JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نصف نموذج التحصين في الجسم الحي ، والتهاب الكبد الانتقالي في الفئران BALB / c التي يمكن استخدامها لدراسة التسبب في التهاب الكبد المناعي الذاتي الناجم عن المخدرات بما في ذلك الاختلافات بين الجنسين التي شوهدت في هذا المرض. سنصف كيف يوضح هذا النموذج التحليلات القابلة للتكرار باستخدام التقنيات التجريبية في الجسم الحي وفي المختبر.

Abstract

التهاب الكبد المناعي الذاتي الناجم عن المخدرات (DIH) هو عملية فرط الحساسية الأكثر شيوعا التي يسببها الدواء الكبدي التي لوحظت في حوالي 9 إلى 12 ٪ من المرضى الذين يعانون من التهاب الكبد المناعي الذاتي. الغالبية العظمى من المرضى الذين يعانون من DIH هم من النساء. الآليات الكامنة وراء هذه الاختلافات بين الجنسين في الانتشار غير واضحة بسبب ندرة النماذج الحيوانية التي تحاكي الأمراض البشرية. ومع ذلك ، يعتقد على نطاق واسع أن الآليات الأساسية مرتبطة بالأنماط الفردية لمستضدات الكريات البيض البشرية والهرمونات الجنسية. في المقابل ، باستخدام نموذج فأر DIH ، اكتشفنا أن خلايا CD4 + T التي بدأت IL-4 موجهة ضد ظهارة من السيتوكروم P450 2E1 تحفز تدفق العدلات والبلاعم والخلايا البدينة إلى كبد الفئران BALB / c. باستخدام هذا النموذج ، أظهرنا أيضا أن الخلايا التائية FoxP3 + التنظيمية المستحثة ب IL-33 تمنح الحماية ضد DIH في الفئران الإناث والذكور. يتم تحفيز نموذج DIH هذا عن طريق تحصين الفئران ب CYP2E1 الذي تم تغييره تساهميا باستخدام مستقلب دوائي ارتبط ب DIH. يتم التعرف على هذا epitope من قبل المرضى الذين يعانون من DIH. طريقتنا تحفز التهاب الكبد القوي والقابل للتكرار والأجسام المضادة الذاتية التي يمكن استخدامها لدراسة التسبب في DIH. في حين أن الدراسات في الجسم الحي يمكن أن تسبب ألما وضيقا لا مبرر له في الفئران عند القيام به بشكل غير صحيح ، فإن ميزة نموذج في الجسم الحي هي القدرة على تقييم التسبب في المرض في عدد كبير من الفئران. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دراسة الآثار البيولوجية لبروتينات الكبد المتغيرة باستخدام الإجراءات الغازية. تسمح إضافة الدراسات في المختبر إلى التصميم التجريبي بالتكرار السريع والتحليل الميكانيكي على المستوى الخلوي. وبالتالي ، سنوضح بروتوكولنا النموذجي وكيف يمكن استخدامه للدراسة في الجسم الحي وفي آليات المختبر ل DIH.

Introduction

الغرض من هذه الطريقة هو وصف نموذج الفأر لالتهاب الكبد المناعي الذاتي الناجم عن المخدرات الذي يتطور في الجسم الحي وتوضيح كيف يمكن استخدامه للتحقيق في الأساس الجزيئي والمناعي والجيني لهذا المرض. الهدف طويل الأجل من دراساتنا هو الكشف عن الآليات المسؤولة عن تطور التهاب الكبد المزمن والإصابة من خلال دراسة DIH في المرضى المعرضين للخطر. تشكل أمراض الكبد وتليف الكبد سادس أكثر أسباب الوفاة شيوعا لدى البالغين الذين تتراوح أعمارهم بين 25 و 64 عاما. DILI الفريد ، الذي يشار إليه أحيانا باسم التهاب الكبد المناعي الذاتي الناجم عن المخدرات (DIH) هو السبب الثالث الأكثر شيوعا لفشل الكبد الحاد في الولايات المتحدة. DIH هي عملية فرط الحساسية الأكثر شيوعا التي يسببها الدواء الكبدي التي لوحظت في حوالي 9 إلى 12 ٪ من المرضى الذين يعانون من التهاب الكبد المناعي الذاتي1. الغالبية العظمى من المرضى الذين يعانون من DIH هم من النساء2،3،4. يتطور نوع من DIH في الأفراد المعرضين للإصابة بعد إعطاء التخدير المتطاير المهلجنة مثل الأيزوفلوران أو السيفوفلوران أو ديسفلوران أو الهالوثان. ترتبط هذه التخدير تساهميا ببروتينات الكبد مع المنتجات التفاعلية لعملية التمثيل الغذائي الخاصة بها ، وبالتالي خلق مستضدات ذاتية جديدة قادرة على إثارة استجابات الحساسية أو المناعة الذاتية5.

كانت دراسة الآليات المسببة للأمراض المشاركة في تطوير المخدر وأي شكل من أشكال DIH قد أعيقت سابقا بسبب عدم وجود نموذج حيواني يحاكي عن كثب تحريض الأمراض البشرية. لقد طورنا نموذجا تجريبيا للفئران من DIH مع ميزات تشبه DILI بوساطة المناعة في المرضى. يحدث التهاب الكبد عن طريق التحصين بأحد المستضددين الذاتيين اللذين تم تعديلهما تساهميا بواسطة مستقلب كلوريد ثلاثي فلورو أسيتيل (TFA) الذي يتشكل بعد التمثيل الغذائي التأكسدي للمخدر بواسطة إنزيم السيتوكروم P450 2E1 (CYP2E1)5. أحد المستضدات الذاتية هو جزء الكبد الكبدي S100 الخلوي ، وهو مزيج من عدة بروتينات6 ، والمستضد الذاتي الثاني هو ظهارة من CYP2E1 التي يتم التعرف عليها بواسطة الأمصال من المرضى الذين يعانون من DILI7 بوساطة المناعة المخدرة. باستخدام الفئران BALB / c ، التي تقاوم نسبيا التهاب الكبد المناعي الذاتي التجريبي ، نميز نموذجنا عن نموذج التحصين الناجم عن S100 لالتهاب الكبد المناعي الذاتي في الفئران C57Bl / 6J8.

بسبب عروضها السريرية المتنوعة ، يصعب دراسة DIH على المرضى. توفر النماذج التجريبية الانتقالية القدرة على تقييم التسبب في المرض في الجسم الحي وفي المختبر. في الوقت الحاضر ، لا توجد طرق بديلة أخرى لتحفيز DIH التي تدرس بالكامل في الجسم الحي أو في المختبر الاستجابات المناعية التكيفية أو الفطرية دون استخدام الحيوانات. علاوة على ذلك ، نظرا لأن ثلاثي فلورو أسيتيلات S-100 أو CYP2E1 epitope لا يبدو أنه ينتج مناعة مزعجة ، ونحن نحث DIH عن طريق التحصين بالبروتينات المعدلة بواسطة TFA ، فإن هذه الحيوانات لن تتلقى الأثير أو أي مخدر مهلجنة أو باربيتورات أو كحول قبل التحصين أو الإجراءات الأخرى ، مع الأخذ في الاعتبار أن هذه العوامل قد تغير المعلمات التي ندرسها. ومع ذلك ، فقد قللنا من استخدامنا للفئران من خلال استخدام المحاكاة الحاسوبية لتأكيد التفضيلات الملزمة ل CYP2E1 epitope9 المكتشفة لدينا وعكسنا DIH البشري الذي يورط الجنس الأنثوي من خلال إثبات أن الفئران BALB / c الإناث تطور DIH10 أكثر حدة.

على الرغم من العروض المتنوعة ل DIH في المرضى والتحديات في دراسة الأمراض السريرية ، فإن التعديل اللاحق للبروتينات الأصلية بواسطة مستقلبات الأدوية التفاعلية هو آلية رئيسية مقبولة في التسبب في DIH الذي يتبع التخدير المهلجنة11. يقبل المحققون أيضا أن CYP2E1 هو مستضد ذاتي رئيسي في هذه العملية12,13. إن دور خلايا الإنترلوكين (IL)-4-CD4 + T غير المنظمة التي تتعرف على CYP2E1 المعدل بعد الترجمة وبروتينات الكبد الأخرى هو مبادر مقبول ل DIH المخدر عن طريق جذب العدلات والحمضات والخلايا البدينة إلى الكبد14 ، وقد تم تأكيد هذه الآلية في أشكال عديدة من DIH15,16. تقلل الخلايا المستحثة التي تعبر عن FoxP3 CD4 + CD25 + T (Tregs) من شدة DIH ، وأوجه القصور النسبية لهذه الخلايا في الطحال تزداد سوءا DIH 10,7. وبالتالي ، فإن غالبية التقدم في فهم DIH قد أصبح ممكنا من خلال استخدام نماذج الفئران في الجسم الحي لتقييم الآليات الوراثية والأيضية والمناعية ل DIH في كل من الجسم الحي والمختبر.

نظرا لأننا اكتشفنا نحن والمحققون الآخرون أدوارا ل IL-4 والعدلات والحمضات في بدء DIH باستخدام نماذج مختلفة للفئران ، نعتقد أن هذه الملاحظة تدعم زعمنا بأنه بغض النظر عن نموذج DIH المستخدم ، فإن التهاب الكبد والإصابة يسببان بواسطة IL-4. تكمن قوة بروتوكولنا في استخدام منهجية في الجسم الحي ، سواء الفئران الذكور أو الإناث ، وتكرار علم الأنسجة ، واختبارات انتشار الخلايا التائية CD4 + والسيتوكينات. تكمن قوة استخدامنا للدراسات المخبرية في أنها تقلل من أعداد الفئران اللازمة مع توفير منهجية لعزل التفاعلات الخلوية التي تدفع DIH. نوصي باستخدام الفئران من الذكور والإناث لأن هذا يقلل من إمكانية التحيز اللاواعي في تفسير النتائج ويعزز إمكانات الترجمة لدراساتنا لأن حدوث وانتشار وشدة DIH أعلى لدى النساء17. نوصي بالحصول على الفئران من بائع واحد. ومع ذلك ، إذا لم يكن ذلك ممكنا ، فاحصل على عناصر تحكم في رفيقة القمامة أو الفئران من النوع البري من نفس البائع مثل الفئران المعدلة وراثيا.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات.

1. ثلاثي فلورو أسيتيلات البروتينات الخلوية الكبدية S-100 أو ظهارة CYP2E1

ملاحظة: أولا ، قم بإعداد S100 ثلاثي فلورو أسيتيلات (TFA-S100) و CYP2E1 ثلاثي فلورو أسيتيلات (TFA-JHDN5). لأن هناك حاجة إلى بروتينات S100 syngeneic للتحصينات ، والفئران BALB / c مطلوبة لإنتاج المولدات المناعية. التحضير ينتج كمية كبيرة من المناعة. لذلك ، توقع أداء هذا الجزء حوالي أربع مرات في السنة. سيتم استخدام طريقة مماثلة لصنع TFA-JHDN5. يمكن تسلسل أو شراء CYP2E1 epitope (JHDN5) ، GII / FNN / GPT / WKD / IRR / FSL / TTL.

  1. عزل جزء S100 من الكبد.
    1. بعد تخدير 5 - 10 فئران BALB / c مع 40-60 مجم / كجم من الكيتامين الممزوج ب 4 - 6 مجم / كجم من الزيلازين ، تأكد من عمق التخدير المناسب من خلال ملاحظة انخفاض في قوة العضلات وعدم الاستجابة للمحفزات المؤلمة ، مثل قرصة إصبع القدم (رد فعل الانسحاب) ، بالإضافة إلى فقدان ردود الفعل الصحيحة وفقدان ردود الفعل الجحفية.
    2. باستخدام مقص الجراحة المجهرية ، قم بكشف المحتويات داخل البطن باستخدام شق خط الوسط وقم بإجراء قطع صغير في الوريد الأجوف السفلي لإزالة الدم.
    3. ضع قسطرة وعائية قياس 24 في الوريد البابي وقم بدمج الكبد 10 مل / دقيقة مع 40 مل من الفوسفات الملحي المخزن مؤقتا (PBS) درجة الحموضة 7.4 في حمام مائي عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة ووزن الأكباد المجمعة وقطعها إلى قطع صغيرة (10 – 15 مم).
      ملاحظة: يتم تحفيز القتل الرحيم عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين / الزيلازين الإضافي (80 مجم / كجم: 8 مجم / كجم) ، يليه خلع عنق الرحم وفتح تجويف الصدر لانهيار الرئتين. توفر هذه الطريقة أقل قدر من الألم وعدم الراحة للحيوانات. وتتفق هذه الطريقة مع توصيات الفريق المعني بالقتل الرحيم التابع للجمعية الطبية البيطرية الأمريكية.
    4. أضف 4 أضعاف وزن السكروز (250 ملليمتر) -TRIS (10 ملليمتر)- EDTA (1 ملليمتر) مخزن مؤقت للتجانس (الرقم الهيدروجيني 7.4) مكمل بأقراص كوكتيل كاملة مثبطة للبروتياز (انظر جدول المواد) وفقا لتوصيات الشركات المصنعة. تجانس في أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 مل ، باستخدام مجانس أنسجة مختبر عام على سرعة متوسطة على الجليد حتى يصبح ناعما. تجانس على الجليد لمنع الأنسجة من أن تصبح دافئة أثناء التجانس.
    5. جهاز الطرد المركزي يتجانس الكبد عند 1500 × غرام لمدة 10 دقائق ثم يصب من supernatant. جهاز الطرد المركزي الفائق لمدة 1 ساعة عند 100000 × جم. التقط التجميد الفائق وخزنه عند -80 درجة مئوية. الخارق هو S-100 الخلوي.
  2. ثلاثي فلورو أسيتيلات S100 و JHDN5
    ملاحظة: سيتم إجراء إزالة ثلاثي فلورو أسيتيلات المجموعات الأمينية ε من بقايا ليسين S-100 وفقا لإجراء Satoh18. يتم تنفيذ جميع أجزاء هذه التجربة باستثناء الأيام الأخيرة من غسيل الكلى في غطاء الدخان.
    1. تحديد تركيز البروتين الكلي للسيتوسوليك S-100 باستخدام فحص حمض البيتشينكونينيك (BCA)7. تمييع 20 ملغ من BALB / c الماوس S100 أو JHDN5 إلى 10 مل مع dH2O في قارورة Erlenmeyer 50 مل. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 10 باستخدام 1N KOH.
    2. أضف 4.7 مليمول من S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) إلى المحلول. حافظ على درجة الحموضة بين 9.9 و 10.0 مع 1N KOH عن طريق إدارة KOH بطريقة قطرات لمدة ساعة واحدة تقريبا. سجل الحجم الإجمالي ل KOH لكل تفاعل.
    3. انقل المحاليل إلى أشرطة غسيل كلى منفصلة (لا تفرط في التعبئة). قم بتزيين الكاسيت لمدة 72 ساعة مقابل 4 لتر من dH2O مع ثلاثة تغييرات في اليوم. بعد غسيل الكلى ، سجل الحجم النهائي من TFA-S100 أو TFA-JHDN5 ثم aliquot في أنابيب ملصقة. التقط التجميد وخزنه عند -80 درجة مئوية.
    4. يتم تحديد التركيز المقدر عن طريق قسمة الكمية الأولية من S100 أو JHDN5 (بالملغ) على الحجم النهائي بعد غسيل الكلى (مل). لتحديد النسبة المئوية لتعديل البروتين الأصلي19 ، قم بتخفيف 1.0 ملغ من كل بروتين أصلي ومعدل TFA (إذا كان التركيز النهائي أكبر من 1.0 ملغ) إلى 1.0 مل مع dH 2 O في أنابيب رصاصة منفصلة وقم بإعداد فارغ باستخدام 1.0 مل dH2O. إذا كان تركيز البروتين المعدل TFA أقل من 1.0 ملغ ، فلا تخفف
      1. لفصل آبار صفيحة البئر 96 ، أضف 50 ميكرولتر من البروتينات الفارغة والأصلية والمعدلة. أضف 50 ميكرولتر من 4٪ NaHCO3 متبوعا ب 50 ميكرولتر من 0.1٪ 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid إلى كل بئر.
      2. احتضن اللوحة عند 40 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. بعد الحضانة ، أضف 50 ميكرولتر من 10٪ SDS إلى كل بئر متبوعا ب 25 ميكرولتر من 1N HCl.
      3. اقرأ عند OD من 334 نانومتر ثم سجل امتصاص كل مركب من 200 - 600 نانومتر من أجل تأكيد الانخفاض المميز في الامتصاص عند 334 نانومتر. احسب النسبة المئوية لتعديل بقايا الليسين بواسطة TFA، باستخدام الصيغة التالية:
        figure-protocol-4483

2. تحصين الفئران للحث على التهاب الكبد

ملاحظة: تم تصميم DIH في الفئران BALB / c عن طريق التحصين ببروتينات الكبد الخلوية التي تم تغييرها تساهميا بواسطة كلوريد ثلاثي فلوراسيتيل (TFA) ، وهو نموذج استقلاب دوائي ، TFA-S1006 أو ظهارة من CYP2E1 تم تغييرها تساهميا بواسطة TFA9 ، TFA-JHDN5 الذي يحفز التهاب الكبد ، والخلايا التائية ذاتية التفاعل ، والأجسام المضادة الذاتية CYP2E1. تظهر الفئران مرحلة تنشيط الطحال بعد 2 أسابيع من التحصين الأولي ومرحلة كبدية لمدة 3 أسابيع تتميز بالتهاب محبب. إناث الفئران BALB / c أكثر عرضة من الذكور لالتهاب الكبد في هذا النموذج.

  1. في اليوم 0 ، قم بتحصين الفئران BALB / c البالغة من العمر 6-8 أسابيع تحت الجلد في قاعدة الرقبة مع 200 ميكروغرام من TFA-S100 أو 100 ميكروغرام من TFA-JHDN5 المستحلب بكميات متساوية من مساعد فرويند الكامل (CFA). في اليوم 0 ، قم بتحصين الفئران ب 50 نانوغرام من سم السعال الديكي ، في العضل في إحدى الساقين الخلفيتين. في اليوم 7 ، قم بتحصين الفئران تحت الجلد في قاعدة الذيل إما ب 200 ميكروغرام من TFA-S100 أو 100 ميكروغرام من TFA-JHDN5 مستحلبة بكميات متساوية من CFA لضمان حصول كل فأر على حقنتين من نفس المولد المناعي.
    ملاحظة: تتم مراقبة الفئران كل ساعة لأول 6 ساعات بعد التحصين ثم مرتين يوميا على الأقل لمدة أسبوع واحد. إذا أظهرت الفئران علامات الألم أو الضيق ، مثل الموقف المنحني أو الفراء الكشكش ، فيجب إعطاء المسكنات وفقا ل ACUC المحلي. إذا لوحظ ألم أو ضيق كبير ، فيجب تقييم الفئران من قبل طبيب بيطري لتحديد ما إذا كان القتل الرحيم ضروريا.
  2. تحديد الاستجابات المناعية للخلايا التائية CD4+ للبروتينات الذاتية الكاملة أو ظواهر البروتينات الذاتية أو TFA hapten باستخدام قياس التدفق الخلوي
    1. بعد تخدير الفئران ب 40-60 ملغم / كغم من الكيتامين الممزوج ب 4-6 ملغم / كغم من الزيلازين عن طريق الحقن داخل الصفاق ، تأكد من العمق المناسب للتخدير كما هو موضح في الخطوة 1.1.1 ثم حدد الطحال بعد كشف التجويف داخل البطن باستخدام مقص الجراحة المجهرية. يقطع الطحال عند العنيق ويوضع في طبق بتري مع مصل ربلة الساق الجنينية PBS/2٪ (FCS).
      ملاحظة: سيتم تحفيز القتل الرحيم في الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين / زيلازين إضافية (80 ملغ / كغ: 8 ملغ / كغ) ، تليها خلع عنق الرحم وفتح تجويف الصدر لانهيار الرئتين. توفر هذه الطريقة أقل قدر من الألم وعدم الراحة للحيوانات. وتتفق هذه الطريقة مع توصيات الفريق المعني بالقتل الرحيم التابع للجمعية الطبية البيطرية الأمريكية.
    2. حرر الخلايا باستخدام شرائح زجاجية بلورية وانقلها إلى أنبوب بولي بروبيلين مخروطي 50 مل. اغسل باستخدام PBS / 2٪ FCS عن طريق رفع الحجم إلى 50 مل والطرد المركزي عند 335 × g باستخدام جهاز طرد مركزي مبرد على الطاولة. صب من supernatant وكرر هذه الخطوة.
    3. قم بإزالة الخلايا الحمراء باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت ACK Lysing لمدة دقيقة واحدة وارفع مستوى الصوت إلى 50 مل باستخدام PBS / 2٪ FCS. جهاز طرد مركزي في 335 × غرام وصب قبالة supernatant.
    4. عد الخلايا. قم بتسمية الخلايا ب CFSE لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تعليق تعليق خلية واحدة في 6 لوحات بئر من 3x106 خلايا / مل لكل بئر في PBS / 2٪ FCS.
    5. قم بتحفيز الخلايا المصنفة إما باستخدام CYP2E1 أو JHDN5 أو TFA-OVA (10 ميكروغرام / مل) لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 ، 95٪ هواء (رطب). بعد الحضانة ، قم بتلطيخ الخلايا باستخدام CD4-APC (1:100) لمدة 30 دقيقة على الجليد وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي في غضون 3 أيام.
    6. استخدم استراتيجية البوابة التالية لتحديد خلايا CD4 + CFSE +: سيتم تحديد خلايا CD4 + CFSE + من الخلايا الحية المسورة وعرضها كصور بيانية للخلايا التكاثرية.
  3. عزل الخلايا المناعية المتسللة عن الفئران المحصنة.
    1. لعزل الخلايا المناعية المتسللة في الكبد في اليوم 14 أو اليوم 21 ، قم بتخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق باستخدام 40-60 مجم / كجم من الكيتامين الممزوج ب 4-6 مجم / كجم من الزيلازين وتأكد من العمق المناسب للتخدير كما هو موضح في الخطوة 1.1.1. بعد بضع البطن باستخدام شق خط الوسط المصنوع من مقص جراحي دقيق كما هو موضح في 1.1.2 ، قم بتقليب الوريد البابي بإبرة قياس 25 ثم قم بقطع الوريد الأجوف السفلي أسفل الأوردة الكلوية.
    2. قم بدمج كل كبد بمعدل تدفق 10 مل / دقيقة مع 40 مل من PBS في حمام مائي 37 درجة مئوية. بعد التروية ، باستخدام مقص جراحي دقيق ، قطع الكبد في عنيق الكبد ، وإزالة المرارة ثم قطع الكبد في هيلوم.
    3. قم بتعطيل الكبد على غربال شبكي من الفولاذ المقاوم للصدأ باستخدام مدقة حقنة معقمة سعة 20 مل و PBS باردة. قم بتصفية تعليق الخلية الناتج إلى أنابيب طرد مركزي معقمة مسبقا بسعة 50 مل باستخدام شاشة شبكية 300. ارفع كل تعليق إلى 50 مل باستخدام PBS البارد ثم اغسل التعليق عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 370 × جم.
    4. تخلص من السوبرناتانت ثم قم بتجميع كل حبيبة عن طريق العلاج في أنابيب جديدة سعة 50 مل (يوصى بأنبوب واحد لكل ماوس ؛ ومع ذلك ، إذا تم تجميع العينات ، يوصى باستخدام 2-4 كريات / أنبوب). الكريات المجمعة في 45 مل بيركول 35٪ (في PBS) ، و 100 وحدة دولية / مل الهيبارين.
    5. قم بتدوير كل أنبوب عند 500 × جم لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية. تخلص من السوبرناتانت الكريات في 5 مل من PBS ثم أضف 1 مل من المخزن المؤقت ACK إلى كل حبيبة لمدة 10 دقائق على الجليد.
    6. اجلب كل أنبوب إلى 50 مل مع PBS واغسله بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 370 × جم. تخلص من المادة الفائقة ثم اغسل الخلايا باستخدام PBS / 2٪ FCS عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 370 × جم. عد الخلايا.
    7. تحليل نوع الخلية باستخدام قياس التدفق الخلوي
      ملاحظة: فيما يلي مثال على كيفية اكتشاف Foxp3 + Tregs المستحثة.
      1. احتضان 1x106 خلايا مع كاشف FcR المانع والبقع مع تخفيف 1:100 من CD4-FITC و CD25-PE و CD45-PerCP لمدة 30 دقيقة على الجليد. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الخلايا داخل الخلايا باستخدام FoxP3-APC.
      2. قم بإصلاح الخلايا التي تحتوي على 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثبيت (انظر جدول المواد) ، وتخزينها عند 4 درجات مئوية حتى يتم تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي في غضون 3 أيام.
      3. يوصى باستخدام استراتيجية البوابات التالية من أجل اكتشاف Foxp3 + Tregs المستحثة في معلقات الخلية الواحدة من الكبد أو الطحال أو الغدد الليمفاوية باستخدام قياس التدفق الخلوي: تحديد الخلايا الحية باستخدام مجموعة بقع الخلايا الميتة المائية الحية / الميتة القابلة للإصلاح. بعد ذلك ، قم ببوابة خلايا الكبد التي هي CD45 + (PerCP ، استنساخ RA3-6B2) ، وبوابة خلايا CD4 + (FITC ، cloneGK1.5) من بوابة CD45 +. من خلايا CD4+ ، حدد النسب المئوية لخلايا CD25 + (PE ، استنساخ 7D4) و FoxP3 + (APC ، استنساخ 3G3).
  4. التحليل النسيجي لأنسجة الكبد لالتهاب الكبد
    1. في اليوم 21 ، قم بإصلاح أقسام الكبد (بسماكة 5 ميكرومتر) في الفورمالين المخزن مؤقتا بنسبة 10٪ والبقع باستخدام الهيماتوكسيلين والإيوسين.
    2. تحديد درجات الأنسجة أولا في الطاقة المنخفضة (40X) في متوسط 2 وجهات النظر وتأكيد في 64X. سجل أقسام الأنسجة على النحو التالي: الصف 0 = لا التهاب أو نخر. الصف 1 = التهاب فصيصي طفيف مع عدم وجود نخر ؛ الصف 2 = التهاب فصيصي يشمل <50٪ من القسم ؛ الصف 3 = التهاب فصيصي يشمل ≥ 50 ٪ من القسم ؛ والصف 4 = التهاب مع نخر.
  5. تحديد مستويات السيتوكين في الأنسجة في الطحال والكبد.
    1. في اليوم 14 أو اليوم 21 ، قم بتجانس عينات الكبد أو الطحال (1 جم) من كل فأر في 1 مل من RPMI / 2٪ FCS حتى تصبح ناعمة باستخدام مجانس مختبر عام على إعداد متوسط. حافظ على العينة باردة على الجليد.
    2. قم بطرد المتجانس لمدة 15 دقيقة عند 1455 × g عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي مبرد. التقط التجميد الفائق وخزنه على درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام. يمكن قياس مستويات السيتوكين والكيموكين باستخدام مجموعات ELISA التجارية ، وفقا لتعليمات المجموعة. توحيد مستويات السيتوكينات عن طريق تحويل المستويات (بالمل أو الميكرولتر) إلى pg/g من الأنسجة.
  6. الكشف عن الأجسام المضادة في المصل ل CYP2E1 ، و CYP2E1 epitope JHDN5 ومستقلب الدواء TFA.
    1. في الأيام 14 أو 21 ، قم بتخدير الفئران ب 40-60 مجم / كجم من الكيتامين الممزوج ب 4-6 مجم / كجم من الزيلازين. تأكد من العمق المناسب للتخدير من خلال ملاحظة انخفاض في قوة العضلات وعدم الاستجابة للمحفزات المؤلمة ، مثل قرصة إصبع القدم (رد فعل الانسحاب) ، بالإضافة إلى فقدان ردود الفعل الصحيحة وفقدان ردود الفعل الجفية. استخدم إبرة 25 جم متصلة بحقنة السل واقترب من القلب عن طريق دفع الإبرة ببطء إلى التجويف الصدري تحت الأضلاع وعلى الفور إلى عملية الخنازير. جمع الدم باستخدام ثقب داخل القلب.
    2. بمجرد جمع الدم ، اتركه يتجلط في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي لعينات الدم عند 295 × g لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المصل بعناية ، وقم بإزالة الأمصال وتجمد المفاجئة عند -20 درجة مئوية.
    3. ضع 100 ميكرولتر من مستضدات اختبار CYP2E1 أو JHDN5 أو TFA-ovalbumin (OVA) (5 ميكروغرام / مل في PBS) على 96 لوحة بئر لمدة 18 ساعة على الأقل عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، اغسل الألواح بمخزن مؤقت للغسيل (PBS / 2٪ FCS) ، دورتان (4 غسلات لكل منهما).
    4. ضع 100 ميكرولتر من مصل الماوس (1:100) في PBS / 2٪ FCS في ثلاثة أضعاف على الألواح واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد ساعتين ، اغسل الألواح بمخزن مؤقت للغسيل كما هو موضح في الخطوة 2.6.2.
    5. أضف 100 ميكرولتر من الفوسفاتيز القلوي (AKP)-الماعز المضاد للفأر IgG أو AKP-rat المضاد للفأر IgG1 أو AKP-rat المضاد للفأر IgG2a الأجسام المضادة الثانوية (1:1000) لمدة 2 ساعة تليها خطوة غسيل من دورة واحدة مع المخزن المؤقت للغسيل ودورة واحدة مع PBS. اكتشف الأجسام المضادة باستخدام مجموعة ركيزة AKP وقم بقياسها عند OD 405 nm كل 15 دقيقة باستخدام مقياس الطيف الضوئي. عادة ما يتطور TFA بالكامل في غضون 15 دقيقة بينما يمكن أن يتطور CYP2E1 و CYP2E1 epitope من 30 إلى 60 دقيقة7.
  7. دراسات تطور الإجهاد التأكسدي الناجم عن JHDN5 IgG في المختبر.
    1. باستخدام 12 لوحة بئر ، احتضن 106 خلايا كبدية متمايزة نهائيا لكل بئر على زلات غطاء مغطاة بالفيبرونيكتين في 1000 ميكرولتر من وسائط Williams E المكملة بالجلوتامين والمكملات العامة (انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، 95٪ رطوبة لمدة 7 أيام على النحو الموصى به لزيادة نشاط CYP2E1 إلى أقصى حد.
    2. أضف JHDN5 IgG (1:40) أو الماوس IgG (1:1000) لفصل الآبار واحتضانها لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، رطوبة 95٪. كانت الأمصال الهجينة مخففة للغاية. أضف كاشف الأجسام المضادة الفلورية الحمراء العميقة (انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة إضافية إلى جميع الآبار.
    3. اغسل الآبار 3x مع 1 مل من PBS في الظلام. إصلاح الخلايا في 3.7 ٪ الفورمالديهايد لمدة 10 دقائق. فحص عن طريق المجهر البؤري في غضون 24 ساعة.
  8. دراسات التوطين المشترك ل JHDN5 IgG مع العضيات داخل الخلايا مثل الميتوكوندريا في المختبر.
    1. لإثبات التوطين المشترك ل JHDN5 IgG مع الميتوكوندريا ، فإن الثقافة المتناثرة (~ 30٪ التقاء) الخلايا الكبدية المتمايزة نهائيا على زلات الغطاء المغطاة بالفيبرونيكتين لمدة 7 أيام في وسائط ويليامز E الخالية من الصبغات المكملة كما هو موضح في الخطوة 2.7.
    2. بعد تحديد الأطوال الموجية الصحيحة للامتصاص ، أضف الفلورسنت الأخضر ، والماوس المترافق 488 نانومتر IgG أو JHDN-5 (1:100) والفلورسنت الأحمر ، 594 متعقب Mito المقترن الأحمر (1:100) لمدة 2 ساعة (37 درجة مئوية) ، 5٪ CO2 ، 95٪ رطوبة.
    3. قم بتركيب زلات الغطاء المغطاة بالفيبرونيكتين مع كاشف مضاد للتلاشي مع DAPI ، وفحصها بواسطة المجهر البؤري.

3. ملاحظات البروتوكول العامة

  1. استخدم أدوات الصف غير الصيدلانية عندما لا تكون المركبات متوفرة في تركيبة الاستخدام السريري. ومع ذلك ، احصل على كل من هذه الأدوات من موردين تجاريين موثوقين تم تحديدهم في هذه الطريقة. استخدم دائما المواد الكيميائية التي تتوافق مع المواصفات التي حددتها لجنة الكواشف التحليلية التابعة للجمعية الكيميائية الأمريكية على الأقل لمستوى درجة الكاشف. بالنسبة لأساليبنا ، استخدم كواشف مستوى الصف التحليلي كلما أمكن ذلك.
  2. اتبع تقنية تعقيم صارمة لصياغة البروتينات المعدلة بواسطة TFA من أجل منع التلوث الذي يمكن أن يؤثر سلبا على رفاهية الحيوان أو تفسير البيانات.
  3. قم بتخزين واستخدام التركيبات غير الصيدلانية في الفترات التي ستظل فيها التركيبة قوية ، وفقا للمعلومات التقنية المتاحة. قم بتخزين CFA في درجة حرارة الغرفة ، CYP2E1 وظلاله عند -20 أو -80 درجة مئوية. تخزين البروتينات المعدلة بواسطة TFA عند -80 درجة مئوية والسماح لها بالوصول إلى 4 درجات مئوية قبل الاستحلاب باستخدام CFA. تخزين البروتينات المعدلة TFA في -80 درجة مئوية وتخزينها في aliquots من أجل منع تكرار دورات التجميد والذوبان.

النتائج

يمثل جدول التحصين المستخدم للحث على DIH الموضح في الشكل 1 التحصينين المطلوبين في قاعدة الرقبة (اليوم 0) وقاعدة الذيل (اليوم 7). ويبين الشكل 2 بيانات الانتشار التمثيلية التي تم الحصول عليها في اليوم 14 باستخدام CFSE استجابة ل CYP2E1 و JHDN5 و CYP2E1 epitope ومستقلب ثلاثي فلورو أ...

Discussion

وتكمن قوة هذا البروتوكول في قابليته للتكرار؛ لذلك ، من الأهمية بمكان الالتزام بالخطوات المقترحة. صياغة المناعي يمكن أن يكون حاجزا للبعض. ومع ذلك ، قمنا بإعادة إنتاج نموذجنا باستخدام epitope الموصوف في وثيقتنا ، والذي يزيل الحاجة إلى عزل جزء S100 من الكبد. ومن المحتمل أن تكون هناك ظواهر أو بروتي?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

ويود الدكتور نجوكو أن يعرب عن تقديره للدكتور نويل روز، الحاصل على درجة الدكتوراه في الطب، على توجيهاته ومناقشاته الثاقبة التي أسفرت عن صياغة هذا النموذج.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)ThermoFisher28997
AKP Substrate KitBioRad172-1063
BALB/c miceJackson
CellTrace™ CFSE Cell Proliferation KitThermoFisherC34554
CFA H37RaBecton Dickinson (Difco Bacto)231131
FcR Blocking reagentMilteyi130-092-575
General supplementThermoFisherHPRG770
HepaRG™ cells cryopreservedThermoFisherHPR GC10
Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit ThermoFisherL34965
NaHC03Millipore SigmaS5761
Percoll®Millipore SigmaP1644-1L
Pertussis ToxinList Biologicals180
Phosphate Buffered Saline pH 7.4Various
Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA FreeThermoFisher88666
Potassium HydroxideJT Baker3140-01
S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA)Millipore Sigma177474
Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml)ThermoFisher66810
UltraPure™ SDS Solution, 10%ThermoFisher24730020
Williams Media E, no phenol redThermoFisherA1217601

References

  1. Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
  2. Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland. Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).
  3. Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge. Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).
  4. Czaja, A. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis. Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).
  5. Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).
  6. Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse. Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).
  7. Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity. Cellular and Molecular Immunology. , (2018).
  8. Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity. Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).
  9. McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis. mSphere. 3 (5), (2018).
  10. Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6. PLoS. One. 8 (4), 61186 (2013).
  11. Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).
  12. Eliasson, E., Kenna, J. G. Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis. Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).
  13. Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis. Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).
  14. Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury. European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).
  15. Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity. Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).
  16. Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice. Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).
  17. Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. Sexual dimorphism in autoimmunity. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).
  18. Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).
  19. Habeeb, A. F. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).
  20. Christen, U., Burgin, M., Gut, J. Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides. Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).
  21. Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid. European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159P450 2EFoxp3 Tregs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved