التدفق متعدد الألوان المستندة إلى الخلوي الكمي الميتوكوندريا وليسوسوميس في خلايا تي

Chin-Wen Wei; Tyng-An Zhou; Ivan L. Dzhagalov; Chia-Lin Hsu

doi:10.3791/58844

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

توضح هذه المقالة طريقة قوية تحديد حجم الميتوكوندريا أو ليسوسوميس في الخلايا الحية. مزيج الأصباغ يحلول أو الميتوكوندريا محددة مع الأجسام المضادة مترافق فلوريسسينتلي ضد علامات السطح يسمح التحديد الكمي لهذه العضيات في الخلايا المختلطة السكان، مثل الخلايا الابتدائية تحصد من عينات الأنسجة، باستخدام قياس التدفق متعدد الألوان.

Abstract

خلايا T الاستفادة من البرامج الأيضية المختلفة لتتناسب مع احتياجاتها الوظيفية خلال التمايز وانتشارها. الميتوكوندريا عناصر حاسمة الخلوية المسؤولة عن إمداد الطاقة الخلية؛ ومع ذلك، تنتج الميتوكوندريا الزائدة أيضا أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) التي يمكن أن تتسبب في موت الخلايا. ولذلك، يجب تعديل عدد الميتوكوندريا باستمرار لتناسب احتياجات الخلايا. ويتحقق هذا التنظيم الحيوي في الجزء من خلال وظيفة lysosomes إزالة الفائض/تلف العضيات والجزيئات. ومن ثم، محتويات mitochondrial وتعويض الخلوية مؤشرات أساسية لتقييم التكيف الأيضي للخلايا. مع تطور التحقيقات العضيات، يحلول تتسم جيدا أو الأصباغ الميتوكوندريا على حدة قد أصبحت متاحة في أشكال مختلفة لتسمية lysosomes الخلوية والميتوكوندريا. قياس التدفق متعدد الألوان هي أداة مشتركة لتعمل الخلية الشخصية، ولديها القدرة على أن تكون متكاملة مع فحوصات أخرى. نقدم هنا، على بروتوكول مفصلة لكيفية الجمع بين الأصباغ عضية على حدة مع السطح علامات تلطيخ لقياس مقدار lysosomes والميتوكوندريا في السكان مختلفة تي خلية على سيتوميتير تدفق.

Introduction

التنشيط وتكاثر الخلايا T خطوات حاسمة لتركيب الاستجابات المناعية ناجحة. التقدم الذي أحرز مؤخرا تشير إلى أن الأيض الخلوية يرتبط محكم مع كل من التنمية ووظائف خلايا تي. على سبيل المثال، خلايا السذاجة تي تعتمد إلى حد كبير على الفسفرة (أوكسفوس) لتلبية الطلب على الطاقة خلال تداولها فيما بين الأجهزة اللمفاوية الثانوية. عند التنشيط، الخضوع السذاجة تي خلايا جذرية الأيضية إعادة البرمجة، بما في ذلك تنظيم دورات تعريفية لتحلل الهوائية لزيادة إنتاج ATP والوفاء بمطالب الأيضية هائلة خلال تمايز الخلايا وانتشارها. الخلايا التي لا تتبع من خلال احتياجات الأيضية يموت قبل المبرمج¹^،². أثناء إعادة برمجة التمثيل الغذائي، الميتوكوندريا دوراً هاما نظراً لأنهم العضيات مسؤولة إلى حد كبير عن إنتاج ATP إمداد الطاقة للخلية، ومحتوى الميتوكوندريا الخلوية يتقلب أثناء تبديل التمثيل الغذائي في جميع أنحاء تي خلية التنمية والتنشيط³. ومع ذلك، يمكن أن تنتج تراكم الميتوكوندريا زائدة عن الحاجة أو التالفة روس الزائدة التي تضر الدهون والبروتينات والحمض النووي، ويمكن أن تؤدي في نهاية المطاف إلى الخلية الموت⁴

تتم إزالة الميتوكوندريا المفرطة أو التالفة الناتجة عن التغيرات الاستقلابية بشكل متخصصة من أوتوفاجي⁵، المعروفة باسم ميتوفاجي. الميتوكوندريا هي ملفوفة أوتوفاجوسوميس وتنصهر ثم مع lysosomes للتدهور. إغلاق هذه الاتصالات بين الميتوكوندريا و lysosomes أثارت اهتمام كبير⁶^،⁷. على سبيل المثال، يحفز الأكسدة الميتوكوندريا شكل حويصلات المستمدة من الميتوكوندريا (مدفس) التي تستهدف lysosomes للتدهور في homolog الفوسفاتيز وتنزين (فتن)-التي يسببها كيناز المفترضة 1 (PINK1) وباركين (E3 ubiquitin ليجاسى) تعتمد طريقة⁸. ووجد أيضا أن ميتوفاجي أمر ضروري للانتقال adipocyte بيج إلى الأبيض⁹^،¹⁰. الأهم من ذلك، ليسوسوميس ليست مجرد حجرة تدهور، ولكن أيضا منظم للإشارات الخلوية. تراكم الركازة المفرطة الناجمة عن نقص إنزيم ينتج خلل الليزوزومية بتعطيل نفاذية غشاء الليزوزومية ويؤثر على Ca^{2 +} التوازن¹¹. خلية T العيوب الفنية في lipase حمض الليزوزومية (ال)¹² أو المستقلب الليزوزومية الناقل خروج المغلوب الماوس نموذج¹³ كما أظهرت أهمية lysosomes في الحفاظ على التوازن خلية تي. الميتوكوندريا و lysosomes جزء لا يتجزأ من تنظيم الأيض الخلوية. ولذلك كان قياس محتوى المتقدرية الخلوية هي مؤشر حاسم لتقييم وضع الخلية تي الأيضية والوظيفية.

وتشمل فحوصات استخداماً لقياس محتويات المتقدرية أو الليزوزومية الخلوية immunoblot والمجهر الإلكتروني وتلطيخ (إذا كان) إيمونوفلوريسسينت وتحليل PCR mitochondrial DNA نسخ الأرقام¹⁴^،¹⁵^، ¹⁶. بينما يمكن مقارنة immunoblot كمياً مستويات البروتين عبر عينات مختلفة والالكترون، أو إذا كان الفحص المجهري يمكن أن تصور المورفولوجية السمات المميزة لهذه العضيات¹⁷، هذه فحوصات تحمل بعض العيوب التقنية. على سبيل المثال، أنها تستغرق وقتاً طويلاً للحصول على عدد كاف من الصور خلية مع تضخم عالية والقرار أو لمقارنة مستويات البروتين التعبير عبر العشرات من عينات، مما يجعل هذه الاختبارات تعتبر أساليب إنتاجية منخفضة. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذه الاختبارات فقط للسكان خلية متجانسة، مثل خطوط الخلية، ولكن ليس لعينات الأنسجة التي تتكون من السكان مختلطة.

من الصعب أيضا أن تطبيق هذه الاختبارات على السكان النادرة، التي أرقام شرط الحد الأدنى من خلية من 10⁶ إلى 10⁸ من المستحيل أن تجتمع. وأخيراً، عادة تفكيك الخلايا أو ثابتة أثناء العملية، وجعلها متوافقة مع أساليب أخرى لاستخراج مزيد من المعلومات. مقارنة بالطرق التقليدية، قد فلوري-على أساس التدفق الخلوي إنتاجية عالية نسبيا-يمكن تحليل المعلومات من كافة الخلايا داخل عينة مؤلفة من الخلايا المختلطة السكان والتي جمعت في وقت واحد. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء الكشف عن أكثر من 10 معلمات في نفس الخلية وفرز الخلايا استناداً إلى تعمل المطلوب لفحوصات إضافية. وقد استخدمت لتسمية lysosomes والميتوكوندريا في الخلايا الحية المسابير الفلورسنت رد الفعل ويمكن الكشف عنها بواسطة التدفق الخلوي¹⁸^،¹⁹. هذه المجسات الخاصة عضية الخلية نفاذية والخصائص الفيزيائية-الكيميائية التي تسمح لهم بأن تتركز في أماكن محددة سوبسيلولار أو العضيات. مريح، تتوفر هذه التحقيقات في مختلف صيغ الفلورسنت، مما يمكن تطبيقها لتحليل متعدد الألوان.

هذا البروتوكول ويصف بالتفصيل كيفية الجمع بين سطح علامة التلوين بالأصباغ يحلول أو الميتوكوندريا محددة لتسمية lysosomes أو يعيش الميتوكوندريا في الخلايا. وهذا مفيد بشكل خاص لعينات المتولدة من الابتدائي الأنسجة والأعضاء، التي تتكون غالباً من سكان الخلية غير متجانسة. يمكن تحديد السكان خلية من اهتمام بتعبيرها ماركر السطحية الباحثين وعلى وجه التحديد قياس محتويات الليزوزومية أو الميتوكوندريا عن طريق الأصباغ عضية على حدة في هذه الخلايا. هنا، علينا أن نظهر الإجراءات المفصلة لتحليل تدفق سيتوميتريك أن يقيم كتلة الليزوزومية أو الميتوكوندريا في الجمهرات الفرعية الرئيسية الخلية تي الطحال.

Protocol

ماوس الأنسجة الحصاد الإجراء الموضح هنا قد أقرها "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة يانغ مينغ الوطنية.

1-إعداد تعليق اللمفاويات من الأجهزة اللمفاوية

Euthanize الماوس بطريقة معتمدة مثل استنشاق أول أكسيد الكربون₂ في دائرة اكريليك شفافة تليها التفكك عنق الرحم التأكد من الوفاة.
ملاحظة: الاحتفاظ بمعدل تدفق CO₂ لتشريد 20% في الدقيقة الواحدة من الدائرة، ولا يزيد عن 5 رطل/بوصة مربعة (رطل لكل بوصة مربعة). يستغرق 2-3 دقيقة لماوس ليفقد وعيه. الإبقاء على تدفق₂ CO على الأقل 1 دقيقة بعد توقف الحيوان في التنفس (5-7 دقيقة عموما).
ضع الماوس على ظهرها على متنها نظيفة (مثل لوحة بلاستيكية البوليستيرين) وإصلاح أطرافه مع الشريط. شطف مع الإيثانول 70%.
لحصاد الطحال، قص وفتح تجويف البطن مع مقص تشريح 11-سم (الطحال أسفل المعدة وفوق الكلية اليسرى). إزالة الطحال بالملقط ونظيفة من الأنسجة الضامة (استخدام المقص إذا لزم الأمر).
حصاد الغدة الصعترية، قطع الحجاب الحاجز والقفص الصدري من كلا الجانبين مع تشريح المقص. استخدام الملقط لرفع القص لتكشف عن كامل تجويف الصدر. فصل الغدة الصعترية بعناية من المحيطة الأنسجة مع مقص، وإزالة أي بقايا النسيج الضام على منشفة ورقية ترطب مع برنامج تلفزيوني.
ميكانيكيا ننأى بالانسجة مع المكبس حقنه في طبق 6-سم يحتوي على 5 مل المثلج نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني تستكمل مع 2% مصل بقرى الجنين (FBS) و 1 مم يدتا). نقل تعليق خلية واحدة إلى أنبوب 15 مل الطرد مركزي؛ أغسل الطبق 6-سم مع المخزن المؤقت الإضافي 2 مل نظام مراقبة الأصول الميدانية والجمع بين الغسيل مع تعليق خلية كذلك.
الطرد المركزي من تعليق خلية (300 x ز، لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية) وتجاهل المادة طافية. إعادة تعليق بيليه مع 2 مل من كلوريد الأمونيوم-البوتاسيوم (ACK) ليسينج المخزن المؤقت (155 ملم NH₄Cl، 10 مم كهكو₃ و 0.1 ملم Na₂يدتا) لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) خلايا الدم الحمراء. تحييد المخزن المؤقت ACK بإضافة 10 مل نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت إلى تعليق خلية.
الطرد المركزي من تعليق خلية (300 x ز، لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية) وتجاهل المادة طافية. تعليق إعادة الخلايا في 5 مل من إكمال ربمي المتوسطة (المتوسط RPMI 1640، تستكمل مع 44 مم ناكو₃، 10 ملم 4 حمض-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك (حبيس)، 100 يو/مليلتر البنسلين، ستربتوميسين 100 ملغ/مل، 2 مم L-الجلوتامين، بيروفات صوديوم 1 مم، الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM 1% و 10% FBS).
تعليق خلية التصفية من خلال مصفاة خلية (المسام حجم 70 ميكرومتر) لإزالة كتل الخلية. حساب عدد الخلايا مع هيموسيتوميتير أو العداد الآلي الخلية.

2-التحديد الكمي الميتوكوندريا وليسوسوميس

ملاحظة: إجراء الصبغة الخاصة عضية تلطيخ أولاً لأن الشرط المصبوغة الأمثل لهذه الأصباغ الحضانة عند 37 درجة مئوية. تلطيخ العلامة السطحية يمكن إلى حد كبير تخفيض بسبب وضع سقف للأجسام المضادة والاستيعاب في أن درجة الحرارة.

إضافة 1 × 10⁶ خلايا الجولة-أسفل أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية والطرد المركزي خلايا (300 x ز، لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية) وتجاهل المادة طافية.
تمييع التحقيق والحلول الأسهم لتركيز العمل النهائي (100 نانومتر الأخضر ميتوتراكير أو ليسوتراكير الخضراء؛ من الآن فصاعدا صبغ الميتوكوندريا أو يحلول محددة، على التوالي) في المتوسطة ثقافة خالية من المصل قبل حرارة 37 درجة مئوية. وهذا حل عملي لصبغ يحلول أو الميتوكوندريا محددة.
ملاحظة: اختبار تركيزات متعددة بما في ذلك العامل التركيزات التي اقترحتها الشركة المصنعة (20-200 نانومتر لصبغ الميتوكوندريا على حدة) وشمال البحر الأبيض المتوسط 50-75 لصبغ يحلول المحددة المستخدمة هنا من أجل الحصول على أفضل تلطيخ الكفاءة. اختر عدد سكانها خلية ومن المعروف أن التعبير الجيد لتلطيخ المستهدفة (مثل ليسوسوميس) كمراقبة إيجابية (مثل CD14 البشرية⁺ وحيدات). اختر تركيز العمل استناداً إلى فصل جيدة بين السلبية والإيجابية تلطيخ، فضلا عن صلاحية خلية جيدة.
ريسوسبيند الخلايا في 100 ميليلتر من يحلول أو الميتوكوندريا محددة صبغ حل عملي واحتضان في 5% CO₂ حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أو 30 دقيقة، على التوالي.
أضف 1 مل من المثلج المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية لوقف رد الفعل. بيليه الخلايا بالطرد المركزي (300 x ز، لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية) وتجاهل المادة طافية. خلايا جاهزة الآن لتلطيخ العلامة السطحية.

3-السطحية علامة تلطيخ

مستقبلات Fc كتلة مع 100 ميليلتر من قبل معاير هيبريدوما 2.4G2 طافية على الجليد للخلايا الغسيل 10 دقيقة مع 1 مل من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية وأجهزة الطرد المركزي (300 x ز، لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية). تجاهل المادة طافية.
احتضان الخلايا مع 50 ميليلتر جسم مترافق fluorescence معاير قبل تركيبة في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية على الجليد لتجنب الضوء 20 دقيقة.
ملاحظة: إعداد الخلايا المفردة الملطخة بالألوان التي تشمل جميع الأجسام المضادة الفلورية الموجودة في جسم التعامل فقط مع صبغ عضية على حدة لتحديد الفولتية كل الأسفار الكاشف وتعويض التكيف على تدفق تركيبة والخلايا سيتوميتير. وبالمثل، يعد Fluorescence ناقص واحد (FMO) كعناصر أساسية باستخدام الخلايا الملون مع جميع الأجسام المضادة، ولكن دون تلطيخ مع الأصباغ عضية على حدة.
غسل الخلايا بإضافة 1 مل من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية وبيليه بالطرد المركزي (300 x ز، لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية). تجاهل المادة طافية.
ريسوسبيند الخلايا في 300 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت الذي يحتوي على يوديد propidium ميكروغرام/ملليلتر 1 (PI) وتحليل العينات في تدفق سيتوميتير فورا.

4-نموذج جمع في تدفق سيتوميتير

قم بتشغيل الكمبيوتر وأي أجهزة أخرى التبعي اعتماداً على منصة آلة cytometer تدفق، البرامج اقتناء نظام مراقبة الأصول الميدانية. قم بتشغيل برنامج تلفزيوني لمدة حوالي 1 دقيقة لضمان خط تدفق مليء ببرنامج تلفزيوني وغمد المخزن المؤقت. تأكد من أن تدفق تيار يعمل بسلاسة.
فتح التجربة الجديدة وحدد المعلمات cytometer (الفلورية كاشفات) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تصفية الخلايا عن طريق مصفاة خلية 70 ميكرومتر ودوامه قبل الحصول على كل عينة لتجنب كتل ويبنوا تشكيل.
جعل المؤامرات دوت المبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC)، التي تمثل حجم الخلية والتفاصيل، على التوالي. تحسين الفولتية منتدى التعاون الأمني والتعاون بين بلدان الجنوب للتأكد من أن تظهر الخلايا ذات الاهتمام في المؤامرات. جعل المؤامرات دوت منتدى التعاون الأمني-أ مقابل منتدى التعاون الأمني-W (أو منتدى التعاون الأمني-H) ورسم بوابة للخلايا المفردة.
جعل دوت قطع كل معلمة الفلورسنت. استخدام خلايا أونستينيد لتحديد الإشارات الخلفية واستخدام عناصر تحكم مفردة الملطخة بالألوان لضبط الفولتية لكل معلمة الفلورسنت، حيث أن السكان خلية الإيجابية والسلبية يمكن تمييزها الواضح وداخل النطاق الديناميكي لاقتناء.
بعد أن يتم تعيين جميع الفولتية، استخدام السيارات-تعويض إذا كان متوفراً، أو يدوياً ضبط التعويض مع ضوابط ملطخة باللون أونستينيد وواحدة لتصحيح آثار الطيفية. تطبيق التعويض للعينات.
جعل مؤامرة نقطة لكل معلمة ورسم غيتس وفقا لمجموعة التجريبية الخاصة بك. على سبيل المثال، منتدى التعاون الأمني-أ مقابل منتدى التعاون الأمني-ح (أو منتدى التعاون الأمني-W) استبعاد doublets، تليها منتدى التعاون الأمني، مقابل SSC-أ اللمفاويات النابضة؛ بالتعاون بين بلدان الجنوب مقابل PI (الخلايا الحية) وخلايا CD4 مقابل CD8 (الشكل 1).
جمع ما يكفي الأحداث (عدد الخلايا الإجمالي) لمقارنة ذات مغزى بين السكان. عادة، تحتاج الأحداث 1,000 على الأقل في عدد سكان الفائدة الحصول على²⁰.
بعد أن يتم الحصول على جميع العينات، تصدير تدفق البيانات يتم تحليلها بواسطة برمجيات تحليل التدفق الخلوي. حفظ التجربة كقالب المحافظة على الإعداد سيتوميتير والمعلمات لتطبيق تجارب مماثلة في المستقبل.

5-بيانات التحليل

ملاحظة: هناك العديد من الأدوات لتحليل تدفق سيتوميتريك البيانات، والبرمجيات التجارية والحرة على حد سواء. يمكن أيضا عمل برامج اكتساب من سيتوميتيرس تدفق لتحليل البيانات. هنا استخدمنا فلوجو كمثال.

بدء تشغيل البرنامج واسحب الملفات FCS إلى مساحة العمل. انقر فوق نموذج لفتح نافذة رسم. حدد المعلمات لتقديمها على المحور X و Y بالنقر على المحاور X و Y. استخدم شريط الأدوات رسم غيتس وفقا لعلامات أعرب خلطات أو تعمل محددة من السكان الخلية.
إضافة بوابات لكل معلمة كما هو مبين في الشكل 1. اسحب البوابات لجميع العينات في مساحة العمل، بحيث أنها تحصل على مطابقة النابضة.
اسحب القطع إلى محرر تخطيط لإنشاء تقارير رسومية.
عرض كثافة fluorescence يعني (MFI) لكل السكان من اهتمام بالنقر فوق الزر إحصائيات (Σ) في إطار رسم واختيار "تعني" والمعلمة المناسبة، على سبيل المثال، القناة المستخدمة للكشف عن صبغ عضية على حدة. ثم انقر فوق "إضافة".
انقر على أيقونة محرر الجدول واسحب مؤسسة مونتانيار لمحرر الجدول لإنشاء تقارير إحصائية. حفظ كملف Excel أو نص أو CSV لحساب دلتا "مؤسسة مونتانيار" (ΔMFI) كمؤسسة مونتانيار (الأصباغ عضية على حدة)-"مؤسسة مونتانيار" (FMO).
ملاحظة: لا تحسب مؤسسة مونتانيار بين العينات المكتسبة مع سيتوميتير مختلفة الإعدادات (الفولتية أو قنوات الفلورسنت أو التعويض). مقارنات بين القيم المستمدة من التجارب باستخدام إعدادات مختلفة بلا معنى ومتحيزة.
تصدير كافة القيم من مساحة العمل وقطع من محرر تخطيط لجعل الجداول والأرقام.

النتائج

تحديد مجموعات فرعية رئيسية تي الخلية في الطحال والغدة الصعترية

وباختصار، تعليق خلية مفردة من الطحال والغدة الصعترية تم تفكيك خلايا الدم الحمراء، المحتضنة مع المادة طافية 2.4G2، متبوعاً بصبغة محددة عضية وعلامة السطحية تلطيخ مع ال...

Discussion

يجمع هذا البروتوكول الأصباغ عضية على حدة وعلامة السطحية تلطيخ لتحديد مقدار الميتوكوندريا أو ليسوسوميس في السكان مختلفة تي الخلية. تم تطوير هذا الأسلوب للتغلب على الحد متطلبات الخلية عدد والتجانس للأساليب التقليدية، مثل الميكروسكوب الإلكتروني وتحليل إيمونوبلوت. أنها مفيدة بشكل خاص في ت?...

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح.

Acknowledgements

وأيد وضع هذا البروتوكول المنح التي تقدمها "تايوان وزارة العلوم" والتكنولوجيا (معظم) NSC103-2320-B-010-002-MY2 و MOST104-2628-B-010-002-MY4 إلى هسو البنود. وي C.W. مستلم "ممتازة أطروحة جائزة من معهد لعلم الأحياء الدقيقة" وعلم المناعة، جامعة يانغ مينغ الوطنية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Graefe forceps (straight and serrated)	Dimeda
11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads)	Dimeda
15 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	339650
5 mL syringe	TERUMO
6 cm Petri dish	α-plus
70 µm nylon cell strainer	SPL Lifesciences	93070
Ammonium chloride (NH₄Cl)	Sigma	A9434
Anti-mouse CD25	Biolegend	102007	Clone:PC61
Anti-mouse CD4	Biolegend	100453	Clone:GK1.5
Anti-mouse CD44	Biolegend	103029	Clone:IM7
Anti-mouse CD62L	Biolegend	104407	Clone:MEL-14
Anti-mouse CD8	Biolegend	100713	Clone:53-6.7
Anti-mouse TCRβ	Biolegend	109233	Clone:H57-579
BD LSRFortessa	BD Biosciences
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Bio basic	6381-92-6
FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube)	BD Biosciences	352052
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	ATD161145
Flowjo, LLC	BD Biosciences
Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma	H4034
L-glutamine (200 mM)	Gibco	A2916801
LysoTracker Green DND26	Thermo Fisher Scientific	L7526
MEM Non-essential amino acids (100X)	Gibco	11140050
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Potassium bicarbonate (KHCO3)	J.T.baker	298-14-6
Propidium iodide solution	Sigma	25535-16-4
RPMI 1640 medium (powder)	Gibco	31800089
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S5761
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360070

References

Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity. Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).
Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes. The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).
Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells. Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).
Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fernández Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. Mitochondrial adventures at the organelle society. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).
Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).
McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).
Wrighton, K. H. Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).
Altshuler-Keylin, S., et al. Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance. Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).
Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).
Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function. The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).
Wei, C. W., et al. Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability. Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).
Baixauli, F., et al. Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses. Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).
Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).
Zhu, Y., et al. Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).
Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
van der Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).
Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy. Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).
Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).
Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis. The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).
Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).
Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages. Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).
Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
Dugnani, E., et al. Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).
Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis Research & Therapy. 17 (1), 29 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143 T

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: