بروتوكول غير القابل للصدأ لعزل الحمض النووي الريبي عالية الجودة من الليزر التقاط خلايا ميكروديسيكتيد بوركنجي في المخيخ تشريح الإنسان

Summary

هذا البروتوكول يستخدم نهج خالية من وصمة عار لتصور وعزل خلايا بوركنجي في الأنسجة المجمدة الطازجة من المخيخ البشري بعد الوفاة عن طريق التقاط الليزر ميكروديسيكشن. والغرض من هذا البروتوكول توليد كميات كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة لتسلسل الحمض النووي الريبي.

Abstract

ليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM) هو أداة مفيدة أن يسمح للمجموعة من الخلايا ذات الصلة سيتولوجيكالي و/أو فينوتيبيكالي أو مناطق من الأنسجة المتباينين. يمكن استخدام المنتج تم التقاطها في مجموعة متنوعة من الأساليب الجزيئية للبروتينات، عزل الحمض النووي الريبي أو. ومع ذلك، الحفاظ على الحمض النووي الريبي من أنسجة المخ البشري تشريح الجثة تنطوي على تحديات خاصة. تتطلب تقنيات التصور القياسية ل LCM نسيجية أو إجراءات المصبوغة المناعي أن يمكن أن تتحلل الجيش الملكي النيبالي. ولذلك، قمنا بتصميم بروتوكول غير القابل للصدأ للتصور في LCM مع الغرض المقصود من الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي في أنسجة المخ البشري بعد الوفاة. خلية بوركنجي في المخيخ مرشح جيد للتصور غير القابل للصدأ، ونظرا لحجم وموقع مميز. قشرة الدماغ لدى الطبقات المتميزة التي تختلف من حيث كثافة الخلايا، مما يجعلهم ركبة جيدة لتحديد تحت مجهر التكبير عالية. هي خلايا بركنج العصبية الكبيرة الواقعة بين طبقة الخلايا الحبيبية، الذي شبكة كثيفة خلوية للخلايا العصبية الصغيرة، وطبقة الجزيئية، ومتفرق في الهيئات الخلية. وبسبب هذا الهيكل، من الممكن استخدام التصور غير القابل للصدأ. أنظمة الجهاز أو الخلايا الأخرى التي تحاكي هذا النمط الظاهري ستكون مناسبة أيضا. تم تصميم البروتوكول غير القابل للصدأ لإصلاح الأنسجة المجمدة الطازجة مع الإيثانول وإزالة الدهون مع زيلين نفط للتصور المورفولوجية تحسين إطار التكبير عالية الخفيفة الميكروسكوب. هذا البروتوكول لا تراعي أساليب التثبيت الأخرى، وهو مصمم خصيصا لعينات الأنسجة المجمدة الطازجة التقاطها باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية)-نظام LCM. وهنا، يقدم بروتوكول كامل لتقطيع وإصلاح أنسجة الدماغ البشري الجثة المجمدة الطازجة وتنقية من الجيش الملكي النيبالي من خلايا بوركنجي معزول بواسطة الأشعة فوق البنفسجية-LCM، مع الحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي لتسلسل الحمض النووي الريبي اللاحقة. في أيدينا، هذا البروتوكول وتنتج مستويات استثنائية من التصور الخلوية دون الحاجة لتلطيخ الكواشف وغلة الجيش الملكي النيبالي مع ارتفاع أرقام سلامة الحمض النووي الريبي (إيه إيت) كما أن هناك حاجة لتجارب التنميط النسخي.

Introduction

ليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM) هو أداة بحثية قيمة تسمح فصل خلايا مرضية ذات الصلة لتقييم جزيئيا مدفوعة اللاحقة. استخدام التحليلات الجزيئية في هذه عينات الأنسجة غير متجانسة والارتباط مع البيانات السريرية والمرضية خطوة ضرورية في تقييم أهمية البحوث البيولوجية¹متعدية الجنسيات. عند تحليل البيانات التعبير الجيني من الجيش الملكي النيبالي، استخدام أقسام الأنسجة المجمدة ينصح بشدة كما أنها تسمح للنوعية الممتازة للجيش الملكي النيبالي، فضلا عن أقصى كمية². ثبت أيضا أن ذات جودة عالية وكمية من الحمض النووي الريبي أساسية للبيانات ذات مغزى من تسلسل الحمض النووي الريبي³. عند استخدام الحمض النووي الريبي من أنسجة الجثة المجمدة الطازجة ل LCM، تدهور الحمض النووي الريبي غير تحديا كبيرا، كما أنه يحدث فورا عند الوفاة ومداه هو توسط مختلف العوامل المرتبطة بالانسجة جمع الأسلوب^4،5 . وعلاوة على ذلك، يتفاقم تدهور الجيش الملكي النيبالي عندما المصبوغة التقنيات اللازمة للاعتراف بتفاصيل النسجية وتحديد الخلية. المتخصصة تلطيخ التقنيات، مثل الهيماتوكسيلين ويوزين ونيسل وصمة عار، الفلورة و immunohistochemistry قد تكون مفيدة في تمييز الخلايا من ستروما المحيطة بها لكن ثبت للحط من الجيش الملكي النيبالي، ويغير التعبير نسخة ⁶من التشكيلات الجانبية. ولذلك، أوجد مختبرنا بروتوكول غير القابل للصدأ مصممة خصيصا للحفاظ على الجيش الملكي النيبالي في المخيخ البشري الجثة لأغراض تسلسل الحمض النووي الريبي بعد عزلة LCM بوركنجي الخلايا العصبية.

في تجهيز الأنسجة المجمدة الطازجة ل LCM، يمكن أن تؤثر طريقة التثبيت مغايرة على سلامة كل من الجيش الملكي النيبالي والأنسجة. التثبيت الفورمالين المعيار للحفاظ على الخصائص المورفولوجية، ولكن الأسباب العابرة للربط التي ربما تفتيت الحمض النووي الريبي وتتداخل مع الحمض النووي الريبي التضخيم⁷. تثبيت الإيثانول أفضل بديل لعزل الحمض النووي الريبي، كما هو مثبت كواجولاتيفي التي لا تحفز العابرة للربط¹. ولتعزيز تصور مورفولوجيا الأنسجة، زيلين نفط هو الخيار الأفضل، كما أنه يزيل الدهون من الأنسجة. ومع ذلك، هناك معروفة القيود عند استخدام زيلين نفط في LCM، الأنسجة يمكن أن تجف وتصبح هشة تفتت الأنسجة تسبب عند التقاط الليزر⁷. زيلين نفط هو أيضا مادة سامة متقلبة، ويجب أن تعالج بشكل صحيح في غطاء دخان. ومع ذلك، أظهرت زيلين نفط لتعزيز التصور الأنسجة مع أيضا الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي⁸. لذلك، لدينا بروتوكول تدور حول استخدام التثبيت الإيثانول 70% والجفاف الإيثانول، تليها الحضانة زيلين نفط للوضوح المورفولوجية.

من المهم ملاحظة أنواع مختلفة من نظم الليزر ميكروديسيكتيون، كما أنها أظهرت أن تختلف في السرعة والدقة والجودة الجيش الملكي النيبالي. ليزر الأشعة تحت الحمراء (IR) التقاط ميكروديسيكتيون والأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) نظم ميكروديسيكتيون ميكروبيام الليزر كانت كل المنابر LCM الرواية التي ظهرت في نفس الوقت تقريبا⁸. نظام الأشعة تحت الحمراء-LCM يستخدم "نظام اتصال" استخدام فيلم الحرارة شفافة توضع مباشرة على قسم الأنسجة، والخلايا التي تهم بشكل انتقائي الالتزام بالفيلم بنبضات مركزة من ليزر الأشعة تحت الحمراء. بدلاً من ذلك، هو نظام الأشعة فوق البنفسجية-LCM "نظام عدم الاتصال" حيث يقطع شعاع ليزر مركزة بعيداً الخلايا أو المناطق ذات الاهتمام في النسيج؛ اعتماداً على تكوين في اثنين من منصات التجارية المتاحة حاليا التي تستخدم أما على تصميم مجهر المقلوب أو تستقيم، تكتسب الأنسجة في جهاز جمع موجه ضغط المستحثة بالليزر التي المقاليع أنها ضد الجاذبية أو الأنسجة جمع بواسطة الجاذبية، على التوالي. وتشمل مزايا هامة لنظام الأشعة فوق البنفسجية-LCM اقتناء خلية أسرع، جمع خالية من التلوث مع نهج عدم الاتصال وتشريح أكثر دقة بسبب كثير أصغر ليزر شعاع قطرها⁹. صمم خصيصا لنظام الأشعة فوق البنفسجية-LCM هذا البروتوكول ولم يتم اختباره في نظام LCM الأشعة تحت الحمراء. أما تصميم نظام الأشعة فوق البنفسجية-LCM، عندما تتراكم الخلايا إلى الحد الأقصى جمع، واستخدام ساترة أن يعزز الوضوح الخلوية أثناء الفحص المجهري ليست مناسبة، كما سيكون غير قادر على الدخول في عملية النداءات الموحدة جمع الخلايا. ولذلك، تعزيز التصور الأنسجة، قمنا باختبار استخدام قبعات جمع معتمة، التي تم تصميمها لتعمل بمثابة ساترة للتصور المجهرية في أنظمة الأشعة فوق البنفسجية-LCM، ضد قبعات جمع مليئة السائل. يمكن أن يكون تحديا قبعات جمع مليئة السائل، كما يخضع لتبخر السائل ويجب أن يتم استبداله كثيرا أثناء العمل في المجهر. الوقت يصبح عاملاً مهما للاستقرار في الجيش الملكي النيبالي، كما يذوب الأنسجة تم التقاطها مباشرة⁷.

لدينا مختبر الدراسات التغييرات نيوروباثولوجيك تشريح الجثة في المخيخ للمرضى الذين يعانون من الهزة الأساسية (ET) واضطرابات الأعصاب المتصلة بها في المخيخ. لقد أظهرنا التغييرات مورفولوجك تتمحور حول خلايا بوركنجي التي تميز بين الحالات ET مقابل عناصر التحكم، بما في ذلك خفض عدد خلايا بوركنجي، ازداد الانحدار الجذعية ومجموعة متنوعة من التغييرات محواري، تؤدي بنا مسلمة أن بوركنجي ضمور الخلية ميزة بيولوجية أساسية في ET المرضية^10،11،،من¹²¹³. التنميط النسخي قد استخدمت في العديد من أمراض الجهاز العصبي لاستكشاف الأساس الجزيئي الكامنة وراء التغيرات الخلوية التنكسية. بيد النسخي لمحات من عينات غير المتجانسة، مثل مناطق أنسجة المخ، يمكن انتقاص قناع التعبير عن النصوص وفرة منخفضة و/أو تقلل من الكشف عن التغيرات الجزيئية التي تحدث إلا في عدد صغير من سكان من المتضررين الخلايا، مثل خلايا بوركنجي في قشرة الدماغ. على سبيل المثال، خلايا بوركنجي هي فاقت إلى حد كبير من الخلايا الحبيبية وفرة في قشرة الدماغ قبل حوالي زائداً؛ وهكذا، لفعالية الهدف يتطلب بهم الترنسكربيتوم العزلة محددة من هذه الخلايا العصبية. قشرة الدماغ هي رسمتها الطبقات المتميزة التي تختلف من حيث كثافة الخلية وحجم الخلية. هذه البنية الخلوية يعتبر مثاليا لتصور في عينة أنسجة المجمدة الطازجة دون المحتوية على صبغ الكواشف المصبوغة. ومن الناحية النظرية، يمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول على أنواع الأنسجة الأخرى التي لديها أنسجة مميزة مماثلة المنظمة.

تم تصميم هذا البروتوكول للعمل على وجه التحديد للتصور خلايا بوركنجي في المخيخ البشري بعد الوفاة. وتوجد العديد من البروتوكولات للتثبيت، تلطيخ التصور والحفاظ على الحمض النووي الريبي لأنواع عديدة من الأنسجة للأغراض من كلا الأشعة تحت الحمراء--والأشعة فوق البنفسجية-LCM. عندما تفكر تصميم تجريبي للأشعة فوق البنفسجية-LCM، ينبغي تكييف الأفراد على بروتوكول تناسب احتياجات ومتطلبات من البداية والنهاية المواد. هنا، أن نجمع بين جوانب كثيرة من مختلف البروتوكولات LCM توفير طريقة محسنة لتصور خلايا بوركنجي في المخيخ الجثة البشرية دون الحاجة إلى صبغة تحتوي على كواشف المصبوغة لإعداد الجيش الملكي النيبالي عالية الجودة الترنسكربيتوم التسلسل.

Protocol

جميع العينات البشرية المستخدمة في هذا البروتوكول قد تم الحصول عليها بالموافقة المستنيرة، وتمت الموافقة على طريق الداخلية استعراض المجلس (مجلس الهجرة واللاجئين) في جامعة كولومبيا وجامعة ييل.

ملاحظة: ينبغي أن تتبع بأكملها هذا البروتوكول الصارم الحمض النووي الريبي التعامل مع المبادئ التوجيهية، التي بموجبها يتم دائماً استخدام القفاز يد ويتم تنظيف جميع الأسطح مع ديكونتاميناتور رناسي وجميع مواد العمل هي الجيش الملكي النيبالي/الحمض النووي/نوكلاس مجاناً.

1-اختبار الحمض النووي الريبي سلامة الأنسجة قبل بدء LCM

ملاحظة: يمكن أن يتم اختبار جودة الجيش الملكي النيبالي بطرق عديدة. ضمان أن يتم اختبار الحمض النووي الريبي من المقطع بأكمله لتوفير عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) ممثل للعينة.

1. حدد بعناية عينات الأنسجة لإدراج التي تتلاءم مع المعلمة للتصميم التجريبي. إذا قطع في كريوستات، الانتقال إلى الخطوة 1.2. إذا لم يكن كذلك، عملية الأنسجة تبعاً لذلك والانتقال إلى "الخطوة 1، 11".
2. الحصول على حاويتين من الثلج الجاف. الحجم سيتوقف على عدد العينات.
   1. في الحاوية الأولى من الثلج الجاف، ضع أنبوب فارغ، المسمى 2 مل مع التعليمات البرمجية الأنسجة.
      ملاحظة: يستغرق 10 دقيقة للأنابيب تجميد. يجب تجميد أنابيب قبل وضع الأنسجة في لهم؛ وبخلاف ذلك، سوف تذوب الأنسجة على سطح الأنبوب.
   2. في حاوية ثانية من الثلج الجاف، ضع الأنسجة من ثلاجة-80 درجة مئوية تتطلب الاختيار الجيش الملكي النيبالي.
3. تنظيف في كريوستات. راجع الخطوة 4.7 للتنظيف الداخلي بالتفصيل.
4. إزالة الأنسجة من الثلج الجاف وقص جزء صغير من الأنسجة مع شفرة حلاقة رناسي تطهير. ينبغي أن تكون الأنسجة 1 سم × 1 سم تقريبا في الحجم.
5. مكان التلة عالية مم تقريبا 3 قطع الأمثل الحرارة (OCT) مركب على كريوستات 'تشاك' وتسمح بتجميد جزئي. ثم، ضع الأنسجة على رأس OCT – لا تدفع إلى أكتوبر، ببساطة السماح لها بالراحة في الأعلى.
6. متى يصلب OCT، مكان تشاك بالانسجة المركبة في كريوستات قطع الذراع وموقف أمام بليد كريوستات.
7. تقليم في 30 ميكرو المقاطع حتى الأنسجة حتى.
8. قطع 300 ميكرومتر الأنسجة ومكان في أنبوب مجمدة 2 مل. ضع الأنبوب مرة أخرى في الثلج الجاف.
9. إزالة الأنسجة من 'تشاك' ووضع مرة أخرى في الثلج الجاف حتى على استعداد لوضع بعيداً.
10. كرر الخطوات من 1.4-1.9 لكل الأنسجة.
11. بمجرد اكتمال جميع العينات، استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة الحمض النووي الريبي استخراج المقدمة (الجدول للمواد #15). وتقدم بروتوكول مفصلة مع أدوات استخراج الحمض النووي الريبي. يجب اتباع جميع التعليمات بما في ذلك الخطوة اختيارية لتجفيف الغشاء أنبوب جمع وخطوة اختيارية الهضم الدناز (الجدول للمواد #16).
12. اختبار سلامة الحمض النووي الريبي المستخرج عن طريق تقييم نوعية بيواناليزير¹⁴.

2-تعد قبل "بدء تمزيقها" ل LCM

1. تنظيف أصحاب الشرائح قبل كل جولة من تقطيع الأنسجة ل LCM. تنفيذ إجراء التنظيف في اليوم قبل الاستخدام للسماح بإكمال التجفيف بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: أصحاب الشرائح المستخدمة لتثبيت قسم الأنسجة في الإيثانول، والمقاصة في زيلين نفط.
   1. الشريحة حامل التنظيف الداخلي: شطف مع ديكونتاميناتور رناسي تليها ثنائي إثيل بيروكاربوناتي معاملة (ديبك) المياه. واسمحوا أن بين عشية وضحاها الجافة رأسا على سطح الحمض النووي الريبي/الحمض النووي/نوكلاس مجاناً، وتجنب أي الغبار أو تلوث الهواء الأخرى.
      تنبيه: ديبك شديدة السمية وينبغي التعامل معها والتخلص منها باستخدام البروتوكول القياسي من المواد الكيميائية الخطرة EH & S.
2. تنظيف الفرش لتقطيع مع رناسي ديكونتاميناتور، والسماح الجافة بين عشية وضحاها. تجنب أي الغبار والملوثات الأخرى.
3. مكان الغشاء الشرائح تحت الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. عدم فضح الشرائح للأشعة فوق البنفسجية أكثر من 1-2 يوم قبل استخدامها. ويعزز هذا ربط الأنسجة إلى الشريحة الغشاء.
   ملاحظة: يمكن أن تكون خطوة 2.3 جنبا إلى جنب مع الخطوة 4، الذي يسمح لشريحة الأشعة فوق البنفسجية العلاج تحدث في اليوم نفسه كتقطيع الأنسجة (راجع الخطوة 4، 4).

3-إعداد الحلول التثبيت مع رناسي المياه مجاناً والايثانول عالي الجودة

ملاحظة: وتعد جميع الحلول الطازجة لكل تجربة. ضمان إنجاز صاحب الشريحة التنظيف الداخلي من "الخطوة 1، 1". وتعد جميع الحلول في أصحاب الشريحة.

1. ضع 30 مل إيثانول 100% في شريحة واحدة حامل.
2. تمييع الإيثانول مع رناسي/الدناز/نوكلاس المياه مجاناً. مكان 30 مل من الإيثانول 95% في إحدى الشرائح حامل ووضع على الجليد.
3. تمييع الإيثانول مع رناسي/الدناز/نوكلاس المياه مجاناً. مكان 30 مل من الإيثانول 70% في إحدى الشرائح حامل ووضع على الجليد.
4. فصل أصحاب الشريحة مكان 30 مل من زيلين نفط 100% في اثنين وتسميتها #1 و #2.

4-إعداد كريوستات لتقطيع الأنسجة

1. الحصول على دلو من الجليد لحلول الإيثانول وحاوية مع الثلج الجاف للأنسجة.
   تنبيه: الثلج الجاف باردة للغاية، وذلك باستخدام قفازات واقية. لا تضع الثلج والجليد الجاف في نفس الحاوية. اختلاف درجات الحرارة في الجليد والثلج الجاف سيؤدي إلى النموذج معا في درجة حرارة غير محددة.
2. إزالة الأنسجة من الثلاجة-80 درجة مئوية وعلى الثلج الجاف للنقل إلى كريوستات.
3. كريوستات الإعدادات:
   1. تعيين سمك الباب 14 ميكرومتر.
   2. تعيين سمك القطع إلى 30 ميكرو للحفاظ على كمية الأنسجة.
   3. كريوستاتس مع غرفة مزدوجة والعينة يحملون درجات الحرارة، اضبط درجة حرارة الغرفة (CT) إلى-18 درجة مئوية. بالنسبة كريوستاتس مع إعداد واحد، تعيين درجة الحرارة إلى-17 درجة مئوية.
   4. بالنسبة كريوستاتس مع غرفة مزدوجة وعقد درجة حرارة العينة، تعيين درجة حرارة الكائن (OT) إلى-16 درجة مئوية.
      ملاحظة: التمديد يجب أن يكون أكثر دفئا من الأشعة المقطعية لضمان قطع حتى. إذا كان لا يزال هو تمزيق النسيج، يمكن زيادة العبارات إلى-15 درجة مئوية، ويمكن زيادة الأشعة المقطعية إلى-18 درجة مئوية.
4. وضع الأنسجة في كريوستات لمدة 20 دقيقة على الأقل للسماح بالتوصل إلى درجة الحرارة المثلى.
   ملاحظة: إذا لم يكن الأنسجة في درجة الحرارة المثلى، فإنه سوف اجاد عند القطع. لا تضع الأنسجة في-20 درجة مئوية في الليلة السابقة للمحافظة على سلامة الحمض النووي الريبي ومنع تشكيل كريستال الجليد. تسمح الأنسجة كالكثير من الوقت حسب الضرورة لحجته إلى درجة الحرارة المثلى قص بسلاسة. التنفيذ الاختياري للحضانة الشريحة تحت الأشعة فوق البنفسجية قد يحدث هنا (انظر الخطوة 1-3).
5. ضع 'تشاك' في كريوستات عن 20 دقيقة على الأقل للسماح لينزل إلى درجة حرارة كريوستات.
6. وضع الفرش النظيفة في كريوستات عن 20 دقيقة على الأقل للسماح لينزل إلى درجة حرارة كريوستات.
7. تنظيف في كريوستات
   1. تنظيف المسرح مع خليط رناسي ديكونتاميناتور و 70% الإيثانول المخفف بالحمض النووي الريبي/الحمض النووي/نوكلاس المياه مجاناً لمنع تجمده في المرحلة 1:1.
   2. تنظيف شفرة كريوستات المتاح جديدة مع ديكونتاميناتور رناسي ومكان في حامل بليد في المرحلة. السماح على الأقل 20 دقيقة بليد كريوستات التوصل إلى درجة حرارة كريوستات.
   3. تنظيف لوحة لفة المضادة مع ديكونتاميناتور رناسي ونعلق على المسرح. السماح على الأقل 20 دقيقة للوحة لفة المضادة التوصل إلى درجة حرارة كريوستات.
      ملاحظة: صفيحة لفة المضادة غير مطلوب لقطع ولكن ينصح بشدة. إذا لم يتوفر صفيحة لفة المضادة، فرشاة تنظيف يعمل كبديل لذلك. إذا لم تكن لوحة لفة المضادة في درجة الحرارة الصحيحة، سوف تذوب الأنسجة أو العصا عند القطع.

5-تقطيع الأنسجة

1. قطع قطعة صغيرة من الأنسجة (~ 1 سم × 1 سم) لتمزيقها. عودة الأنسجة المتبقية للثلج الجاف-80 درجة مئوية المجمد.
   ملاحظة: تأكد من المقطع أنسجة قشرة الدماغ ~ 95%، حيث توجد خلايا بوركنجي.
2. مكان التلة عالية حوالي 3 مم من أكتوبر لتغطية 'تشاك'. البدء ببناء الطبقات في الأعلى في حركة دائرية، بطيئة، حتى يكون هناك كومة صغيرة.
3. بعد أكتوبر مجمد جزئيا، ولكن لا يزال هناك بعض السائل في الوسط، ضع الأنسجة على رأس OCT. عدم دفع الأنسجة عميقا في أكتوبر الماضي السماح الأنسجة للجلوس على رأس أكتوبر حتى تجمد تماما. وهذا سوف يستغرق 1-2 دقيقة.
4. ضع 'تشاك' مع أكتوبر المجمدة والأنسجة في ذراع القطع كريوستات. ضبط الأنسجة حيث يكون تدفق مع شفرة قطع.
5. تسمح الأنسجة للجلوس في قطع الذراع لمدة 15-20 دقيقة لضبط درجة الحرارة الجديدة.
   ملاحظة: اعتماداً على سمك الأنسجة، يلزم وقت للتأقلم درجة الحرارة. تسمح الأنسجة للجلوس ما دام المطلوب لقطع نظيفة. ضبط بعد التمديد والأشعة المقطعية للمساعدة على التأقلم درجة حرارة الأنسجة.
6. تتحرك ببطء الأنسجة أقرب إلى الشفرة. متى وصلت الأنسجة بليد، بدء عملية القطع. يجب تعيين سمك القطع إلى 30 ميكرومتر.
7. تقليم x 2 – 3 حتى طبقات قشرة مرئية.
8. ومحاذاة لوحة لفة المضادة ألتو أعلاه بليد كريوستات.
   ملاحظة: سوف يظهر خط فضة من الضوء في كريوستات في الواجهة بليد ولفه المضادة لوحة. يشير هذا إلى لوحة لفة المضادة مباشرة على حافة النصل.
9. -البدء في قطع المقاطع في 14 ميكرومتر. سوف تكون المقاطع بشكل صحيح قطع شقة تحت صفيحة لفة المضادة.
   ملاحظة: إذا تمسك الأنسجة، ضمان أن لوحة لفة لمكافحة البرد ما فيه الكفاية. إذا كان ضروريا، وضع قطعة من الجاف الجليد على الإرادة (الجانب عدم لمس المرحلة) خارج سرعة البرد لوحة لفة المضادة.
10. قطع المقاطع 4 – 6 ومحاذاتها أفقياً عبر مرحلة كريوستات.
11. الصيد الشريحة، تلتقط كل قطعة من النسيج في وقت واحد.
    ملاحظة: باستخدام الفرش، رفع حتى ينتهي الأنسجة لتكون متاحة بسهولة أكبر للشريحة عند التقاط. لا تلتقط مقطع واحد في وقت واحد. سوف تخفض التعرض إلى الهواء درجة حرارة الغرفة سلامة الحمض النووي الريبي.
    تنبيه: لا تدع الغشاء مرحلة كريوستات اللمس. إذا الغشاء الذي يمس المرحلة، أنها سوف تبدأ في فصل من الشريحة الزجاجية وسوف تتسبب في حدوث أخطاء عند محاولة LCM.
12. الانتقال مباشرة إلى الخطوة 6. عدم تأخير التثبيت.

6-تحديد التصور الأنسجة/وصمة عار أقل

1. الانتقال فورا إلى البروتوكول التثبيت الإيثانول
2. ضع الشريحة في حامل الشريحة مع الإيثانول 70% لمدة 2 دقيقة – على الجليد.
3. ضع الشريحة في حامل الشريحة مع الإيثانول 95% مقابل 45 s – على الجليد.
4. ضع الشريحة في حامل الشريحة مع الإيثانول 100% لمدة 2 دقيقة – في الرايت
5. تراجع الشريحة 3 مرات في حامل الشريحة مع زيلين نفط 1 – في الرايت
6. ضع الشريحة في حامل الشريحة مع زيلين نفط 2 لمدة 5 دقائق – في الرايت
7. السماح لتجف في منطقة نظيفة لمالا يقل عن 30 دقيقة أطول الأوقات الجافة الأمثل، يصل إلى 60 دقيقة.
   تنبيه: الوقوف في وجه الشرائح للتجفيف في غطاء دخان. زيلين نفط قابلة للاشتعال. يؤدي زرع شرائح مسطحة زيلين نفط إلى تجمع في قسم الأنسجة، التي سوف تتسبب في الأنسجة لتكون داكنة جداً.

7-اختياري – شريحة التخزين

1. ضع الشرائح المجففة في أنابيب الفردية 50 مل (شريحة واحدة في الأنبوب) ومكان في الثلاجة-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام.
   ملاحظة: يجب أن تكون الشرائح الجافة قبل وضع في الثلاجة-80 درجة مئوية. لا تستخدم ديسيككانت داخل الأنبوب كما سيتم تضمين الجسيمات في الأنسجة والأغشية. التأكد من أن غطاء أنبوب ضيق؛ إذا لم يكن الأمر كذلك، سوف يحدث التكثيف على الشريحة عند ذوبان الجليد للاستخدام.
   تنبيه: سلامة الحمض النووي الريبي النقصان بعد 7 أيام، كما يفعل نوعية التصور الأنسجة.

8-ذوبان الجليد تخزين الشرائح لاستخدامها

1. إزالة الأنبوب مع شريحة واحدة من الثلاجة-80 درجة مئوية ح 1 قبل الاستخدام.
2. لا تفتح فورا الأنبوب. يسمح الأنبوب إلى درجة حرارة الغرفة. سوف يحدث التكثيف على السطح الخارجي للأنبوب فقط.
3. مرة واحدة قد حان الأنبوب إلى درجة حرارة الغرفة وجميع التكثيف ذهب (حوالي 30-40 دقيقة)، إزالة الغطاء وفضح الشريحة في الهواء في درجة حرارة الغرفة.
4. السماح بأن يتأقلم بدرجة حرارة الغرفة 15-20 دقيقة إجازة إزالة الشريحة داخل الأنبوب مع الحد الأقصى للشريحة.
   ملاحظة: الشريحة جاهز الآن ل LCM.

9-ليزر ميكروديسيكشن القبض على خلايا بوركنجي:

ملاحظة: وسيناقش هذا الجزء من البروتوكول فقط التفاصيل المتصلة بالتقاط خلايا بوركنجي لتسلسل الحمض النووي الريبي اللاحقة. هذا المقطع يفترض أن المستخدم مألوف مع المجهر التقاط الليزر الأشعة فوق البنفسجية والبرامج التابعة لها.

1. تنظيف مرحلة مجهر وجمع الحد الأقصى الذراع مع ديكونتاميناتور رناسي.
2. مع الأيدي القفاز، مكان الشريحة في المجهر و 500 ميكروليتر كاب مبهمة في الذراع جمع.
   ملاحظة: دائماً ضمان الأسلوب السليم في الجيش الملكي النيبالي بتنظيف منطقة العمل مع ديكونتاميناتور رناسي واستخدام الأيدي القفاز أثناء لمس الشريحة أو غطاء غير شفاف. يمكن إزالة القفازات بمجرد الشريحة وكاب المعمول بها وقد بدأ التقاط الليزر.
3. تكبير منخفضة، محاذاة كاب مبهمة على أنسجة الدماغ، ضمان أن السقف يغطي المنطقة بأكملها تصور في قطعة العين.
   ملاحظة: سوف تظهر فقط قطعة العين المجهر إذا يتم توسيط الغطاء غير شفاف. لن يتم إظهار الكاميرا إذا كان الغطاء يتركز على الأنسجة. استناداً إلى تصميم نطاق التقاط الليزر، أما أن التصور من خلال الغطاء غير شفاف في قطعة العين فقط أو تصور في كل قطعة العين والكاميرا.
4. تصور طبقات الدماغ مع 5 x-10 x الهدف العدسة، وقم بوضع المؤشر فوق المقطع حيث تتقاطع الخلايا الحبيبية والجزيئية طبقة (طبقة خلايا بوركنجي).
5. الانتقال إلى 40 س ووضع تصور لخلايا بوركنجي.
   ملاحظة: انظر الشكل 1 و الشكل 2 لتصورات المثال.
6. بدء التقاط خلايا بوركنجي.
   ملاحظة: لأداء الجيش الملكي النيبالي-التسلسل، على الأقل 5 نانوغرام من الجيش الملكي النيبالي المطلوب. حوالي 1600 – 2000 بوركنجي الخلايا ينتج ما يكفي من المواد الحمض النووي الريبي للتسلسل. الجيش الملكي النيبالي ستكون مستقرة لمدة تصل إلى 8 ساعات في المجهر. اختبار الطاقة الأشعة فوق البنفسجية والأشعة فوق البنفسجية التركيز قبل جمع ضمان مستويات صحيحة. مع مرور الوقت، سوف تستمر الأنسجة لتجف وطاقة الأشعة فوق البنفسجية والأشعة فوق البنفسجية التركيز قد تحتاج إلى تغيير.

10-الجيش الملكي النيبالي "جمع" وظيفة LCM

1. إعداد المخزن المؤقت تحلل الخلية (إعداد جديدة كل مرة)
   1. تمييع 2-mercaptoethanol في المخزن المؤقت لتحلل في 1: 100 (10 مل μL:1، على التوالي). المخزن المؤقت لتحلل (RLT) يرد في الجدول للمواد (#14 و #15).
2. إضافة 50 ميكروليتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلية إلى كاب معتمة، مع سقف أعلى. بعناية قم بإغلاق الأنبوب عبر عملية النداءات الموحدة.
3. اترك الأنبوب رأسا على عقب لمدة 1 دقيقة.
4. دوامة الأنبوب لمدة 30 ثانية، وتدور بسرعة تحلل المخزن المؤقت إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
5. إعادة فتح الأنبوب، ثم كرر الخطوات من 10.2-10.4.
6. ضع الأنبوب الذي يحتوي على 100 ميكروليتر من المخزن المؤقت لتحلل، والجيش الملكي النيبالي من الثلاجة-80 درجة مئوية إلى جميع العينات يتم الانتهاء وجاهزة لاستخراج الحمض النووي الريبي (الجدول للمواد #14).

النتائج

هذا البروتوكول بالتفصيل الخطوات اللازمة لإعداد الجثة المجمدة الطازجة أنسجة المخ البشري للأشعة فوق البنفسجية-LCM. يتم إعطاء مواصفات دقيقة وشروح لقطع كريوستات، كما أنه يمكن أن يكون من الصعب على قطع أنسجة المخ المجمدة الطازجة بدرجة عالية من الدقة. أهم نقطة للنظر هو أن الأنس?...

Discussion

يتم تعديل البروتوكول المعروضة هنا على وجه التحديد أن اتباع نهج غير القابل للصدأ في تصور الأنسجة شكلياً متميزة للأشعة فوق البنفسجية-LCM. يهدف هذا الأسلوب تحقيق أقصى قدر من سلامة الحمض النووي الريبي لتسلسل الحمض النووي الريبي المباشرة اللاحقة، مع الحفاظ على مستوى معزز من التصور الأنسجة. الق?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.
Anti-Roll Plate, Assy. 70 mm 100 μm	Leica Biosystems	14041933980	Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'.
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.