فيورينيا كوليتوتريتشوم التنمية في مجال المياه ومقتطفات الأزهار عنبية المستندة إلى كلوروفورم والتوت البري

Summary

ويرد هنا، المقايسة مصممة لرصد تطور الممرض الفطرية، فيورينيا كوليتوتريتشوم، حضور مقتطفات الأزهار العنبية أو التوت البري على الزجاج كوفيرسليبس. المياه-كلوروفورم-ومجال مياه الأمطار-على أساس استخراج الأزهار تقنيات مفصلة فضلا عن نظرة ثاقبة كيف يمكن تطبيق هذه المعلومات.

Abstract

دقة رصد مراقبة فترة لوم وديناميات الزمانية من الإشارات الكيميائية الأزهار على الفاكهة الفطريات المتعفنة المسببة للأمراض، تطوير أساليب الاستخراج الأزهار والمقايسة ساترة الاستفادة من فيورينيا كوليتوتريتشوم. في التوت والتوت البري، يسيطر هذا الممرض على النحو الأمثل تطبيق مبيدات الفطريات خلال الفترة بلوم بسبب الدور الذي تؤديه الزهور في المراحل الأولى من الإصابة. وصف البروتوكول بالتفصيل هنا مقتطفات الأزهار كيف (FE) تم الحصول عليها باستخدام المياه-كلوروفورم-والطرق الميدانية القائمة على مياه الأمطار لاستخدامها لاحقاً في المقابلة المقايسة ساترة زجاجية. يخدم كل الحديد تقديم مجموعة مختلفة من المعلومات: العظة استجابة فيورينيا C. لتعبئة المواد الكيميائية الأزهار في الماء (المياه القائمة)، استجابة الممرض لزهرة وثمرة الشمع السطحية (المستندة إلى كلوروفورم)، والمستندة إلى مجال رصد جمع مياه الأمطار الأزهار، تتحرك في المختبر الملاحظات إلى بيئة زراعية. على نطاق واسع يوصف الحديد أما أو كلوروفورم-المستندة إلى الماء، مع الحشري مناسب وصف للتعويض عن الخلافات المتأصلة بين هذه المواد اثنين. مياه الأمطار التي قد تشغيل إيقاف الزهور كان جمعها في الأجهزة الفريدة لكل محصول، ملمحا إلى أن المرونة وتطبيق هذا النهج لنظم المحاصيل الأخرى. المقايسة سريعة وغير مكلفة وبسيطة، وتوفر القدرة على توليد معلومات الزمانية المكانية والمعينة للموقع عن الوجود مركبات نباتية تنشيطية من مصادر مختلفة. هذه المعلومات في نهاية المطاف أفضل ستبلغ استراتيجيات إدارة الأمراض، كما FE إنقاص الوقت اللازم للعدوى تحدث، وبالتالي توفير نظرة ثاقبة تغير المخاطر للإصابة بمسببات الأمراض خلال موسم النمو.

Introduction

فيورينيا كوليتوتريتشوم يؤدي تعفن فاكهة توت هايبوش (عنب كوريمبوسوم L.) و "التوت البري الأمريكي" (ف. ماكروكاربون أيتون) كبير^1،2. هذا الممرض قد حدده مؤخرا من أكوتاتوم جيم- الأنواع المعقدة^3،4،،من⁵⁶ وهو عامل سببية من التوت أنثراكنوسي وعضو تعفن الفاكهة التوت البري المعقدة، بالإضافة إلى أحداث عديدة أخرى مصنع الأمراض في العالم⁷. وقد فيورينيا C. كامنة، نمط حياة هيميبيوتروفيك⁸، مع الإصابات التي تحدث أثناء التطوير بلوم، والأعراض لا تصبح واضحة حتى الفاكهة في المراحل النهائية لنضوج⁹. في التوت والتوت البري، تسيطر تعفن الفواكه فقط على نحو كاف مع تطبيقات مبيد للفطريات خلال هذه الفترة بلوم. أوفيروينتيرس في توت نائمة براعم الأزهار جداول¹⁰ مسببات المرض وسبورولاتيس خلال لوم. يتم نقل كونيديا في جميع أنحاء المظلة عن طريق دفقة المطر تشتت^11،12 وتراكم العدوى قد تم ارتباطاً وثيقا ب لوم الفترة¹³. الاستجابة للأنواع Colletotrichum للزهور المضيفة ليست فريدة من نوعها في عنب، كما الزهور هامان من مكونات الفاكهة بلوم وظيفة الحمضيات إسقاط (PFD)¹⁴ ، فضلا عن¹⁵من الفراولة أنثراكنوسي، وفي كلتا الحالتين يسبب مسببات المرض سبورولاتي. جميع هذه الحالات تبرز الحاجة إلى أساليب فعالة لتقييم ديناميات الزمانية من الإشارات الكيميائية الأزهار في فيورينيا جيم ومسببات الأمراض الأخرى التي تصيب خلال لوم. أصبحت متزايدة أكثر قيمة الأفكار المقدمة من الأساليب الموصوفة هنا.

تفاصيل أساليب الاشتراء استخراج الأزهار (FE) هذا البروتوكول وأدلة تقييم الاستجابات فيورينيا C. للحديد عبر الزجاج ساترة المقايسة^15،16. يتم تقسيم تقنيات الاستخراج الأزهار إلى نوعين رئيسيين؛ المياه على أساس عمليات الاستخراج (النشطة-FE، و السلبي (المرور-FE)، والميدانية القائمة على مياه الأمطار (rw-FE))، والمستندة إلى كلوروفورم (ch-FE)¹⁷ الاستخراج. استخراج المياه على أساس السماح لتفتيش إشارات الكيميائية الأزهار المياه المعبأة. هذه العظة عبأ، عناصر هامة يحتمل المحكمة العدوى، نظراً للحديد يزيد كثيرا من سرعة الإصابة¹⁶، بالإضافة إلى توفير الرطوبة اللازمة للعدوى تحدث. بالإضافة إلى ذلك، فإنها تمثل شرطا أكثر طبيعية كما يمكن غسلها تحفيز الأزهار في جميع أنحاء المظلة أثناء التبول-أحداث كالتي لوحظت في العنبية وسائر نظم المحاصيل^14،16. كلوروفورم-على أساس عمليات الاستخراج الأزهار (ch-FE) توفر أيضا معلومات قيمة تتعلق بمسببات المرض واستجابة للمضيف سطح يقوي^17،18، توضيح مراحل النمو المبكر كونيديا أودعت مرة على عرضه الأجهزة المضيفة (أي من الزهور والمبايض والفاكهة النامية). يمكن أيضا رصد الممرض استجابة للتغيرات الموسمية في الشمع السطحية المضيف باستخدام هذا البروتوكول. تبعاً لذلك، المقايسة مصممة للعمل مع FE المستندة إلى الماء أو FE كلوروفورم المستندة إلى التخفيف من حدة الخلافات المتأصلة بين هذه المواد اثنين.

البيانات الناتجة من المقايسة كشفت عن أن عمليات استخراج المياه على أساس حفز مستويات أعلى من الثانوي كونيدييشن من عمليات الاستخراج المستندة إلى كلوروفورم حيثما كان هناك استجابة أبريسوريال نهائي، ولذلك يورط مركبات متعددة موجودة في الحديد. من المثير للاهتمام، وكلا من هذه الردود النمو لوحظت عندما يمكن غسلها باستخدام مياه الأمطار التي قد تشغيل الخروج من الزهور التوت والتوت البري، والتي تشير إلى عدة مركبات محفزة من على سطح أرض الزهور. وهكذا، سيوفر الرصد لتحفيز الأزهار ثاقبة احتمال نجاح الممرض في نظام الزراعي.

والهدف النهائي لهذا البروتوكول هو توفير منهجية لتوليد المعلومات البيولوجية الأساسية على مسببات الأمراض النباتية الفطرية في الاستجابة للإشارات الكيميائية الأزهار، فضلا عن بدء المنهجيات التي يمكن أن تستخدم هذه المعلومات الأزهار للمساعدة في الأمراض الخاصة بالموقع عمليات الإدارة وصنع القرار.

Protocol

1-الفطريات المعزولة والمعلقات سبور

1. عزل فيورينيا كوليتوتريتشوم من مضيف مصابة بطبيعة الحال¹⁹. ثم تخزين ثقافات نظيفة على الميول أجار (CMA) وجبة الذرة. ضع قابس الثقافة (من منحدر CMA) على الخلية البلاستيك القياسية الثقافة الطبق (قطرها 9 سم) التي تحتوي على أما توضيح V8 عصير أجار (cV8A) (تعديل 1955 ميلر)، أو عدم توضيح V8 عصير أجار (V8A)²⁰. عندما تبدأ المستعمرات في سبورولاتي، خط كونيديا (الجماهير كونديل البرتقالي) إلى آخر cV8A أو V8A الذي يحتوي على خلية ثقافة طبق (مع حلقة عقيمة قياسية) إنتاج ثقافة سبورولاتينج عالي الكثافة.
   ملاحظة: ينبغي إجراء أية خطوات البروتوكول مع الفطريات في غطاء الاندفاق الصفحي الحد من إمكانية تلويث الثقافات الفطرية و/أو المقايسة.
2. بعد 7 أيام نمو، واستخدام حلقة عقيمة قياسية جمع كمية صغيرة من كونيديا من ثقافة عالية الكثافة (باستخفاف لمس في حلقة لكتلة كونديل) ويحرك هذا في أنبوب الطرد مركزي 15 مل تحتوي على 10 مل مياه المعقمة (سدو). دوامة هذه العينة 10 s، ثم باستخدام ماصة قياسية يغرق صعودا وهبوطاً مرات عديدة إلى المزيج المزيد العينة.
3. ثم، ضع قطره من العينة فورتيكسيد على هيموسيتوميتير وتقدير تركيزات بوغ. عدد 5-10 حقول في هيموسيتوميتير، الحصول على المتوسط، ومضاعفة متوسط معامل التخفيف المناسبة (أي 10,000)، وبالتالي الحصول على تركيز conidial كل مل سدو.
4. ثم استخدام وحدة تخزين (V)/معادلة التركيز (ج) (V₁● [ج₁] = V₂● [ج₂]) ضبط (مع سدو) إلى 1.0 × 10⁵ كونيديا الواحد مل سدو بحجم 5 مل نهائي. هذا يشار إليه كتعليق سبور، وهو إلا مباشرة قبل استخدامها في أما الحشري.

2- نشط، والمياه على أساس مقتطفات الأزهار (النشطة -FE)^15،16

ملاحظة: انظر تكميلية الشكل 1و الإضافي رقم 2و تكميلية الشكل 3و فيلم تكميلية 1.

1. بعناية من ناحية-جمع توت (نيسان/أبريل-أيار/مايو) والتوت البري (حزيران/يونيه-تموز/يوليه) الزهور خلال بهم تزهر ذروة كل منها في المجال (تكميلية الشكل 1). ارتداء وتغيير القفازات النتريل بين مواقع أخذ العينات (مواقع الأصناف/أصناف/المادية) تحول دون التلوث بالنفط جلد الإنسان فضلا عن عبور التلوث بين أصناف نباتية. ضع الزهور العنبية أو التوت البري (من مصدر واحد) في أكياس بلاستيكية (ملء كيس 100 × 150 مم) وفورا في الثلاجة عند درجة 4 مئوية حالما يتم جمع الزهور.
   ملاحظة: يتم تعديل نشطة- الاستخراج من لياندرو وآخرون. (2003) ¹⁶.
2. قبل استخراج وإزالة أي زهور المتدهورة والتالفة والمريضة، ثم استخدام الزهور صحية إزالة المبايض وكاسيه وبيدونكليس مع منحنى ملقط (ملاقط 45˚) وتجاهل. استخدم فقط الأجهزة المتبقية (كورولا والوصم بالعار، ونمط والسداه) لعمليات الاستخراج النشط . قطع القماش القطني (150 × 150 مم) وجرت داخل قمع 7 × 7 ملم ووضع في أنبوب الطرد مركزي نظيفة 50 مل وجانبا.
3. الجمع بين 1 جزء معالجة الزهور إلى 9 أجزاء سدو (1 wt: نسبة المجلد 9) بقذيفة هاون. تطحن بلطف مع مدقة ل 30 s (رعاية يطحنون العينات لا تماما). سلالة اللب الناتج من خلال إعداد القماش القطني/القمع، وجمع في أنبوب الطرد المركزي (50 مل). تنظيف أو استخدام قذائف الهاون/مدقة جديدة بين كل الاستخراج مع 95% EtOH والمياه الدافئة.
4. إعداد جهاز ترشيح فراغ: جمع قمع بوخنر وتصفية فراغ قارورة Erlenmeyer (تصل إلى 1,000 مل القدرات)، ملم 55 دائرة تصفية الورق وفراغ خرطوم/المصدر. إضافة عامل تصفية الورق لقمع بوخنر مناسبة حجم ومكان قمة قارورة، ثم توصيل الجهاز بماء/شفط المصدر عبر خرطوم الشفط وجانبا.
5. زيادة توضيح مقتطفات الأزهار عنبية من سينتريفوجينج لمدة 10 دقائق في س 8,055 ز. صب قبالة المادة طافية في جهاز تصفية فراغ المعدة، قم بتشغيل المصدر فراغ، تصفية المادة طافية، ثم صب محتويات قارورة في أنبوب الطرد مركزي جديدة (50 مل). قم بتنظيف جميع مكونات الجهاز بين كل الترشيح مع 95% EtOH والمياه الدافئة. مرشح آخر عن طريق حقنه تكييفها مع 0.22 ميكرومتر المسامية حجم، خلات تعقيم، عامل التصفية في أنبوب الطرد مركزي جديدة (50 مل).
   1. مقتطفات الأزهار التوت البري، الفراغ فقط تصفية عن طريق تصفية الورق وصب قارورة المحتويات في أنبوب الطرد مركزي جديدة (50 مل).
6. إعداد الناتج يشار إلى نشط-استخراج الأزهار (نشط-FE). تخزين جميع المياه على أساس الزهور مقتطفات (النشطة- السلبي-ومجموعات مياه الأمطار) في-20 درجة مئوية في مختبرين 5-50 مل حتى الاستخدام التجريبي. تكرار عمليات الاستخراج مع عينات متعددة (عمليات الاستخراج 3 على الأقل من كل نوع العينة) لتوفير replicates.

3. المبنى للمجهول ، والمياه على أساس مقتطفات الأزهار ( تمرير -FE) ¹⁶

ملاحظة: انظر فيلم تكميلية 2.

1. من ناحية توت كله جمع الزهور (50 غ) كما ذكر أعلاه، وبعد جمع الثلاجة. قبل الاستخراج، إزالة أي زهور المتدهورة والتالفة والمريضة وإزالة فقط بيدونكليس من زهرة سليمة. بردت عينات المعدة حتى السلبي- نظام الاستخراج، المبينة أدناه، في المكان.
2. شطف جميع المكونات قبل استخدامها مع الإيثانول 95% (EtOH) والماء الحار لمنع التلوث (ورقة مش البلاستيك وسلتين مش البلاستيك والزجاج الخبز عموم وضخ الضباب زجاجة). كما تعد أنبوب الطرد مركزي القماش القطني/القمع/50 مل 4 طبقة لكل استخراج كما هو موضح أعلاه (في الخطوة 2، 2)، وتوضع جانبا.
3. إعداد المنخل: ضع ورقة مش بلاستيك (يعرف أيضا باسم واضح بار حصيرة) في سلة واحدة مش البلاستيك (114 × 102 ملم). ضع سلة مش الثانية، متطابقة، رأسا على عقب (مقلوب) إلى الزجاج الخبز عموم (127 × 229 ملم) (لتجنب الزهور يجلس في سدو) ومكان الشبكة ورقة سلة تحتوي على فوق. إضافة 50 غ زهور المعدة المنخل.
   ملاحظة: بدلاً من ذلك، سلال أنبوبة الاختبار الصغيرة [التطهير] يمكن استخدامها بدلاً من سلال مش البلاستيك المستخدمة أصلاً (مش القديمة، والأخضر، والفراولة نصف لتر سلال غالباً ما يصعب على المصدر).
4. بالتساوي الزهور الضباب مع 250 مل باستخدام مضخة رذاذ زجاجة والتقاط الجريان السطحي في عموم الخبز الزجاج. ثم سلالة فيلتراتي من خلال إعداد القماش القطني/القمع في أنبوب نظيف أجهزة الطرد مركزي. إعداد الناتج هو المشار إليها السلبي-استخراج الأزهار (المرور-FE)؛ تخزين ككل (الخطوة 2، 6) أعلاه.
5. قم بتنظيف جميع مكونات بين كل الاستخراج مع 95% EtOH والمياه الدافئة. تكرار عمليات الاستخراج مع عينات متعددة لتوفير وإنشاء نسخ متماثلة (على الأقل 3 كل نوع العينة).

4-كلوروفورم-أساس مقتطفات الأزهار (ch-FE) ¹⁷

1. جمع الزهور التوت والتوت البري ككل (الخطوة 2، 1) أعلاه، وإعداد الزهور لاستخراج (الخطوة 2-2، دون إعداد القماش القطني/القمع). الحفاظ على إعداد الزهور المبردة حتى قبل الاستخدام.
   1. يجب أن يتم أي عمل يضطلع مع كلوروفورم في غطاء دخان لأسباب تتعلق بالسلامة. وهذا يشمل إعداد مواد/الأواني الزجاجية وإجراءات استخراج الحشري الموصلية (خطوات استخدام ch-FE).
2. تنظيف جميع المكونات مع 95% EtOH مرتين، ثم مرتين مع كلوروفورم للحيلولة دون تلوث لاستخراج كل: الخيوط أنابيب زجاجية الثقافة وقنينة زجاجية 2 والشاشة الصغيرة من الفولاذ المقاوم للصدأ، واسطوانة الدراسات عليا [زجاج]. جانبا الجافة رأسا. شطف قبعات تترافلوروايثيلين (PTFE) اصطف مرتين مع 95% EtOH فقط (كلوروفورم سيضر مواد الغطاء الخارجي) وتوضع جانبا لتجف.
3. الجمع بين 1 جزء معالجة الزهور إلى 9 أجزاء كلوروفورم (1 wt: نسبة المجلد 9) في كوب (الزهور كلوروفورم ثم)، بلطف دوامة 30 ثانية، وسلالة من خلال شاشة فولاذ المقاوم للصدأ في الكأس الثانية. صب ch-الحديد من الكأس الثانية في الأنبوب الثقافة الزجاج (10-15 مل) وإلصاق كاب PTFE. لف الغطاء مع بارافيلم لمنع التبخر.
4. هذا الإعداد هو استخراج الأزهار المستندة إلى كلوروفورم (ch-FE). تخزين عينة في الظلام (للحد من تدهور الخفيفة) في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام التجريبي. تكرار عمليات الاستخراج مع عينات متعددة لتوفير وإنشاء نسخ متماثلة (على الأقل 3 كل نوع العينة).

5-جمع مياه الأمطار من "الزهور توت" (BB rw-FE)¹⁶

ملاحظة: الجهاز جمع مياه الأمطار الأزهار العنبية يتكون من كأس رذاذ الطلاء يمكن التخلص منها الهواء بندقية رش مع محول الاتصال (كأس: الخيط الإناث، محول: الموضوع الذكور للذكور)، أنابيب الطرد المركزي 50 مل (بولي بروبلين) وبارافيلم (الأسلاك المغلفة البلاستيك قياسي أسلاك الهاتف، محتويات حبلا أسلاك الداخلية الفردية).

1. حدد مواقع متعددة داخل شجيرة توت لالتقاط تشغيل الخروج من الزهور قبل إنشاء أجهزة جمع مياه الأمطار. وتشمل هذه مباشرة تحت إينفلوريسسينسيس (زهرة) إلى قاعدة جداً لبوش (ولي العهد). سجل القطر من ينبع (تتراوح من 1-5 سم) في مواقع مختارة، وهذا ستحدد حجم الثقوب المستخدمة للجهاز المرفق، الموصوفة أدناه.
2. لكل موقع من المواقع المحددة إنشاء جهاز جمع. أولاً حفر ثقب في الجزء السفلي من كأس رذاذ (حيث الكأس المنحنيات نحو فتح الخيوط) إلى قطر الجذع المقابلة، مع خطوة قليلاً يعلق على بيان صحفي الحفر. بعد ذلك، قطع خط مستقيم من أعلى تل في الفم من كأس رذاذ. حفر ثقوب مسافة واحدة 4 (كبيرة بما يكفي لمؤشر ترابط الأسلاك المغلفة البلاستيك)، عند مصب كأس الرش، وإرفاق نهاية واحد من الأسلاك المغلفة البلاستيك ترك نهاية واحدة مجاناً.
3. حفر حفرة كبيرة بما يكفي مؤشر ترابط المحول كأس بخاخ الطلاء في غطاء غطاء جهاز الطرد مركزي 50 مل. ختم المواضيع محول مع بارافيلم لمنع تسرب. إرفاق هذا إلى كل من كاب للطرد المركزي والخيوط جزء من كأس وبخاخ. إرفاق أنبوب الطرد المركزي تفعيل 50 مل.
4. كرر الخطوات من 5.3-5.4 إنشاء أجهزة متعددة وفقا لمواقع مختارة، الحد أدنى من جمع 4 أجهزة لأخذ العينات في الموقع الواحد.
5. نشر الأجهزة في مواقع مختارة بالثناء أكواب بخاخ لتناسب على ينبع. توجيه الجانب القطع كأس رذاذ صعودا باستخدام الأسلاك المغلفة باللدائن التي تعلق الأخرى ينبع (لتأمين المياه التي تمر فوق الزهور يتم التقاطها). إلصاق بارافيلم أي الفتحات التي يمكن أن تسرب مياه الأمطار. (تكميلية الشكل 3و تكميلية الشكل 4، تكميلية الرقم 5، و تكميلية الشكل 6).
6. تسمية مجموعة أنابيب مع نشر التاريخ/الوقت. بعد مطر-حدث، إزالة واستبدال الجزء السفلي (أنبوب) من الأنبوب الطرد المركزي (تسمية تاريخ/وقت جمع). إحضار مجموعات الجريان السطحي (المشار إليها كتوت استخراج الأزهار مياه الأمطار (بب رو-FE)) داخل وفراغ التصفية (الترشيح هو موضح في الخطوات 2.4-2.5). مخزن أعلاه (الخطوة 2.6)، حتى تستخدم في الحشري المستندة إلى الماء.

6-جمع مياه الأمطار من "زهور التوت البري" (سي بي رو-FE)

1. يتكون الجهاز جمع مياه الأمطار الأزهار في التوت البري من القمع البوليبروبيلين 7 × 7 سم، 50 مل أنابيب الطرد المركزي (بولي بروبلين)، بارافيلم، والمعيار 4، البلاستيك المغلفة تطور العلاقات (لكل جهاز).
2. أولاً، ثقب الحرارة 8 ثقوب مسافة واحدة (القطر من تطور العلاقات) حول فم القمع باستخدام مجس معدني. إدراج الروابط تويست 4 ثقوب. إرفاق غايات أخرى إلى الموقع الآخر ثقوب ذلك، تشكيل نمط أنيق معبر. التفاف الجذعية أسفل القمع مع بارافيلم ويوضع جانبا.
3. حفر حفرة كبيرة بما يكفي لإدراج الأسفل القمع-تنبع في سقف الطرد مركزي 50 مل مع خطوة قليلاً. إدراج إعداد القمع إلى الحد الأقصى للطرد المركزي. كرر الخطوات من 6.2 6.3 لإنشاء أجهزة متعددة، كحد أدنى لجمع 4 أجهزة لأخذ العينات في الموقع الواحد.
4. نشر الأجهزة المسمى (التاريخ/الوقت) في المستنقعات التوت البري المحدد. دقة الثنية اثنين زهرة تحمل إينفلوريسسينسيس (المعروفة باسم uprights) تحت الروابط تطور البلاستيك متقاطعة. ثم توجيه الجهاز عمودياً بثقب الأنبوب الطرد المركزي في ظله التوت البري (تكميلية الأرقام 7-8، 3 فيلم تكميلية).
5. بعد الري هطول الأمطار أو النفقات العامة إزالة واستبدال الجزء السفلي (أنبوب) من الأنبوب الطرد المركزي (تسمية تاريخ/وقت جمع). جلب الجريان السطحي (المشار إليها كاستخراج الأزهار التوت البري مياه الأمطار (سي بي رو-FE)) داخل وفراغ التصفية (الترشيح هو موضح في الخطوات 2.4-2.5). مخزن أعلاه (الخطوة 2.6)، حتى تستخدم في الحشري المستندة إلى الماء.

7. العينة باستخدام "المياه على أساس نباتية تستخرج"^15،16 (النشطة-FE، تمرير-FE، قابل لإعادة الكتابة-FE)

ملاحظة: انظر الشكل 1.

1. أعد غطاء الاندفاق الصفحي هذه العينة. إعداد المواد: الشطف الثلاثي زجاج كوفيرسليبس مع 95% EtOH والهواء الجاف، ثم وضعت جانبا. قص الورق منشفة الأقراص إلى القطر الداخلي للاطباق ثقافة الخلية البلاستيك القياسية (9 سم). 2 طبقات من الورق الأقراص داخل أطباق الثقافة ونقع مع 2 مل سدو.
2. إعداد 5 مل على الأقل 1.0 × 10⁵ كونيديا الواحد مل من سدو بوغ تعليق (C. فيورينيا) ككل أعلاه (الخطوة 1.2-1.4)، جانبا. وبعد ذلك، خلط كميات متساوية من سدو والمياه على أساس استخراج الأزهار في 2 مل أنابيب ميكروسينتريفوجي. ثم إضافة وحدة تخزين متساوية من تعليق بوغ للأنابيب ميكروسينتريفوجي استعداد 2 مل (سدو زائد FE)؛ إعداد الناتجة عن ذلك يشار إلى أن خليط مائي في معاملة. لعنصر التحكم، حذف جزء FE واستبدال سدو، للحفاظ على تناسق تركيزات كونديل.
   ملاحظة: حجم الجزء فيعتمد على عدد replicates والنقاط الزمنية. عادة، لا تتجاوز أجزاء 500 ميليلتر. حالما يتم الجمع بين كونيديا والحديد العينة قد بدأت، ح 0 بعد التطعيم.
3. ضع كوفيرسليبس قبل تنظيف الزجاج على رأس مناشف ورقية غارقة داخل الطبق ثقافة الخلية. مكان معالجة تجميعية ميليلتر 40 من خليط علاج مائي في وسط ساترة. كرر للعلاجات المطلوبة، بما في ذلك عنصر التحكم، وإغلاق الطبق ثقافة الخلية. كرر في خلية منفصلة ثقافة الأطباق لتكرار (على الأقل 3) والنقاط الزمنية (كل طبق نقطة مرة واحدة). مرة واحدة وقد تم الاستغناء عن جميع العلاجات و replicates، ضع جميع الأطباق ثقافة الخلية المنسوخة نسخاً متماثلاً في حاوية بلاستيكية محكمة الإغلاق (30 × 13 × 7 مم) واحتضان عند 25 درجة مئوية في الظلام.
4. في نقاط زمنية محددة سلفا، إضافة 10 ميليلتر من مثبت مثل القطن لاكتوفينول--الأزرق (بلورات الفينول ز 20.0، مل 20.0 2.5% حمض اللبن، مل 40.0 والغليسيرول، ز 0.05 القطن الأزرق) إلى القطرات، وقف النمو والحفاظ على شبه الجبل.
   1. انتظر ح 2 لجمع هذه النقطة الزمنية 0 ح هذا يسمح التصاق كونديل على سطح الزجاج ولكن ليست طويلة بما يكفي لإنبات كونديل. لجميع النقاط مرة أخرى بإضافة مثبت في وقت المقابلة.
5. متى تم إضافة مثبت، بعناية عكس كوفيرسليبس، وضع لهم الجانب الحبرية على شريحة مجهر زجاج لتسهيل الفحص المجهري (1 ساترة كل شريحة). عندما تكون جميع كوفيرسليبس على الشرائح الزجاجية المجهر، ترك لهم لتسوية والجافة جزئيا في هود تدفق لمدة 20 دقيقة.
6. عد جميع كونيديا (مجموع كونيديا) يقدم في ساترة (كونيديا الأولية، كونيديا نبتت، وشكلت حديثا كونيديا الثانوية) فضلا عن أبريسوريا أما 400 X التكبير (عد 16 حقول) أو 200 × (عد 4 حقول)، إجمالي مساحتها 3.808 مم ²-إجراء نسخ متماثل كامل العينة للتحليل الإحصائي. لفحوصات باستخدام المياه على أساس FE، تحليل البيانات كما هو موضح في والر et al. 2017¹⁶، عرض عادة ما يعني العد/مم² (مجموع كونيديا أو أبريسوريا).

8-العينة باستخدام المستندة إلى كلوروفورم "الأزهار مقتطفات" (ch-FE)¹⁷

ملاحظة: انظر الشكل 2.

1. إعداد المواد وخلية أطباق الثقافة ككل (الخطوات 7.1) أعلاه. بالإضافة إلى ذلك، شطف على عدد متساو من الخلايا فإن تيجم (VanT الخلايا) (8 ملم OD، معرف 6 مم) إلى كوفيرسليبس، فضلا عن ماصة زجاجية (1 مل بزيادات 1 ميليلتر) داخل غطاء دخان، (مرتين مع 95% EtOH ثم مرتين مع كلوروفورم)، وتوضع جانبا.
2. في هود الاندفاق الصفحي، استخدام أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل إضافة مجلدين متساوية (على الأقل 500 ميليلتر أجزاء) من سدو وحجم 1 تعليق بوغ، ثم جانبا. وهذا المزيج علاج مائي للمقايسة ch-الحديد.
3. في غطاء دخان، ضع VanT. خلية على ساترة زجاجية داخل الطبق ثقافة الخلية البلاستيك المعدة. الاستغناء عن (ماصة زجاجية) 33 ميليلتر من المطلوب ch-الحديد في وسط الخلية Van T. (لا تلمس جدران VanT. الخلية؛ لمعالجة عنصر التحكم، إضافة كلوروفورم العذراء)، و السماح لتجف. كرر في خلية منفصلة ثقافة الأطباق لتكرار (على الأقل 3).
4. وبمجرد ch-FE المجففة، الاستغناء عن 99 ميليلتر من خليط استعداد علاج مائي مع ماصة قياسية داخل المركز من VanT. الخلية، ثم أغلق كافة الخلية أطباق الثقافة. مرة واحدة قد حان الخليط علاج مائي على اتصال بالعلاجات المجففة ch-FE، العينة قد بدأت، ح 0 بعد التطعيم.
5. مرة واحدة وقد تم الاستغناء عن جميع العلاجات و replicates، ضع جميع الأطباق ثقافة الخلية (مغلقة) في حاوية بلاستيكية محكمة الإغلاق (30 × 13 × 7 مم) واحتضان عند 25 درجة مئوية في الظلام.
6. في نقاط زمنية محددة سلفا، إضافة 15 ميليلتر من مثبت (لاكتوفينول القطن الأزرق) إلى VanT. الخلية واسمحوا الجلوس لمدة 5 دقائق على الأقل لضمان تلطيخ فطرية كافية. بعد ذلك الوقت، إزالة بعناية في VanT. الخلية واتبع الخطوات اقتناء البيانات وانعكاس ساترة أعلاه (خطوات 7.5-7.6). لتحليل البيانات، اتبع الطرق الموضحة في 2015 الكيال¹⁷، عادة عرض البيانات تشكيل أبريسوريوم، وهو نسبة إجمالي كونيديا إلى أبريسوريا عدها في المنطقة (3.808 مم²) ولاحظ.

9-التوت البري على أساس مراقبة عمليات الاستخراج¹⁷

1. من ناحية جمع الزهور التوت البري (في حزيران/يونيه؛ 100 غرام)، وغير ناضجة الفاكهة (مرتين؛ تموز/يوليه وآب/أغسطس؛ 200 غرام)، وتنضج ثمرة التوت البري في موسم الحصاد (تشرين الأول/أكتوبر؛ 200 غرام)، ووضع في أكياس بلاستيك حجم مناسب وفورا بعد جمع الثلاجة عند درجة 4 مئوية. استخدام الاحتياطات التلوث المشار إليها أعلاه (الخطوة 2، 1).
   ملاحظة: سوف يكون هناك المواد النباتية الإضافية التي تم جمعها في كل وقت ولكن هذه المبالغ الاحتراس من استخراج المبايض المصابة ومن الواضح أن الفطرية والفاكهة (تظهر أعراض وعلامات المرض).
2. قبل الاستخراج، إزالة أي زهور المتدهورة والتالفة والمريضة، ثم استخدام الزهور صحية فقط، إزالة كاسية، بيدونكليس، كرلس، والوصم، وأنماط والاسديه مع منحنى ملقط (45 ° الملقط) وتجاهل كافة ولكن المبيض. حالما يتم جمع المبايض، تنفيذ استخراج كلوروفورم المستندة 1 wt: نسبة المجلد 9 (مفصلة في الخطوات 4، 2-4-4 على استخدام المبيض فقط). تخزين العينات حتى تكون جميع عمليات الاستخراج الأخرى كاملة، أي حتى الموصلية الحشري.
3. مرة واحدة الفاكهة يتم جمعها والقيام استخراج المستندة إلى كلوروفورم (الخطوات 4، 2-4-4 على الفاكهة التي تم جمعها باستخدام بدلاً من الزهور)، لكن إضافة 10 جرام فاكهة إلى 90 مل كلوروفورم واستخراج مرة واحدة، السماح بحل تتبخر لمل 9 (الذي ينتج عنه wt مل 9 و 10: : الحل المجلد).
4. جعل عمليات الاستخراج الفاكهة فورا بعد جمع في تموز/يوليه وآب/أغسطس وتشرين الأول/أكتوبر. تخزين ككل (الخطوة 4، 4) أعلاه حتى يتم تجميع جميع عمليات الاستخراج. بعد استخراج المستندة إلى كلوروفورم فاكهة الماضي، تخضع جميع مقتطفات كلوروفورم المستندة إلى العقاب التي جمعت لهذا الفحص بالعينة على أساس كلوروفورم وتحليل تبعاً لذلك (خطوات 8.1 8.6).

النتائج

النتائج المعروضة هنا أمثلة قليلة لفحوصات عديدة التي يمكن تنفيذها باستخدام هذه المنهجية. الشكل 1 هو دليل مصور للعينة FE المستندة إلى الماء، وتستكمل ب الرقم 2 الذي يتبع إلى الحشري FE المستندة إلى كلوروفورم. ويقدم الشكل 3 دليل مرئي على ما يمكن توقعه عند تقييم مجهرية فيورينيا جيم- ح 24، في كلا المقايسة المستندة إلى الماء وكلوروفورم (بالمقارنة مع الضوابط سدو). الشكل 4 تفاصيل دراسة دورة وقت ح 24 مع جيم فيورينيا حضور مجموعة التوت البري 'ستيفنز' ch-الحديد، ويعطي إشارة مرئية إلى استيراد نتيجة لهذا البحث: الحديد انخفض الوقت اللازم لتشكيل هياكل العدوى مقارنة سدو. 5 الشكل مثالاً للبيانات التي تم جمعها من الحشري ساترة استخدام مياه الأمطار الأزهار التوت البري الجريان السطحي (CB "زهرة" رو-FE). الرقم 6 يمثل نتيجة هامة أخرى: مبيض الأزهار ch-الحديد كانت محفزة أكثر بكثير من الفاكهة ch-FE، مشيراً إلى أهمية لوم في دورة حياة جيم-فيورينيا- تكميلية صور وأفلام تقديم مرئيات هامة من الزهور المستخدمة في الاستخراج وأجهزة جمع مياه الأمطار الأزهار/النشر، بالإضافة إلى الأفلام التي تصور (استخراج النشطة و السلبية- العمليات المستندة إلى الماء).

الشكل 1 : نظرة عامة المياه على أساس الأزهار استخراج العينة (FE). واستخدمت هذا التحليل للمياه على أساس مقتطفات الأزهار مع زهور التوت والتوت البري: نشط-الأزهار مقتطفات (النشطة-FE)، السلبي-الأزهار مقتطفات (تمرير-FE) وجريان مياه الأمطار الأزهار (rw-FE). -FE جزء يشكل عادة أن العامل المتغير التجريبي/. على العكس من ذلك-FE جزء يمكن أن تظل ثابتة ويمكن تقييم الوقت النقاط/ساعة بعد التطعيم. أحرز التفضيل نحو تحليل الحقل 4 في 200 X التكبير. المختصرات: تعقيم المياه، سدو؛ المساحة لكل مجال الرؤية، ألف الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : نظرة عامة على أساس كلوروفورم الأزهار استخراج العينة (ch-FE). واستخدمت هذه المقايسة للتوت والتوت البري (الزهور والمبايض والفاكهة). واستخدمت نوع واحد فقط من خليط مائي في المعاملة في هذا التحليل، تعليق بوغ جزء 1 إلى 2 أجزاء سدو (إبقاء تركيز كونديل متسقة بسبب التبخر ch-FE). يمكن استخدام هذا التحليل لمقارنة متعددة ch-الحديد (الشموع من مختلف النباتات السطوح)، أو متعددة وقت النقاط/ساعة بعد التطعيم استخدام واحدة ch-FE. المختصرات: تعقيم المياه، سدو؛ فإن تيجم [الزجاج] خلايا, VanT. الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 : المقارنة البصرية Colletotrichum فيورينيا حضور FE المستندة إلى الماء والحديد ch. في هذا التحليل عنبية 'بلويكروب' (النشطة-FE، المستندة إلى الماء) (عزل الفطريات: BB #10) والتوت البري 'ستيفنز' المستندة إلى كلوروفورم (ch-FE) (عزل الفطريات: سي بي-PMAP182) مقتطفات الأزهار وقورنت بضوابط سدو. ولوحظت زيادة هائلة في ثانوية كونيدييشن (حلقات) وتشكيل أبريسوريوم (رؤوس) عند مقارنة كونيديا حضور سدو (تحكم) (A) إلى active-FE (ب) في 24 ساعة بعد التطعيم. ومع ذلك، كونيدييشن الثانوي ليس كما يتضح عند مقارنة كلوروفورم الحشري سدو عنصر التحكم (ج) ch-الحديد (د)؛ بدلاً من ذلك، تحول النمو فيورينيا جيم- نحو تشكيل أبريسوريال. أظهرت استجابة مشتركة لكل نوع الاستخراج، المستندة إلى الماء ووصف القائم كلوروفورم، بغض النظر عن الأنواع المضيفة/الأزهار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 : دراسة دورة الوقت (24 ساعة) مع فيورينيا كوليتوتريتشوم حضور ch-الحديد- في هذا التحليل، فتشت بصريا التحكم سدو (أ-د) والتوت البري 'ستيفنز' ch-الحديد (ه-و) على 0، 6 و 12 و 24 ساعة بعد التطعيم (على سبيل مثال من النقاط الزمنية متغير بدلاً من مقارنة FE متعددة). تشكيل أبريسوريوم (رؤوس) بدأت في ح 6 في الفصل-الحديد وزيادة مطردة في جميع أنحاء النقاط الزمنية اللاحقة. يتملص هذه النتائج إلى عامل هام للبيولوجيا الممرض خلال الفترة بلوم: الزهور تقليل الوقت اللازم لتشكيل هياكل العدوى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 5 : عرض رسومي للبيانات التي تم جمعها باستخدام rw-الحديد في العينة. مياه الأمطار تشغيل الخروج من زهور التوت البري (CB "زهرة" رو-FE) والعذراء من مياه الأمطار التي لم تتطرق أي أنسجة النبات التوت البري ("الأرض" رو-FE) من المرطب-حدث واحد بالإضافة إلى قياسية النشطة، التوت البري استخراج الأزهار المستندة إلى الماء (CB النشطة --FE) (مراقبة إيجابية) وتعرضوا الحشري ساترة المستندة إلى الماء سدو (المراقبة السلبية) وتقييمه للنمو فيورينيا جيم . 'الزهرة' سي بي رو-الحديد كان على نفس المستوى من تشكيل كونيدييشن وأبريسوريوم الثانوية معيار CB النشطة-FE في التطعيم بعد 24 ساعة، مشيراً إلى أن أجهزة جمع كانت فعالة في التقاط الأزهار المنشطات صدر خلال التبول-الحدث. كونيديا مجموع يتكون من الابتدائي (إيداع)، كونيديا وكونيديا الثانوية المنشأة حديثا. رسائل تشير إلى اختلافات كبيرة في ف < 0.05 وفقا "اختلاف كبير أقل" فيشر اختبار (LSD)؛ كونيديا الأحرف الكبيرة والأحرف الإجمالية؛ أحرف صغيرة، أبريسوريا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 6 : مراقبة التوت البري على أساس العينة ch-FE، والفحص البصري- إدارة المرض للفاكهة المتعفنة الفطريات غالباً ما ينطوي على التطبيقات فطريات وقت لوم. هنا، ومقتطفات المستندة إلى كلوروفورم التوت البري (ch-FE) من عدة مراحل النمو من التوت البري (ستيفنز) قيمت بصريا لتأثير الشمع السطحية على جيم-فيورينيا في 24 ساعة بعد التطعيم. المبايض التي جمعت في حزيران/يونيه (A)، الفواكه غير الناضجة التي جمعت في تموز/يوليه وآب/أغسطس (ب، ج)، جمع الفاكهة المحصودة في تشرين الأول/أكتوبر (د)، وجرى تفتيش عنصر تحكم سدو (ه) لتشكيل أبريسوريال (رؤوس الأسهم). وكان المبيض ch-FE حجم أكبر لتشكيل أبريسوريال، مشيراً إلى أن هذا المصنع مراقبة (بلوم) أمر بالغ الأهمية لدورة الحياة من فيورينيا جيم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تكميلية الشكل 1: عنبية نورات. وقد جمعت الزهور عنبية للاستخراج خلال أزهار كامل (نيسان/أبريل-أيار/مايو في ولاية نيو جيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية) (سيظهر 'بلويكروب'). ملاحظة التداخل بين كرلس/المبايض من الزهور المتاخمة وبنية نورات تكميلية الشكل 2 (التوت البري تستقيم) بالمقارنة مع العام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تكميلية الشكل 2: تستقيم التوت البري- وقد جمعت زهور التوت البري للاستخراج خلال أزهار كامل (حزيران/يونيه-تموز/يوليه في ولاية نيو جيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية) (سيظهر 'ستيفنز'). ملاحظة المراحل زهرة متنوعة نورات التوت بري واحد (تستقيم)، ومدمن مخدرات، قطرات الماء الإبقاء على شكل كورولا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تكميلية الشكل 3: نشر مياه الأمطار توت (زهرة)- أنجز الجهاز جمع مياه الأمطار الأزهار عنبية، وضعت مباشرة تحت مجموعة من إينفلوريسسينسيس. ملاحظة الأسلاك المغلفة باللدائن المستخدمة لتوجيه الجهاز عمودياً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تكميلية الشكل 4: نشر مياه الأمطار توت (الجذعية). عنبية المكتملة مياه الأمطار الأزهار جمع الجهاز، يوضع نصف الطريق إلى أسفل الجذع بين نورات والتاج لبوش. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تكميلية الشكل 5: نشر مياه الأمطار توت (التاج)- أنجز الجهاز جمع مياه الأمطار الأزهار عنبية، توضع في قاعدة بوش (ولي العهد). يمكن إزالة الأسلاك المغلفة البلاستيك علما إذا لم يكن ذلك ضروريا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تكميلية الشكل 6: عنبية نشر مياه الأمطار (الأرض)- أكمل جهاز جمع مياه الأمطار العذراء، وضعت المتاخمة لشجيرات العنبية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تكميلية الشكل 7: نشر مياه الأمطار التوت البري (عن قرب)- أكمل جهاز جمع مياه الأمطار الأزهار التوت البري، مع اثنين uprights مطوي تحت روابط أسلاك متقاطعة بدقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تكميلية الشكل 8: نشر مياه الأمطار التوت البري- متعددة إكمال مياه الأمطار الأزهار التوت البري الأجهزة المنتشرة في مستنقع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تكميلية الفيلم 1: مقتطفات الأزهار النشطة، والمستندة إلى الماء (النشطة-FE). دعم الفيديو تكميلية بعد الخطوات 2، 3-2.5.1. وقد استخدمت الزهور عنبية 'بلويكروب'. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

تكميلية الفيلم 2: السلبي، مقتطفات الأزهار المستندة إلى الماء (تمرير-FE). الخطوات التالية دعم الفيديو تكميلية 3.3-3.4. وقد استخدمت الزهور عنبية 'بلويكروب'. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

تكميلية الفيلم 3: نشر أجهزة جمع مياه الأمطار الأزهار التوت البري. دعم الفيديو تكميلية بعد الخطوة 6، 4. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Discussion

المقايسة الكشف عن استجابة فيورينيا جيم- مقتطفات الأزهار (فاس) وضعت لثمرة التوت والتوت البري باثوسيستيمس العفن ولكن يمكن سهولة تكييفها للمحاصيل البستانية الأخرى. البروتوكول بالتفصيل أعلاه قد كانت مفيدة في الحصول على العديد من مجموعات البيانات الهامة بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر: آثار الحديد على يعزل العديد من مسببات الأمراض العديدة، الوقت بالطبع معلومات تتعلق بمراحل نمو الفطريات حضور مختلف فاس، مقارنة بين تقنيات الاستخراج، التفتيش على المواد الكيميائية الإفرادية في فيورينيا جيم- النمو والتمايز، تقييم للجهاز الأزهار الفردية مقتطفات، آثار درجة الحرارة على فيورينيا جيم- حين حضور FE، آثار مراقبة الشمع يعتمد الاستخراج، وآثار مياه الأمطار الأزهار. البيانات التي تم إنشاؤها عن طريق استخدام هذه التقنيات، قد أيضا شريطة فهم أوضح للحياة فيورينيا جيم- مراحل ويوضح جزئيا السبب في فترة أزهر حرجة للغاية للسيطرة على كثير من الفاكهة المتعفنة المسببة للأمراض.

في البداية، جهزت كل الزهور مطابق تماما النشطة-FE، ولكن عملية الاستخراج وتحرك في اتجاه استخدام الزهور كلها. تشريح الأزهار تستغرق وقتاً طويلاً وكان تأثير ضئيل جداً على بيواكتيفيتي فاس الناتجة عن ذلك. ومع ذلك، يمكن أجهزة الأزهار الفردية وقد تم تقييمها باستخدام هذا البروتوكول، ولكن قدر كبير من العناية يجب أن تتخذ لمسرات لا تماما أنسجة نباتية (تكميلية الفيلم 1، مع احتياطات مفصلة في الخطوة 2، 3)، حيث أن هذا قد يؤدي في إصدارها مركبات الفطريات السامة/ثابت في الحديد التي يمكن أن تشوه هذه التقييمات مجهرية. أقل عمليات الاستخراج الغازية مثل تمرير-FE (تكميلية الفيلم 2) و rw-الحديد الآن أكثر ملاءمة نظراً لسهولة الحصول على. بالإضافة إلى ذلك، تتطلب هذه التقنيات الاستخراج فقط فراغ الترشيح للحصول على الرموز الكيميائية الأزهار النشيطة بيولوجيا.

عادة ما كانت المبردة الزهور المستخدمة في جميع عمليات الاستخراج 0-3 أيام قبل إعداد استخراج. تحد من هذا البروتوكول إدارة الوقت FE دوران (جمع الحقل عن طريق تخزين مقتطفات). وهذا قد تفاقمت عينات عديدة من مصادر متعددة، والتواريخ. لم يتم تقييمها الزهور المجمدة إلى أي مدى حقيقية، كما تظهر الزهور المذابة المتدهورة ومشوه. ومع ذلك، مرة واحدة قد أعدت فاس المستندة إلى الماء، تكرار التجميد والذوبان أظهرت أي تأثير على ريفروزين بيواكتيفيتي الحديد، لذا ما دام الحديد بسرعة بعد إعداد الاختبار الأحيائي (الحديد 3 سنوات من العمر قابلة للتطبيق).

يمكن استخراج كلوروفورم-على أساس التحقيق في الردود الممرض بالشموع السطحية ثلاثية الأبعاد الأزهار/الفاكهة في طائرة ثنائية الأبعاد عن طريق التبخر ch-الحديد في كوفيرسليبس الزجاج. ومع ذلك، من المستبعد أن هياكل الشموع المودعة من ch-FE البلورية الفعلية متطابقة إلى السطح من خلاله أنها جمعت. وينبغي تنفيذ تقنيات تكميلية، ومعنى إذا كانت الاستجابة الفطرية للشمع محددة الهياكل في فيفو التركيز الرئيسي للتحقيق. مقتطفات المستندة إلى كلوروفورم بحاجة إلى صيانة تخزين مزيد من الاستخراج المستندة إلى الماء. بالإضافة إلى حفظ ch-FE مقتطفات في الظلام، ثقافة الخلية PTFE اصطف أنبوب قبعات وبارافيلم ختم التفاف الحاجة إلى أن يتم التحقق بشكل منتظم لتسرب التبخر واستبدالها عند اللزوم.

مفهوم الرصد جريان مياه الأمطار الأزهار متأصلة في فكرة النهوض بأدوات رصد الأمراض الخاصة بالموقع. الأجهزة جمع مياه الأمطار التي يمكن تكييفها للعديد من أبنية المصنع الأخرى، طالما أن يلتقط الجهاز جمع مياه الأمطار التي قد تشغيل الخروج من الزهور. هذا النهج يوفر معلومات عن ما إذا كان أو لم تحفيز الأزهار موجودة في الميدان في أي وقت من الأوقات ويمكن رصدها طوال الموسم. بدلاً من ذلك، يمكن نشر مجموعة من الأجهزة في مواقع مظلة متعددة لتحديد مدى العظة الأزهار قد تم غسلها خلال أي نظراً للتبول-الحدث. في المستقبل التجارب، قابل لإعادة الكتابة-FE ستحدد متى يبدأ تطبيقات مبيد للفطريات ومتى يمكن أن تنتهي بسلام. بالإضافة إلى ذلك، أهمية فترة لوم للبيولوجيا الممرض برصد مراقبة الشمع يعتمد الاستخراج (المادة 9 من البروتوكول)، أصبح أكثر وضوحاً. هذا القسم تضمن أيضا لإظهار المرونة في هذه المقايسة، توفير الوسائل التي تسمح بمقارنة جنبا بجنب للمضيف الشموع السطحية التي يتم فصل وقتيا. وتمثل البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام تقنيات الاستخراج الأزهار والمقايسة مؤشرات ملموسة لحفز الممرض، فئات كيميائية محددة هامة بيولوجيا الكائنات الممرضة، وأهدافاً لاستراتيجيات المكافحة في المستقبل.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter	VWR	101102-280	Blueberry floral extract (FE) clarification
200-1000 µl pipette with tips	-	-	Equipment, any make within range will be adequate
40-200 µl pipette with tips	-	-	Equipment, any make within range will be adequate
5-40 µl pipette with tips	-	-	Equipment, any make within range will be adequate
Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter	Harbor Freight	97098	Blueberry rainwater (rw-)FE collection
Autoclave	Amsco	3011	Equipment, media preparation
Bar mesh matting (plastic mesh sheet)	Winco	BL-240	Passive (pass)-FE collection
Benchtop timer	Fisher Scientific	06-662-47	Equipment, FE preparation
Black pressure/vacuum hose	VWR	62994-795	Vacuum filter component
Buchner funnel	Coors USA	60240	Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks
Bunsen burner	-	-	Equipment
Calcium carbonate	Fisher Scientific	C64-500	Media component
Centrifuge	Sorvall	RC 5B Plus	Equipment
Centrifuge tubes (15 ml)	Fisher Scientific	05-527-90	Equipment
Centrifuge tubes (50 ml)	VWR	10025-694	Equipment, rw-FE collection
Cheesecloth (grade 50)	Fisher Scientific	AS240	Equipment, FE preparation
Chloroform	VWR	JT9175-3	Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free
Corn Meal Agar (CMA)	Fisher Scientific	B11132	Pre-mix media, isolate storage on slants
Cotton-blue stain	Sigma-Aldrich	61335	Lactophenol cotton-blue stain
Difco Agar	VWR	90004-032	Media component
Drill-press	Delta	-	Equipment, rw-FE collection
EASYpure LF Ultrapure water	Barnstead	D738	Equipment, deionized water source
Ethanol (95%)	-	-	Chemical
Filter flask (500 ml)	Pyrex	No. 5340	Vacuum filter component
Fume hood	Hamilton	-	Equipment, chloroform usage
Funnel (7 X 7 cm)	VWR	60820-110	Cranberry rw-FE collection, FE preparation
Generic glass slide	Fisher Scientific	22-038-101	Bioassay conductance
Generic plastic pump spray bottle	VWR	16126-454	pass-FE collection, at least 250 ml capacity
Glass cell culture tubes	-	-	Storage of ch-FE
Glass coverslips (22 x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542B	Bioassay conductance
Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes)	-	-	Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID)
Glass-pipette (1-100 µl)	Hamilton Co. Inc.	#710	ch-FE bioassay
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Lactophenol cotton-blue stain
Hemocytometer	Bright-Line	5971R10	Equipment
Lactic acid	Sigma-Aldrich	W261106	Lactophenol cotton-blue stain
Laminar flow hood	Labconco	3730400	Equipment, sterile work environment
Metal probe (generic)	-	-	Equipment
Microcentrifuge tubes (2 ml)	Fisher Scientific	05-408-138	Aqueous treatment mixture storage and preparation
Microscope, Leica DMLB	Leica	020-519.010	Equipment
Mortar (ceramic)	Coors USA	60313	Vacuum filter component
Nitrile gloves	Fisher Scientific	19-130-1597D	Flower collection
Paper disks (cut paper towels)	Office Basics	KCC01510	humidity control in bioassay
Parafilm	Bemis	PM-996	Plastic paraffin film
Pestle (ceramic)	Coors USA	60314	Vacuum filter component
Phenol crystals	Fisher Scientific	A92-100	Lactophenol cotton-blue stain
Plastic bags (~100 mm X 152 mm)	Uline	S1294	Equipment, flower refrigeration
Plastic cell culture dishes (9 cm diameter)	Fisher Scientific	FB0875712	(Petri dish), bioassay conductance
Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps	VWR	60927-228	Storage of ch-FE
Pyrex beakers (100 ml)	Pyrex	No. 1000	Preparation of ch-FE
Pyrex bread-pan	-	-	pass-FE collection
Pyrex graduated cylinder	-	-	Equipment, FE preparation
Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm)	-	-	Bioassay conductance
Sharp-pointed dissecting scissors	Fisher Scientific	8940	Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks
Stainless steel mesh strainer	VWR	470149-756	Preparation of ch-FE
Step drill bit (step-bit)	Dewalt	-	Equipment, rw-FE collection
Sterile loop (combi-loop)	Fisher Scientific	22-363-602	Culture preparation
Telephone wire (internal wires)	-	-	Blueberry rw-FE collection
Test tube basket	VWR	470137-792	Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket
V8 Juice	Campbell's Soup Company	-	Fungal media component
Vintage plastic mesh [strawberry] baskets	Donation	-	pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792)
Vortex Genie (Vortex)	Fisher Scientific	12-812	Spore suspension preparation
Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles	Whatman	1001-055	Vacuum filter component
White plastic twist ties (100 mm)	Uline	S-566W	Cranberry rw-FE collection