Многоцветная потока на основе цитометрии количественная оценка митохондрии и лизосом в Т-клеток

Резюме

Эта статья показывает мощный метод количественного определения митохондрий или лизосом в живых клетках. Сочетание конкретных Лизосома или митохондрии красители с дневно конъюгированных антител против поверхностных маркеров позволяет количественная оценка этих органеллы в смешанных клеточных популяций, как первичной клетки заготавливаемым от образцов тканей, с использованием многоцветная проточной цитометрии.

Аннотация

Т-клетки используют различные обменные программы их функциональным потребностям во время дифференциации и пролиферации. Митохондрии являются важнейших клеточных компонентов, отвечающих за энергоснабжения клеток; Однако избыток митохондрии также производят реактивнооксигенных видов (ров), которые могут привести к смерти клетки. Таким образом количество митохондрий должны постоянно корректироваться в соответствии с потребностями клеток. Это динамическое регулирование достигается частично через функцию лизосомы, которые удаляют излишки/поврежденных органеллы и макромолекул. Следовательно сотовой митохондриальных и лизосомальных содержание являются основные показатели для оценки метаболической перестройки клеток. С развитием зонды для органеллы, хорошо изученных Лизосома или митохондрии конкретных красители стали доступны в различных форматах для обозначения сотовой лизосом и митохондрии. Многоцветная проточной цитометрии является общим инструментом для профиль клеток фенотипов и имеет возможность быть интегрированы с другими анализов. Здесь мы представляем подробный протокол о том, как совместить органеллы конкретных красители с поверхностных маркеров, окрашивание измерить количество лизосом и митохондрий в популяциях различных Т-клеток на проточный цитометр.

Введение

Активация и пролиферацию клеток T являются важнейшие шаги для монтажа успешных иммунных реакций. Последние достижения показывают, что тесно связано с развитием и функции клеток T клеточный метаболизм. К примеру наивно T клетки полагаются в основном на окислительное фосфорилирование (OXPHOS) для удовлетворения спроса на энергию во время рециркуляции среди средних лимфоидных органов. После активации наивно T клетки претерпевают радикальные метаболических перепрограммирования, включая индукцию аэробного гликолиза для увеличения производства АТФ и выполнить огромную метаболические требования во время дифференцировки клеток и распространения. Клетки, которые не в состоянии следовать через метаболические потребности умирают апоптоза на^1,2. В ходе метаболических перепрограммирование, митохондрии играют важную роль, поскольку они являются органеллы, значительной степени ответственность за производство АТФ для поставлять энергию для ячейки, и содержание сотовой митохондрий колеблется в ходе метаболических переключатели на протяжении Т-клеток развития и активации³. Однако накоплением лишних или повреждения митохондрий могут производить избыток рос, что повреждения липидов, белков и ДНК и в конечном итоге может привести к смерти⁴ ячейки

Чрезмерное или повреждения митохондрий, результатом метаболические изменения удаляются специализированной формой autophagy⁵, известный как mitophagy. Митохондрии окружены autophagosomes и затем сливается с лизосомы для деградации. Закрыть эти связи между митохондрии и лизосом вызвали большой интерес в^6,7. К примеру, оксидативный стресс стимулирует митохондрии составить производными митохондрий везикулы (MDVs), которые предназначены для лизосомы деградации в фосфатазы и натяжение гомолога (PTEN)-индуцированной предполагаемого киназы 1 (PINK1) и Паркин (E3 убиквитин лигаза) ⁸зависимым образом. Было также установлено, что mitophagy имеет важное значение для перехода бежево белый Адипоцит^9,10. Что еще более важно лизосомы являются не просто деградации отсек, но и регулятор клеточных сигналов. Накопление чрезмерного субстрат из-за недостатков фермента приводит к лизосомальных дисфункции, нарушая лизосомальных мембран проницаемости и влияет на Ca^{2 +} гомеостаза¹¹. Т-клеток функциональных дефектов в лизосомальных кислоты липаза (Лал)¹² или лизосомальных метаболит транспортер нокаут мыши модель¹³ далее показали важность лизосом в поддержании гомеостаза Т-клеток. Митохондрии и лизосом являются неотъемлемой частью клеточной регуляции метаболизма. Таким образом измерение содержания клеточных митохондриальной был решающую показателем для оценки состояния обмена веществ и функциональных Т-клеток.

Анализы, обычно используется для количественного определения сотовой митохондриальной или лизосомальных содержимое включают immunoblot, электронная микроскопия, immunofluorescent окрашивание (КРП) и ПЦР-анализа митохондриальной ДНК копировать номера^{14,15, 16}. Эти анализы, хотя immunoblot можно количественно сравнить уровни белка через различных образцов и электрон или если микроскопии можно визуализировать морфологические признаки эти органеллы¹⁷, несут определенные технические недостатки. Например это много времени приобрести достаточное количество клеток изображений с высоким увеличением и резолюции или сравнить уровни выражения протеина через десятки образцов, что делает эти анализы, считается низкой пропускной способности методы. Кроме того эти анализы может применяться только населению однородных клеток, таких как клеточных линий, но не для образцов тканей, которые состоят из смешанного населения.

Это также трудно применять эти анализы редких населения, для которых требование о минимальной ячейки чисел от 10⁶ -10⁸ невозможно соблюсти. Наконец клетки обычно лизированы или фиксированной во время процесса, что делает их несовместимыми с другими методами для получения дальнейшей информации. По сравнению с традиционными методами, на основе люминесцентных проточной цитометрии имеет относительно высокую пропускную способность - информация из всех клеток в образце состоит из смешанных клеточных популяций могут быть проанализированы и собранные одновременно. Кроме того можно обнаружить более 10 параметров на той же клетке и Сортировка ячеек, основанных на желаемый фенотипы для дальнейших анализов. Реактивная флуоресцентных зондов были использованы для обозначения лизосом и митохондрий в живых клеток и может быть обнаружен поток цитометрии^18,19. Эти зонды органеллы конкретных клеток проницаемых и физико химические характеристики, которые позволяют им быть сосредоточены в определенных местах субцеллюлярные или органеллы. Удобно эти датчики доступны в различных форматах флуоресцентные, таким образом позволяя их применение для многоцветного анализа.

Этот протокол описывает подробно как совместить поверхности маркер, окрашивание красками Лизосома или митохондрии специфичные для метки лизосомы или митохондрий в живой клетки. Это особенно полезно для образцов, созданных из основной ткани и органы, которые часто состоят из гетерогенных клеточных популяций. Исследователи могут определить клеточных популяций интерес выражением их поверхности маркер и конкретно измерить лизосомальных или митохондриальной содержимое через органеллы конкретных красителей в этих клетках. Здесь мы демонстрируем подробную процедуру анализа гранулярных потока, который оценивает лизосомальных или митохондриальной массы в основных селезеночной Т-клеточной субпопуляций.

протокол

Описанную здесь процедуру сбора ткани мыши был одобрен институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) национального университета Ян-мин.

1. Подготовка лимфоцитов подвеска из лимфоидных органов

1. Усыпить мыши утвержденным методом как CO₂ ингаляции в камере Прозрачный акриловый, следуют шейки матки дислокации для обеспечения смерти.
   Примечание: Держите скорость потока CO₂ 20% при перемещении в минуту палаты и не выше 5 psi (фунт на квадратный дюйм). Она занимает 2-3 мин для мыши потерять сознание. CO₂ поток поддерживать по крайней мере за 1 мин после животного остановилось дыхание (5-7 мин общая).
2. Поместите курсор мыши на его обратно на чистой доске (например полистирол пластиковые доски) и исправить конечностей клейкой лентой. Промойте с 70% этиловом спирте.
3. Урожай селезенки, вырезать и открыть брюшной полости с 11-см рассечения ножницы (селезенка находится ниже желудка и выше левой почки). Удаление селезенки с щипцами и очистить от соединительной ткани (при необходимости используйте ножницы).
4. Урожай тимуса, вырежьте диафрагмы и грудная клетка с обеих сторон с рассечения ножницы. Используйте щипцы для поднимания грудины раскрыть весь грудной полости. Отделить тимуса тщательно от окружающих тканей с ножницами и удалять любые остаточные соединительной ткани на бумажным полотенцем, смоченным с PBS.
5. Механически отделить ткани с поршень шприца в 6-см блюдо, содержащих 5 мл ледяной СУИМ буфера (PBS дополнены с 2% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1 мм ЭДТА). Передача одной ячейки подвеска пластиковых 15 мл пробирок; мыть 6см блюдо с еще 2 мл СУИМ буфера и объединить мыть с суспензию клеток, а также.
6. Центрифуга суспензию клеток (300 x g, за 5 мин при температуре 4 ° C) и удалить супернатант. Вновь приостановите лепешка с 2 мл аммония хлорид калия (ACK) лизировать буфер (155 мм NH₄Cl, KHCO 10 мм₃ и 0,1 мм Na₂ЭДТА) за 1 мин при комнатной температуре (RT) лизируют красных кровяных клеток. Нейтрализовать буфере ACK, добавив СУИМ буфер 10 мл суспензии клеток.
7. Центрифуга суспензию клеток (300 x g, за 5 мин при температуре 4 ° C) и удалить супернатант. Вновь приостановить клетки в 5 мл полного RPMI среднего (средне RPMI 1640, дополняется 44 мм NaHCO₃, 10 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES), 100 ед/мл пенициллин, стрептомицин 100 мг/мл, 2 мм L-глютамин, пируват натрия 1 мм, 1% MEM несущественные аминокислот и 10% FBS).
8. Суспензию клеток в фильтр через стрейнер ячейки (порами размером 70 мкм), чтобы удалить Купы ячейки. Подсчет количества ячеек с Горяева или счетчик автоматизированных клеток.

2. Количественная оценка митохондрии и лизосом

Примечание: Выполните органеллы конкретных краситель, окрашивание сначала, потому что оптимальное окрашивание условие для этих красителей инкубации при температуре 37 ° C. Пятнать поверхности маркер может быть значительно снижено ввиду антитела укупорки и интернализации при этой температуре.

1. Добавьте 1 х 10⁶ клеток раунд нижней трубы СУИМ, центрифуга клетки (300 x g, за 5 мин при температуре 4 ° C) и удалить супернатант.
2. Разбавить зонд фондовых решения окончательные рабочие концентрации (100 Нм MitoTracker зеленый или LysoTracker зеленый; отныне митохондрии Лизосома конкретных или красителя, соответственно) в подогретым 37 ° C сыворотки свободной культуры среднего. Это рабочий раствор для конкретных Лизосома или митохондрии красителя.
   Примечание: Тест несколько концентрации, включая диапазон рабочей концентрации, предложенная производителем (20-200 Нм для митохондрии конкретных краситель) и 50-75 Нм для Лизосома конкретных краситель, используемый здесь для получения лучших пятнать эффективности. Выберите популяции клеток, как известно, имеют хорошее выражение окрашивания цели (например , лизосомы) как позитивный элемент управления (например человека CD14⁺ моноцитов). Выберите рабочие концентрации, основанные на хорошее разделение между отрицательный и положительный пятнать, а также жизнеспособность клеток хорошо.
3. Ресуспензируйте клетки в 100 мкл Лизосома - или митохондрии определенного рабочего раствора красителя и инкубировать в 5% CO₂ инкубатора при 37 ° C за 15 минут или 30 мин, соответственно.
4. Добавьте 1 mL ледяной СУИМ буфера для остановки реакции. Пелле клетки центрифугированием (300 x g, за 5 мин при температуре 4 ° C) и удалить супернатант. Клетки теперь готовы для пятнать поверхности маркер.

3. поверхность маркер пятнать

1. Блок Fc рецепторов с 100 мкл предварительно титруемая 2.4G2 гибридомной супернатанта на льду для 10 минут вымыть клетки с 1 мл буфера СУИМ и центрифуги (300 x g, за 5 мин при температуре 4 ° C). Выбросите супернатант.
2. Инкубируйте клетки с 50 мкл предварительно титруемая флуоресценции конъюгированных антител комбинации в СУИМ буфера на льду на 20 мин Избегите света.
   Примечание: Подготовить единый цвет окрашенных клеток, которые включают все представить в флуоресцентных антител в антитела комбинации и клетки лечат только с органеллы конкретных краситель для определения напряжения каждого флуоресценции детектор и компенсации регулировки потока цитометр. Аналогичным образом подготовьте флуоресценции минус один (FMO) как фон элементов управления с помощью клеток окрашенных с антителами, но без окрашивания красками органеллы специфичные.
3. Вымойте клетки, добавив 1 мл буфера СУИМ и Пелле центрифугированием (300 x g, за 5 мин при температуре 4 ° C). Выбросите супернатант.
4. Ресуспензируйте клетки в 300 мкл буфера СУИМ, содержащий пропидий йодидом 1 мкг/мл (PI) и сразу же анализировать образцы на проточный цитометр.

4. образец коллекции на проточный цитометр

1. Включите компьютер, проточный цитометр, СУИМ приобретение программного обеспечения и любых других аксессуаров устройств в зависимости от платформы машины. Запустите PBS для около 1 мин для обеспечения линии потока заполняется с PBS и оболочкой и буфера. Убедитесь, что поток поток проходит гладко.
2. Открыть новый эксперимент и выберите команду Параметры (флуоресцентные детекторы) цитометр согласно инструкции производителя. Фильтр клетки через сито ячейки 70 мкм и вихревой до приобретения каждого образца, чтобы избежать скопления и формирования Дуплет.
3. Сделайте точка участков вперед точечной (FSC) и стороны точечной (SSC), которые представляют размер ячейки и гранулярности, соответственно. Оптимизируйте напряжений FSC и SSC, чтобы убедиться, что клетки интереса появляются в участках. Сделать точки участков FSC-A против FSC-W (или FSC-H) и нарисуйте ворота для одной ячейки.
4. Сделайте точка участки каждого флуоресцентные параметра. Использование неокрашенных клетки для определения фонового сигнала и использовать один цвет окрашенных элементов управления для регулировки напряжения каждого параметра, флуоресцентный, так что положительные и отрицательные клеточных популяций четко различимым и внутри динамического диапазона приобретения.
5. После того, как заданы все напряжения, используйте auto компенсации при наличии, или вручную настроить компенсации с неокрашенных одного цвета окрашенных элементов управления и исправить спектральных распространения. Применить компенсацию на образцы.
6. Сделать сюжет точка каждого параметра и составить ворота согласно экспериментальный набор. К примеру, FSC-A против FSC-H (или FSC-W) исключить Дуплеты, следуют FSC-A против SSC-A для лимфоцитов стробирования; SSC-A vs. Пи (живые клетки) и CD4 и CD8 (рис. 1).
7. Соберите достаточно события (всего мобильный номер) для осмысленного сравнения между населением. Как правило по меньшей мере 1000 события в населения интереса должны быть получены²⁰.
8. После того, как все образцы приобретаются, экспорт потока данных для анализа потока cytometry анализ программного обеспечения. Эксперимента сохраните как шаблон для сохранения цитометр настройки и параметры для применения подобных экспериментов в будущем.

5. анализ данных

Примечание: Существует много инструментов для анализа потока данных гранулярных, коммерческое и свободное программное обеспечение. Приобретение программного обеспечения цитофлуориметрами поток может также работать для анализа данных. Здесь мы использовали FlowJo в качестве примера.

1. Запустите программное обеспечение и перетащите ФТС файлы в рабочей области. Нажмите на образец, чтобы открыть окно графического. Выберите параметры, которые будут представлены на оси X и Y, щелкнув по осям X и Y. Используйте панель инструментов рисовать ворота по данным дифференциально выразили маркеры или определенных фенотипов клеточных популяций.
2. Добавьте ворота каждого параметра, как показано на рисунке 1. Перетащите ворота для всех образцов в рабочей области, так что они получают идентичные стробирования.
3. Перетащите участки макет редактор для создания графических отчетов.
4. Отображение означает флуоресценции интенсивности (MFI) для каждого населения интереса, щелкнув кнопку Статистика (Σ) в окно графического и выбрав «Означает» и соответствующий параметр, например, канал, используемый для обнаружения органеллы конкретных краситель. Нажмите кнопку «Добавить».
5. Щелкните значок Редактор таблицы и перетащите МФО в редактор таблиц для создания статистических отчетов. Сохраните как Excel, текстовый или CSV файл для вычисления Дельта МФО (ΔMFI) как МФО (органеллы специфичные красители) - МФО (FMO).
   Примечание: Не вычислить МФО между образцами, приобретенных с различными цитометр параметры (напряжения, флуоресцентный каналы или компенсации). Сравнение значений, полученных от экспериментов с различными параметрами смысла и предвзятым.
6. Экспортируйте все значения из рабочей области и сюжеты из редактор макетов для создания таблиц и рисунков.

Результаты

Идентификация основных Т-клеток подмножеств селезенки и вилочковой железы

Вкратце Одноячеистый суспензий из селезенки и вилочковой железы были лизированы красных кровяных клеток, инкубировали с 2.4G2 супернатанта, следуют ор?...

Обсуждение

Этот протокол сочетает в себе органеллы специфичные красителей и поверхности маркер окрашивания для количественного определения количество митохондрий или лизосом в популяциях различных Т-клеток. Этот метод был разработан для преодоления ограничения ячейки номер и однородности тре...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Graefe forceps (straight and serrated)	Dimeda
11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads)	Dimeda
15 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	339650
5 mL syringe	TERUMO
6 cm Petri dish	α-plus
70 µm nylon cell strainer	SPL Lifesciences	93070
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma	A9434
Anti-mouse CD25	Biolegend	102007	Clone:PC61
Anti-mouse CD4	Biolegend	100453	Clone:GK1.5
Anti-mouse CD44	Biolegend	103029	Clone:IM7
Anti-mouse CD62L	Biolegend	104407	Clone:MEL-14
Anti-mouse CD8	Biolegend	100713	Clone:53-6.7
Anti-mouse TCRβ	Biolegend	109233	Clone:H57-579
BD LSRFortessa	BD Biosciences
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Bio basic	6381-92-6
FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube)	BD Biosciences	352052
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	ATD161145
Flowjo, LLC	BD Biosciences
Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma	H4034
L-glutamine (200 mM)	Gibco	A2916801
LysoTracker Green DND26	Thermo Fisher Scientific	L7526
MEM Non-essential amino acids (100X)	Gibco	11140050
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Potassium bicarbonate (KHCO3)	J.T.baker	298-14-6
Propidium iodide solution	Sigma	25535-16-4
RPMI 1640 medium (powder)	Gibco	31800089
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S5761
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360070