل الأفلام، يغسل الجسيمات 3 مرات مع المياه دي.
      1. المجهرية الدقيقة، تملأ الأنابيب المخروطية إلى 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 3000 x ز لمدة 5 دقائق، وصب المادة طافية، إضافة حوالي 20 مل من المياه دي، ودوامه الجسيمات ريسوسبيند.
      2. لجسيمات نانوية، جسيمات نقل أنابيب الطرد المركزي عالية السرعة وأجهزة الطرد المركزي في س 40,000 ز لمدة 15 دقيقة، صب المادة طافية، إضافة حوالي 20 مل من المياه دي، ودوامه الجسيمات ريسوسبيند.
    9. بعد الغسيل الثالث، ريسوسبيند الجسيمات في حوالي 1 مل مياه دي. تسجيل وزن أنبوب ميكروسينتريفوجي وإضافة جسيمات إلى الأنبوب. تجميد الجزيئات في ثلاجة-80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة أو تجميد فلاش في نيتروجين سائل. بمجرد تجميد، ليوفيليزي الجزيئات بين عشية وضحاها.
    10. مرة واحدة المجففة بالتبريد، وزن جزيئات في أنبوب ميكروسينتريفوجي وطرح مسجل وزن الأنبوبة الفارغة لتحديد وزن جزيئات المجففة بالتبريد.

3-تصريف البروتين السطحية لإنشاء اصطناعية مستضد تقديم الخلايا

  1. تحضير 2-(ن-Morpholino) اثانيسولفونيك الحمضية (MES) المخزن المؤقت. جعل حل م 0.1 من مس في المياه وضبط درجة الحموضة إلى 6.0 بالمعايرة مع هيدروكسيد الصوديوم 1 م (هيدروكسيد الصوديوم).
  2. ريسوسبيند المجففة بالتبريد الجزئي بلجا/بب/جسيمات نانوية في 20 ميكروغرام/مل في مس المخزن المؤقت قبل فورتيكسينج. ملء أنبوب ميكروسينتريفوجي البولي بروبيلين مع ميكروليتر 900 مس المخزن المؤقت وإضافة 100 ميكروليتر من الحل الجسيمات للأنبوب.
  3. إعداد حل مؤسسة/دائرة الصحة الوطنية. حل 40 مغ 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) كاربودييميدي (EDC) و 48 ملغ N-هيدروكسيسولفوكسوكسينيميدي (NHS) في 1 مل مس المخزن المؤقت.
  4. إضافة 100 ميكروليتر تنمية الصادرات/دائرة الصحة الوطنية حل للجسيمات ودوامه لمزيج.
  5. احتضان الأنبوب في العاكس في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  6. تدور أسفل المجهرية الدقيقة في 5,000 س ز لمدة 5 دقائق، أو جسيمات نانوية في 17,000 س ز لمدة 5 دقائق. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند في 1 مل برنامج تلفزيوني فورتيكسينج (المجهرية الدقيقة) أو سونيكاتينج في 2-3 ث لمدة 5 ثوان (nanoparticles).
  7. المجهرية الدقيقة، إضافة 8 ميكروغرام من البروتين المطلوب إشارة 1، و 10 ميكروغرام لمكافحة الفأر CD28 (استنساخ 37.51) للجسيمات. لجسيمات نانوية، إضافة 16 ميكروغرام إشارة 1 و 20 ميكروغرام المضادة الماوس CD28. إضافة برنامج تلفزيوني إحضار وحدة التخزين في الأنبوب إلى 1.1 مل.
  8. احتضان الأنبوب في العاكس عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  9. وفي اليوم التالي يغسل الجسيمات. تدور أسفل المجهرية الدقيقة في 5,000 س ز لمدة 5 دقائق، أو جسيمات نانوية في 17,000 س ز لمدة 5 دقائق. تجاهل المادة طافية، وريسوسبيند الجسيمات في 1 مل PBS العقيمة التي فورتيكسينج (المجهرية الدقيقة) أو سونيكيشن في 2-3 ث لمدة 5 ثوان (nanoparticles). كرر مرتين.
  10. ريسوسبيند الجسيمات في التركيز المطلوب في الثقافة المتوسطة للاستخدام الفوري. للتخزين على المدى الطويل، ريسوسبيند الجسيمات في 10 ملغ/مل في محلول سكروز 100 مم. تجميد، ليوفيليزي، وتخزين الجسيمات في-80 درجة مئوية.

4-توصيف وتقييم آبك

  1. وصف آبك الحجم والشكل (الشكل 3)
    1. وصف الشكل والحجم يمثل بالتصوير الجسيمات باستخدام المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM). لوزارة شؤون المرأة تلتزم الجسيمات المجففة بالتبريد التصوير، وانتشرت على الشريط الكربون ألومنيوم تك وتفل معطف مع البلاديوم الذهب.
    2. تحليل حجم ونسبة العرض إلى الارتفاع للجسيمات باستخدام برمجيات تحليل الصورة.
    3. لتحديد حجم الجسيمات، تعيين مقياس استخدام مقياس بار وقياس قطر الجسيمات. كرر للجسيمات حوالي 100 تحديد قطر متوسط من الجسيمات وإنشاء مدرج تكراري لأحجام الجسيمات.
    4. لتحديد نسبة العرض إلى الارتفاع، وقياس المسافة عبر المحور الطويل والمحور قصيرة من الجسيمات وتقسيم المحور الطويل بالمحور قصيرة. كرر للجسيمات حوالي 50 من كل شكل لتحديد نسبة العرض إلى الارتفاع المتوسط الجسيمات لكل شكل وتوليد الرسوم البيانية.
    5. وصف الشكل والحجم نانوحبيبات بالتصوير الجسيمات باستخدام مجهر إلكتروني (TEM). تحليل حجم ونسبة العرض إلى الارتفاع للجسيمات النانوية باستخدام برنامج تحليل الصور كما هو موضح في 5.1.2. بدلاً من ذلك، قياس حجم نانوحبيبات كروية استخدام تشتت الضوء الحيوي (DLS) أو نانوحبيبات تتبع تحليل (NTA).
  2. كفاءة تصريف البروتين
    1. إعداد أعبك وفقا لأساليب 1-3، ولكن في "الخطوة 3، 7" استخدام البروتين المسمى فلوريسسينتلي إشارة 1 و CD28 المضادة الماوس. بعد الاقتران والغسيل، ريسوسبيند آبك في 1 مل برنامج تلفزيوني لتركيز نهائي آبك 2 ملغ/مل.
    2. إعداد مستويات البروتين في ميكروسكوبية 96-جيدا أسود البوليستيرين. إضافة 5 ميكروغرام من البروتين المسمى فلوريسسينتلي إشارة 1 لبرنامج تلفزيوني في البئر الأولى اللوحة وجعل تخفيف 1:2 10 في برنامج تلفزيوني عبر الصف الخاص باللوحة. ترك فارغاً جيدا آخر. كرر هذه الخطوة لإنشاء مجموعة أخرى من المعايير مع CD28 مكافحة المسمى فلوريسسينتلي.
    3. "الماصة؛" 100 ميكروليتر من الحل آبك في آبار نسخ متماثل من الميكروسكوبية البوليستيرين الأسود في ثلاث نسخ.
    4. قراءة الأسفار على قارئ لوحة fluorescence في الأطوال الموجية المناسبة. استخدام قراءات الأسفار من مستويات البروتين لتوليد المنحنيات القياسية لكل جسم الفلورسنت. استخدام المنحنى القياسي، حساب تركيزات إشارة 1 ومكافحة-CD28 في كل بئر عينة، وثم حساب مقدار البروتين السطحي وكفاءة التصريف (الشكل 4 أ، الشكل 5A).
  3. تقييم آبك للتحفيز في المختبر من خلايا CD8 + "تي"
    1. تعد وسائل الإعلام ب (ربمي المتوسطة وتستكمل مع الجلوتامين لام، 10% FBS، حل من الأحماض الأمينية الأساسية عدم 1%، بيروفات صوديوم 1%، 1% فيتامين MEM الحل، 92 ميكرومترات β-mercaptoethanol و 10 نانوغرام/مل السيبروفلوكساسين 30 U/mL إيل-2.
    2. التضحية بماوس 6 الأسود عبر التعرض لغاز ثاني أكسيد الكربون.
    3. حصاد الطحال من الماوس وفقا لبروتوكول المحددة سابقا16. جمع الطحال في أنبوب 50 مل مخروطية مع 10-15 مل برنامج تلفزيوني. استخدام مدقة، الهريس الطحال من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. خلال جرش، غسل المصفاة مع 40 مل برنامج تلفزيوني.
    4. تدور سبلينوسيتيس في 300 x ز لمدة 5 دقائق. من أجل إيقاف المادة طافية وريسوسبيند في سبلينوسيتيس في 4 مل من Ack ليسينج المخزن المؤقت خلايا الدم الحمراء. يسمح الأنبوب للجلوس دون عائق لمدة 1 دقيقة، ثم إضافة برنامج تلفزيوني إحضار وحدة التخزين في الأنبوبة إلى 20 مل.
    5. تدور الخلايا في 300 x ز لمدة 5 دقائق. من أجل إيقاف المادة طافية وريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من برنامج تلفزيوني. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
    6. وتدور الخلايا في 300 x ز لمدة 5 دقائق ريسوسبيند في حجم الخلية فصل المخزن المؤقت المطلوب. عزل خلايا CD8 + "تي" من تعليق خلية مفردة باستخدام CD8 + سلبية تشكيلة طقم عزل خلية T، يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    7. بعد فصل المغناطيسية، تدور خلايا CD8 + "تي" في 300 x غ لمدة خمس دقائق وإزالة المخزن المؤقت فصل الخلية. ريسوسبيند الخلايا في 1 مل من برنامج تلفزيوني وحساب الخلايا. قم بتسمية الخلايا مع إستر سوكسينيل كاربوكسيفلوريسسين (CFSE) وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    8. احتضان 8,333 خلايا CD8 + "تي" وملغ 0.0833 (أو الجرعة المطلوبة) من آبك في وسائل الإعلام ب 150 ميكروليتر في كل بئر من 96 جيدا U-المعالجة بزراعة الأنسجة لوحة أسفل.
    9. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام. بعد 3-4 أيام، تحديث المتوسط الثقافة عن طريق إضافة 75 ميكروليتر الطازجة المتوسطة لكل بئر.
    10. بعد 3 أيام حضانة، تحليل كفسي المسمى الخلايا في سيتوميتير تدفق لتقييم انتشار. يمثل كل ذروة في الرسم البياني التدفق الخلوي كفسي جيل خلايا بسبب تمييع كفسي مع كل انقسام الخلايا المتتابعة.
    11. بعد 7 أيام، استخدام هيموسيتوميتير لحساب عدد الخلايا في كل بئر. قبل العد، وصمة عار الخلايا الميتة مع حل تريبان الأزرق. استبعاد الخلايا الميتة من التهم الخلية الأخيرة. تطبيع تركيز الخلية النهائية إلى تركز الأولى حساب إضعاف-التوسع في(الشكل 4 و الشكل 5).

النتائج

ويرد في الشكل 1تخطيطي للألى 2D رقيقة تمتد الجهاز. ويرد في هو et al.17 نقالة يتكون من أجزاء الألومنيوم استخدام التفريز القياسية وتقنيات القطع التخطيطي، ووصف لطبقة رقيقة 1 د تمتد الجهاز. مماثلة على نقالة د 1، نقالة 2D يتكون من قبضة معدنية والقضبان دلي?...

Discussion

تفاصيل هذا البروتوكول وسيلة مرنة لتوليد جزيئات البوليمر متباين دقيقة. رقيقة تمتد التقنية المذكورة هنا قابلة للتطوير وعالية استنساخه وغير مكلفة. تقنيات بديلة لتوليد جزيئات متباين يعاني من قيود كثيرة، بما في ذلك تكلفة عالية ومنخفضة الإنتاجية، وحجم الجسيمات محدودة. رقيقة تمتد النهج هو أيض?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ما عدا (DGE-1746891) وكر (DGE-1232825) شكرا برنامج "زمالة بحوث الدراسات العليا جبهة الخلاص الوطني" للدعم. ذاكرة الوصول العشوائي وذلك بفضل الوطنية البحوث جائزة المعاهد الوطنية للصحة خدمة F31 NCI (F31CA214147) و "مكافآت الإنجاز" "زمالة علماء الكلية" للدعم. يشكر المؤلفون المعاهد الوطنية للصحة (R01EB016721 و R01CA195503)، والبحوث لمنع العمى جيمس وجائزة محفز حرة كارول، ومعهد "السرطان العلاج المناعي" لدعم بلومبرغ-كيميل الرهبان.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzedPolysciences, Inc.02975-500
GlycerolSigma-AldrichG9012
Digital ThermometerFlukeN/AModel name: Fluke 52 II
Immersion Temperature ProbeFlukeN/AModel name: Fluke 80PK 22
Digital Hotplate & StirrerBenchmark ScientificH3760-HS
Multipoint stirrerThermo Fisher Scientific50093538
Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide)Sigma-Aldrich719900
DichloromethaneSigma-AldrichD65100
HomogenizerIKA 0003725001
SonicatorSonics & Materials, Inc.N/AModel number: VC 505
Sonicator sound abating enclosureSonics & Materials, Inc.N/APart number: 630-0427
Sonicator probeSonics & Materials, Inc.N/APart number: 630-0220
Sonicator microtipSonics & Materials, Inc.N/APart number: 630-0423
High speed centrifugeBeckman CoulterN/AModel number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP
High speed centrifuge rotorBeckman Coulter369691Model number: JA-17
High speed polycarbonate centrifuge tubesThermo Fisher Scientific3118-005050 mL, screw cap
Rectangular disposable petri dishVWR International25384-32275 x 50 x 10 mm
Square disposable petri dishVWR International10799-140100 mm x 100 mm
LEAF Purified anti-mouse CD3ε AntibodyBiolegend100314
InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51Bio X CellBE0015-1
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochlorideSigma-AldrichE6383
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium saltSigma-Aldrich56485
MESSigma-AldrichM3671
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 AntibodyBiolegend100212
APC anti-mouse CD28 AntibodyBiolegend102109
Corning 96 Well Solid Polystyrene MicroplateSigma-AldrichCLS3915flat bottom, black polystyrene
Protein LoBind Tubes, 1.5 mLEppendorf22431081
RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine)ThermoFisher Scientific11875093
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF4135Heat Inactivated, sterile-filtered
CiprofloxacinSigma-Aldrich17850
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
Recombinant Human IL-2 (carrier-free)Biolegend589102
Sodium Pyruvate (100 mM)ThermoFisher Scientific11360070
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)ThermoFisher Scientific11140050
MEM Vitamin Solution (100X)ThermoFisher Scientific11120052
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouseMiltenyi Biotech130-104-075
CellTrace CFSE Cell Proliferation KitThermoFisher ScientificC34554
LS ColumnsMiltenyi Biotech130-042-401
MidiMACS SeparatorMiltenyi Biotech130-042-302
MACS MultistandMiltenyi Biotech130-042-303
Flow CytometerAccuri C6
Synergy 2 Multi-Detection Microplate ReaderBioTek
autoMACS Running BufferMiltenyi BIotech130-091-221
Cell StrainerThermoFisher Scientific22363548Sterile, 70 µm nylon mesh
ACK Lysing BufferThermoFisher ScientificA1049201
C57BL/6J (Black 6) MouseThe Jackson Laboratory000664Male, at least 7 weeks old
U-Bottom Tissue Culture PlatesVWR353227Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates
40 V DC Power SupplyProbotixLPSK-4010
PTFE Coated WireMouser602-5858-100-01This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work
Stepper Motor DriverProbotixMondoStep5.6
IDC Connector KitProbotixIDCM-10-12
MicrocontrollerProbotixPBX-RF
4A FusesRadio Shack2701026Equivalent fuses will work as well
DB25 Male to Male CableProbotixDB25-6
USB-A to USB-B CableStaples2094915Equivalent cable will work as well
8-Pin Amphenol Connectors Male and FemaleMouser654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S
Stepper MotorProbotixHT23-420-8
Right Hand Lead ScrewRoton60722
Left Hand Lead ScrewRoton60723
ScrewsMcMaster Carr92196A151
Neoprene RubberMcMaster Carr8698K51
Right Handed Flanged Lead NutRoton91962
Left Handed Flanged Lead NutRoton91963
Linux Control ComputerProbotixLCNC-PCAny computer with matching specification and Linux operating system will work
Corning bottle-top vacuum filter systemSigma-AldrichCLS431097
Trypan Blue Solution, 0.4 %ThermoFisher Scientific15250061

References

  1. Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).
  2. Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells. Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).
  3. Oelke, M., et al. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).
  4. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).
  5. Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins. Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).
  6. Perica, K., et al. Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity. ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).
  7. Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response. The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).
  8. Zhang, L., et al. Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).
  9. Mescher, M. F. Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes. The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).
  10. Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells. Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).
  11. Fifis, T., et al. Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors. The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).
  12. Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells. Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).
  13. Meyer, R. A., et al. Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation. Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).
  14. Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).
  15. Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).
  16. Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles. Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).
  17. Shum, H. C., et al. Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles. Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).
  18. Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device. Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).
  19. Yang, S., et al. Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications. Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).
  20. Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly. Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).
  21. Jang, S. G., et al. Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers. Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).
  22. Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers. Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).
  23. Rolland, J. P., et al. Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials. Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).
  24. Meyer, R. A., et al. Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation. Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved