一种从人类死后小脑中的激光捕获微解剖 purkinje 细胞中分离高质量 rna 的不锈钢协议

摘要

该协议采用无污渍的方法, 通过激光捕获微解剖, 将新鲜冷冻组织中的 purkinje 细胞从人类死后的小脑中观察和分离。该协议的目的是为 rna 测序生成足够数量的高质量 rna。

摘要

激光捕获显微解剖 (lcm) 是一个有利的工具, 允许收集细胞学和/或表型相关的细胞或区域从异质组织。捕获的产品可用于蛋白质、dna 或 rna 分离的多种分子方法。然而, 从死后的人类脑组织中保存 rna 尤其具有挑战性。lcm 的标准可视化技术需要组织或免疫组化染色程序, 可以进一步降解 rna。因此, 我们设计了一种用于 lcm 可视化的不锈钢协议, 其目的是在死后的人类脑组织中保持 rna 完整性。小脑的 purkinje 细胞是一个很好的选择, 不锈钢可视化, 由于其大小和特点的位置。小脑皮层具有不同的细胞密度层, 使其成为高放大显微镜下识别的良好原型。purkinje 细胞是位于颗粒细胞层 (即一个由小神经元组成的密被体细胞网络) 和分子层 (在细胞体中稀疏) 之间的大神经元。由于这种架构, 使用不锈钢可视化是可行的。其他模仿这种表型的器官或细胞系统也是合适的。该不锈钢协议旨在用乙醇固定新鲜冷冻组织, 并用二甲苯去除脂类, 以便在高放大光显微镜下进行形态可视化。该协议不包括其他固定方法, 是专门为使用紫外线 (uv)-lcm 系统采集的新鲜冷冻组织样本而设计的。在这里, 我们提出了一个完整的协议, 用于切片和固定新鲜冷冻的人类小脑组织和纯化 rna 从 purkinje 细胞分离的 uv-lcm, 同时保持 rna 质量, 以便随后的 rna 测序。在我们手中, 该协议产生了卓越的细胞可视化水平, 而不需要染色试剂, 并产生 rna 与高 rna 完整性数字 (≥8) 的转录分析实验所需的。

引言

激光捕获显微解剖 (lcm) 是一种有价值的研究工具, 可用于分离与病理相关的细胞, 以便随后进行分子驱动的评估。在这些异质组织标本中使用分子分析以及与病理和临床数据的相关性是评价生物研究转化意义的必要步骤¹。在分析来自 rna 的基因表达数据时, 强烈建议使用冷冻组织切片, 因为它允许出色的 rna 质量以及最大限度地^{提高2数量.}众所周知, 高质量和数量的 rna 对于来自 rna 测序³的有意义的数据至关重要。然而, 当使用来自新鲜冷冻尸检组织的 rna 进行 lcm 时, rna 降解是一个重大挑战, 因为它在死亡后立即发生, 其范围是由与组织收集方法^4,5 相关的各种因素介导的..此外, 当需要染色技术来识别组织学细节和细胞鉴定时, rna 降解会加剧。专门的染色技术, 如血红素 & eosin、nysl 染色、免疫荧光和免疫组织化学, 有助于区分细胞与周围的间质, 但已被证明可以降解 rna 并改变转录表达配置文件⁶。因此, 我们的实验室已经创建了一个不锈钢协议, 专门用于保存死后人类小脑中的 rna, 以便在 purkinje 神经元 lcm 分离后进行 rna 测序。

在处理新鲜冷冻组织的 lcm, 固定方法可以不同程度地影响 rna 和组织的完整性。福尔马林固定是形态保存的标准, 但引起交联, 可能会分裂 rna 并干扰 rna 扩增7。乙醇固定是 rna 分离的更好的替代品, 因为它是一种凝固性的固定剂, 不会诱导^交联1。为了增强组织形态的可视化效果, 二甲苯是最佳选择, 因为它能去除组织中的脂质。然而, 在 lcm 中使用二甲苯时, 有已知的局限性, 因为在激光捕获⁷时, 二甲苯会干涸并变得脆弱, 导致组织碎裂。二甲苯也是一种挥发性毒素, 必须在烟罩中妥善处理。然而, 二甲苯已被证明可以增强组织的可视化, 同时也保持 rna 的完整性⁸。因此, 我们的协议围绕70% 的乙醇固定和乙醇脱水的使用, 其次是二甲苯孵化的形态清晰度。

需要注意的是, 不同类型的基于激光的微解剖系统, 因为它们在速度、精度和 rna 质量方面已经被证明是不同的。红外 (ir) 激光捕获显微解剖和紫外 (uv) 激光微束显微解剖系统都是新颖的 lcm 平台, 几乎同时出现 8。ir-lcm 系统采用 "接触系统", 使用直接放置在组织部分的透明热塑性薄膜, 感兴趣的细胞通过红外激光的聚焦脉冲选择性地粘附在薄膜上。或者, uv-lcm 系统是一个 "非接触系统", 其中聚焦激光束切断细胞或区域的利益在组织;根据两个现有商业平台的配置, 使用倒置或垂直显微镜设计, 组织被激光诱导的压力波获取到采集设备中, 该压力波将其弹射到重力或组织上。分别由重力收集。uv-lcm 系统的显著优势包括更快的细胞采集、无接触式方法的无污染收集以及由于激光束直径^更小的9而进行更精确的解剖。该协议是专为 uv-lcm 系统设计的, 尚未在 ir-lcm 系统中进行测试。在 uv-lcm 系统设计中, 当细胞积累到收集盖时, 在显微镜下使用增强细胞清晰度的盖板是不合适的, 因为细胞将无法进入收集盖。因此, 为了增强组织可视化, 我们测试了不透明收集帽的使用, 该盖的设计目的是作为 uv-lcm 系统中微观可视化的盖板, 以防止液体填充收集盖。液体填充收集盖可能具有挑战性, 因为液体会蒸发, 并且在显微镜下工作时必须频繁更换。时间成为 rna 稳定性的一个重要因素, 因为捕获的组织会立即溶解⁷。

我们的实验室研究小脑死后的神经病理学变化, 即原发性震颤 (et) 和相关的小脑神经退行性疾病。我们已经证明了以 purkinje 细胞为中心的形态变化, 区分 et 病例和对照, 包括减少 purkinje 细胞的数量, 增加树突回归和各种轴突变化, 导致我们假设 purkinje细胞变性是 et 发病^{机制 10、11、12、13}的核心生物学特征。转录性分析已被用于许多神经疾病, 以探索潜在的分子基础退行性细胞变化。然而, 来自异质性样本 (如脑组织区域) 的转录谱可以有效地掩盖低丰度转录的表达, 或减少仅在少数受影响人群中发生的分子变化的检测细胞, 如小脑皮层中的 purkinje 细胞。例如, 由于小脑皮层丰富的颗粒细胞, purkinje 细胞的数量远远超过约 1:3000;因此, 要有效地靶向他们的转录组需要这些神经元的特定隔离。小脑皮层由不同的层, 不同的细胞密度和细胞大小来描绘。这种细胞结构是理想的可视化在新鲜冷冻组织样本没有含染料染色试剂。从理论上讲, 该协议也可应用于其他组织类型具有类似的独特组织组织。

该协议旨在专门用于人类死后小脑中的 purkinje 细胞可视化。许多协议存在于许多类型的组织的固定、染色可视化和 rna 保存方面, 用于 ir-lcm 和 uv-lcm。在考虑 uv-lcm 的实验设计时, 个人应根据启动和结束材料的需要和要求调整其协议。在这里, 我们结合不同的 lcm 协议的许多方面, 提供了一种增强的方法, 可视化 purkinje 细胞在死后的人小脑, 而不需要染料含有染色试剂准备高质量的 rna 转录组测 序。

研究方案

本议定书中使用的所有人体样本都是在知情同意的情况下获得的, 并得到了哥伦比亚大学和耶鲁大学内部审查委员会的批准。

请注意:该协议的全部内容应遵循严格的 rna 处理指南, 即始终使用戴手套的手, 使用 rnase 去污剂清洗所有表面, 所有工作材料均不含 rna/dna/nucolet。

1. 在启动 lcm 之前测试组织的 rna 完整性

请注意:测试 rna 质量可以通过多种方法完成。确保对整个部分的 rna 进行测试, 以便为样本提供具有代表性的 rna 完整性数字 (rin)。

1. 仔细选择符合实验设计参数的组织样本进行包含。如果在低温恒温器处切割, 请移动到步骤1.2。如果没有, 请对组织进行相应的处理, 并移动到步骤1.11。
2. 得到两个容器的干冰。大小将取决于样本的数量。
   1. 在第一个干冰容器中, 放置一个空的, 标记为2毫升管的组织代码。
      请注意:管冻结需要10分钟。在将组织放入管中之前, 必须将其冻结;否则, 组织会在管表面熔化。
   2. 在第二个干冰容器中, 将组织从-80°c 的冰柜中放置, 这需要 rna 检查。
3. 清洁低温恒温器。有关详细的清洁过程, 请参阅步骤4.7。
4. 从干冰中取出组织, 用 rnase 去污剃须刀片切一小块组织。组织的大小应为约1厘米 x 1 厘米。
5. 将一个约3毫米高的最佳切割温度 (oct) 化合物放在低温恒温器 "卡盘" 上, 使其部分冻结。然后, 将组织放置在 oct 的顶部--不要推入 oct, 只需让它停留在 oct 顶部即可。
6. oct 硬化后, 将带有安装组织的卡盘放在低温恒温器切割臂上, 并放置在低温刀片前面。
7. 在30μm 切片处修剪, 直到组织均匀。
8. 切割300μm 的组织, 并放置在冷冻的2毫升管中。将管子放回干冰中。
9. 从 "卡盘" 中取出组织, 放回干冰中, 直到准备收起来。
10. 对所有组织重复步骤1.4-1.9。
11. 一旦所有样本完成, 使用提供的 rna 提取试剂盒 (材料表#15) 提取 rna。详细的协议提供了 rna 提取试剂盒。按照所有说明, 包括可选步骤干燥收集管膜和 dnase 消化的可选步骤 (材料表#16)。
12. 通过质量评估生物分析仪¹⁴测试提取 rna 的完整性。

2. 在开始 lcm 的工作之前做好准备

1. 在 lcm 的每一轮组织切片之前, 请对幻灯片支架进行清洁。在使用前一天执行清洁程序, 以便在一夜之间完全干燥。
   注:滑动支架用于乙醇组织切片固定和二甲苯中的清除。
   1. 滑块支架清洗程序: 用 rnase 净化器冲洗, 然后用二乙基碳酸盐 (depc) 处理水。允许在无 rnaedna/nucolet 表面倒置一夜, 避免任何灰尘或其他空气污染。
      注意事项:depc 毒性很强, 应使用 eh & s 标准危险化学品协议进行处理和处置。
2. 用 rnase 去污器清洁用于切片的刷子, 并允许在夜间干燥。避免任何灰尘和其他污染物。
3. 将膜在紫外光下放置30分钟。使用前 1– 2天, 不要将幻灯片暴露在 uv 中。这增强了组织与膜滑块的结合。
   请注意:步骤2.3 可与步骤4结合使用, 允许在组织切片的同一天进行滑动紫外线处理 (请参阅步骤 4.4)。

3. 使用无 rnase 水和优质乙醇准备固定解决方案

请注意:所有的解决方案都是为每个实验准备的。确保步骤1.1 中的滑块支架清洁过程已完成。所有解决方案都是在幻灯片支架中准备好的。

1. 将30% 的100% 乙醇放入一个滑块支架中。
2. 用不含核酸酶的水稀释乙醇。将95% 乙醇的30毫升放入一个滑块支架中, 放在冰上。
3. 用不含核酸酶的水稀释乙醇。将70% 乙醇的30毫升放入一个滑梯支架中, 放在冰上。
4. 将30% 的100% 二甲苯放入两个独立的滑块支架中, 并将其标记为 #1 和 #2。

4. 准备用于组织切片的低温恒温器

1. 为乙醇溶液买一桶冰, 为组织买一个装有干冰的容器。
   注意事项:干冰非常冷, 所以要使用防护手套。不要把冰和干冰放在同一个容器里。冰和干冰中不同的温度会导致它们在不确定的温度下一起形成。
2. 从-80°c 的冰柜中取出组织, 放在干冰上, 输送到低温恒温器。
3. 低温恒温器设置:
   1. 将截面厚度设置为14μm。
   2. 将修剪厚度设置为30微米, 以保持组织数量。
   3. 对于双腔和样品保持温度的低温恒温器, 请将腔内温度 (ct) 设置为-18°c。对于具有一个设置的低温恒温器, 请将温度设置为-17°c。
   4. 对于双腔和试样保持温度的低温恒温器, 将物体温度 (ot) 设置为-16°c。
      请注意:ot 需要比 ct 更温暖, 以确保甚至切割。如果组织仍在切碎, ot 可增加到-15°c, ct 可增加到-18°c。
4. 将组织放入低温恒温器中至少 20分钟, 以便达到最佳温度。
   请注意:如果组织没有达到最佳温度, 切割时就会粉碎。不要将组织放置在-20°c 的前一天晚上, 以保持 rna 的完整性, 并防止冰晶的形成。根据需要, 让组织有尽可能多的时间平衡到最佳温度, 以顺利切割。在紫外线下可选择实施幻灯片孵化 (请参见步骤 1.3)。
5. 将 "卡盘" 放入低温恒温器中至少 20分钟, 以便降低低温恒温器的温度。
6. 将干净的刷子放在低温恒温器中至少 20分钟, 以便降低到低温恒温器的温度。
7. 清洁低温恒温器
   1. 用 1: 1 混合 rnase 去污剂和70% 乙醇, 用 nna\ dna/nucolet 无水稀释, 以防止在舞台上冻结, 从而清洁舞台。
   2. 使用 rnase 去污器清洗新的一次性低温恒温器刀片, 并将其放置在舞台上的刀片支架中。让低温恒温器刀片至少20分钟到达低温恒温器的温度。
   3. 用 rnase 去污器清洗防卷板, 并连接到舞台上。使防滚板至少有20分钟的时间达到低温恒温器的温度。
      请注意:切割时不需要防卷板, 但强烈建议使用。如果防卷板不可用, 则清洁的画笔可用于替代方法。如果防滚板在正确的温度下, 组织在切割时会融化或粘附。

5. 切片组织

1. 切割一小块组织 (约1厘米 x 1 厘米) 进行切片。将剩余的组织送回干燥的冰/80°c 的冰柜。
   请注意:确保组织部分是约95% 的小脑皮层, purkinje 细胞的位置。
2. 放置一个约3毫米高的 oct 土堆, 以覆盖 "卡盘"。首先, 以缓慢的圆周运动在顶部构建图层, 直到有一个小土堆。
3. 一旦 oct 部分冻结, 但仍有一些液体在中心, 把组织在 oct 的顶部。不要将组织深入 oct, 让组织坐在 oct 顶部, 直到完全冻结。这将需要1–2分钟。
4. 将 "夹头" 与冷冻 oct 和组织放入冷冻切割臂。调整组织, 使其与切割刀片齐平。
5. 让组织在切割臂中放置 15-20分钟, 以适应新的温度。
   请注意:根据组织的厚度, 温度适应需要时间。允许组织在需要的时间内坐着, 以清洁地切割。调整 ot 和 ct, 以协助组织温度适应。
6. 慢慢地将组织移动到离刀片更近的地方。一旦组织到达刀片, 开始修剪过程。修剪厚度应设置为30微米。
7. 修剪 2–3x, 直到皮层层可见。
8. 将防卷板放置在低温刀片的上方并对齐。
   请注意:在刀片和防滚板的界面上, 从低温恒温器中的光线中会出现一条银线。这表明防滚板直接在刀片边缘。
9. 开始在14微米处切割切片。正确的切割部分将在防卷板下平坦。
   请注意:如果组织卡住, 确保防滚板足够冷。如有必要, 将一块干冰放在外面 (侧面不接触舞台) 会迅速冷却防卷板。
10. 切割4–6节, 并在低温恒温器阶段水平对齐。
11. 扭动滑梯, 一次拿起所有的纸巾片。
    请注意:使用刷子, 抬起组织的两端, 以便在拿起时更容易用于幻灯片。不要一次拿一个部分。暴露在室温空气中会降低 rna 的完整性。
    注意事项:不要让膜接触低温恒温器的阶段。如果膜接触到舞台, 它将开始从玻璃滑块中分离, 并在尝试 lcm 时导致错误。
12. 立即移动到步骤6。不要延迟固定。

6. 修复无组织可视化

1. 立即转向乙醇固定协议
2. 将幻灯片放入带有70% 乙醇的滑块中, 用700分钟的时间 (在冰上)。
3. 将幻灯片放入带有95% 乙醇的滑块中 45秒 (在冰上)。
4. 将幻灯片放入带有100% 乙醇的幻灯片支架中, 用100% 乙醇进行 2分钟, 位于 rt。
5. 用二甲苯1在 rt 将幻灯片在滑梯支架中浸出3次。
6. 将幻灯片放入带有二甲苯2的幻灯片支架中 5分钟, 位于 rt 处。
7. 允许在清洁区域干燥至少 30分钟. 较长的干燥时间是最佳的, 最长60分钟。
   注意事项:站起来的幻灯片, 在通风柜干燥。二甲苯是挥发性的。平铺滑块会导致二甲苯聚集在组织部分, 从而导致组织太暗。

7. 可选-幻灯片存储

1. 将干燥的滑块放入单个50毫升管中 (每根管一张), 并放置在-80°c 的冰柜中, 最长可达7天。
   请注意:在将滑块放入-80°c 冰柜之前, 请务必干燥。不要在管内使用干燥剂, 因为颗粒会嵌入组织和膜中。确保管盖紧;否则, 在解冻使用时, 滑块上会发生冷凝。
   注意事项:7天后 rna 完整性下降, 组织可视化质量也随之下降。

8. 用于使用的解冻存储幻灯片

1. 在预定使用前 1小时, 用-80°c 冰柜中的一张幻灯片取出管道。
2. 不要立即打开管。让管子达到室温。冷凝仅发生在管的外部。
3. 一旦试管达到室温, 所有冷凝消失 (约 30-40分钟), 取下盖子, 将滑块暴露在室温空气中。
4. 让滑块适应室温 15-20分钟, 将滑块留在管内, 并取下盖子。
   请注意:幻灯片现在已准备好使用 lcm。

9. 激光捕获 purkinje 细胞的显微解剖:

请注意:该协议的这一部分将只讨论与捕获 purkinje 细胞以便随后进行 rna 测序有关的细节。本节假定用户熟悉 uv 激光捕获显微镜和附属软件。

1. 用 rnase 去污剂清洗显微镜和瓶盖收集臂。
2. 用戴手套的手, 将幻灯片放在显微镜上, 将500μl 不透明帽放在收集臂上。
   请注意:始终确保适当的 rna 技术, 使用 rnase 去污器清洁工作区域, 并在触摸滑梯或不透明的盖子时使用戴手套的手。一旦滑块和瓶盖就位, 激光捕获开始, 就可以拆除手套。
3. 在低放大倍率下, 将不透明的盖帽对准小脑组织, 确保盖覆盖眼片中的整个可视化区域。
   请注意:只有显微镜的眼片才会显示不透明的帽子是否居中。相机不会显示盖帽是否居中在组织上。根据激光拍摄示波器的设计, 通过不透明的帽子的可视化效果将仅在眼罩中, 也可在眼罩和相机中显示。
4. 使用 5倍-10倍物镜可视化小脑层, 并将光标放在分子层和颗粒细胞层相交的部分 (purkinje 细胞层)。
5. 移动到40x 并可视化 purkinje 细胞。
   请注意:有关可视化的示例, 请参见图 1和图 2 。
6. 开始捕获 purkinje 细胞。
   请注意:要进行 rna 测序, 至少需要5纳克的 rna。大约 1600–2000 purkinje 细胞产生足够的 rna 材料进行测序。在显微镜下, rna 将稳定长达8小时。在收集前测试紫外线能量和紫外线对焦, 以确保水平正确。随着时间的推移, 组织将继续干涸, 紫外线能量和紫外线焦点可能需要改变。

10. lcm 后的 rna 收集

1. 准备细胞裂解缓冲液 (每次准备新鲜)
   1. 在 1:100 (分别为 10μl:1 ml) 的裂解缓冲液中稀释 2-硫醇。裂解 (rlt) 缓冲液载于材料表(#14 和 #15)。
2. 在不透明的瓶盖中加入50μl 的细胞裂解缓冲液, 盖朝上。小心地将管子合上瓶盖。
3. 把管子倒过来1分钟。
4. 涡流管 30秒, 并快速将裂解缓冲液旋转到管的底部。
5. 重新打开管子, 重复步骤10.2–10.4。
6. 将含有100μl 的裂解缓冲液和从-80°c 冷冻机中提取 rna 的管放置, 直到所有样品都完成并准备好提取 rna (材料表#14)。

结果

该协议详细介绍了为 uv-lcm 准备新鲜冷冻死后人类脑组织的步骤。对低温恒温器切割给出了严格的规格和注释, 因为切割新鲜冷冻脑组织的精度可能很高。需要考虑的最重要的一点是, 新鲜的冷冻组织极其寒冷, 需要相当长的时间来适应低温恒温器的温度。这一步不能操之过急, 这一步在本协议的成败中的核心是多么的重要, 也不能强调。如果组织在低温恒温器处没有适当准?...

讨论

这里介绍的协议经过专门修改, 成为一种不锈钢方法, 用于直观-lcm 的形态上不同的组织的可视化。此方法旨在最大限度地提高 rna 完整性, 以便随后进行直接 rna 测序, 同时保持组织可视化水平的提高。能够区分不同的细胞类型进行捕获, 创造尽可能纯净的细胞群, 对于了解人体组织中的不同分子特征是必不可少的.在本协议的范围内, 组织选择是最重要的, 因为抗原或染料特异性试?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.
Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um	Leica Biosystems	14041933980	Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'.
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.