诱导BALB/c小鼠药物诱导的自身免疫性肝炎研究其致病机制

摘要

我们描述了BALB / c小鼠中的体内免疫，转化性肝炎模型，可用于研究药物诱导的自身免疫性肝炎的发病机制，包括该疾病中看到的性别差异。我们将描述该模型如何使用体内和体外实验技术演示可重复的分析。

摘要

药物诱发的自身免疫性肝炎 （DIH） 是最常见的肝药物诱导的超敏化过程，见于约 9% 至 12% 的自身免疫性肝炎患者。绝大多数 DIH 患者是女性。由于缺乏模仿人类疾病的动物模型，这些性别差异的患病率的潜在机制尚不清楚。即便如此，人们普遍认为潜在的机制与人类白细胞抗原单倍型和性激素有关。相比之下，使用DIH小鼠模型，我们发现IL-4启动的CD4 + T细胞直接针对细胞色素P450 2E1的表位诱导嗜中性粒细胞，巨噬细胞和肥大细胞流入雌性BALB / c小鼠的肝脏。使用该模型，我们还表明IL-33诱导的FoxP3 +调节性T细胞在雌性和雄性小鼠中具有针对DIH的保护作用。该DIH模型是通过用CYP2E1表位对小鼠进行免疫诱导的，该表位已与与DIH相关的药物代谢物共价改变。这种表位被 DIH 患者识别。我们的方法诱导稳健且可重复的肝炎和自身抗体，可用于研究DIH的发病机制。虽然体内研究在处理不当时会在小鼠中引起过度的疼痛和痛苦，但体内模型的优点是能够评估大量小鼠的疾病发病机制。此外，可以使用侵入性程序研究改变的肝脏蛋白质的生物效应。在实验设计中添加体外研究允许在细胞水平上进行快速重复和机械分析。因此，我们将演示我们的模型方案以及如何利用它来研究DIH的体内和体外机制。

引言

该方法的目的是描述在体内发展的药物诱导的自身免疫性肝炎的小鼠模型，并证明如何利用它来研究这种疾病的分子，免疫学和遗传基础。我们研究的长期目标是通过研究易感患者的DIH来揭示导致慢性肝脏炎症和损伤发展的机制。肝病和肝硬化是25至64岁成年人的第六大常见死因。特异质性 DILI，有时也称为药物诱发的自身免疫性肝炎 （DIH），是美国急性肝功能衰竭的第三大常见病因。DIH 是最常见的肝药物诱导的超敏化过程，见于约 9% 至 12% 的自身免疫性¹ 型肝炎患者。绝大多数 DIH 患者是^{女性 2，3，4}。一种类型的DIH在给予卤化挥发性麻醉剂（例如异氟醚，七氟醚，去氟醚或氟烷）后在易感个体中发展。这些麻醉剂与其代谢的反应产物共价结合肝脏蛋白，从而产生能够引起过敏或自身免疫反应的新型自身抗原⁵。

对参与麻醉剂和任何形式的DIH发展的致病机制的研究以前一直受到缺乏密切模仿人类疾病诱导的动物模型的阻碍。我们开发了一种实验性的DIH小鼠模型，其特征类似于患者免疫介导的DILI。肝炎是通过用两种自身抗原之一的免疫诱导的，这两种自身抗原已被三氟乙酰氯（TFA）代谢物共价修饰，该代谢物是在细胞色素P450 2E1（CYP2E1）⁵的麻醉剂氧化代谢后形成的。一种自身抗原是肝细胞质 S100 肝脏部分，它是几种蛋白质⁶ 的混合物，第二种自身抗原是 CYP2E1 的表位，由麻醉免疫介导的 DILI⁷ 患者的血清识别。通过使用对实验性自身免疫性肝炎相对耐药的BALB / c小鼠，我们将我们的模型与C57Bl / 6J小鼠⁸中S100诱导的自身免疫性肝炎免疫模型区分开来。

由于其临床表现的多样性，DIH很难在患者中研究。转化实验模型提供了在体内和体外评估疾病发病机制的能力。目前，没有其他诱导DIH的替代方法可以在不使用动物的情况下充分检查体内或体外适应性或先天性免疫反应。此外，由于S-100或CYP2E1表位的三氟乙酰化似乎不会产生刺激性免疫原，并且我们通过用TFA改变的蛋白质免疫来诱导DIH，因此这些动物在免疫或其他程序之前不会接受乙醚，任何卤化麻醉剂，巴比妥酸盐或酒精，考虑到这些药物可能会改变我们正在研究的参数。即便如此，我们通过利用计算机模拟来确认我们发现的CYP2E1表位⁹ 的结合偏好，并通过证明雌性BALB / c小鼠发展出更严重的DIH¹⁰来镜像涉及女性性别的人类DICH，从而减少了小鼠的使用量。

尽管 DIH 在患者中有不同的表现形式，并且在临床疾病研究中面临挑战，但反应性药物代谢物对天然蛋白的翻译后修饰是卤化麻醉剂¹¹ 之后的发病机制 DIH 中公认的关键机制。研究人员还承认CYP2E1是这一过程中的主要自原^12，13。识别翻译后修饰的CYP2E1和其他肝脏蛋白的白细胞介素（IL）-4-上调CD4 + T细胞的作用是通过吸引嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞和肥大细胞进入肝脏¹⁴来接受麻醉DIH的引发剂，并且该机制已在许多形式的DIH^15，16中得到证实。诱导表达FoxP3的CD4 + CD25 + T细胞（Tregs）可降低DIH的严重程度，并且脾脏中这些细胞的相对缺乏会恶化DIH ^10，7。因此，通过利用体内小鼠模型评估DIH在体内和体外的遗传，代谢和免疫机制，已经使理解DIH的大多数进展成为可能。

由于我们和其他研究人员已经发现了IL-4，嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞在使用不同的小鼠模型启动DIH中的作用，我们相信这一观察结果支持了我们的论点，即无论使用DIH模型，肝炎和损伤都是由IL-4诱导的。我们方案的优势在于利用体内方法，包括雄性和雌性小鼠，以及重复组织学，CD4 + T细胞增殖测定和细胞因子。我们使用体外研究的优势在于，它们减少了所需的小鼠数量，同时提供了分离驱动DIH的细胞相互作用的方法。我们建议使用雄性和雌性小鼠，因为这降低了在解释结果时出现无意识偏倚的可能性，并增强了我们研究的转化潜力，因为DIH的发病率，患病率和严重程度在女性¹⁷中更高。我们建议从单一供应商处获得鼠标;然而，如果这是不可能的，从与转基因小鼠相同的供应商处获得窝交配对照或野生型小鼠。

研究方案

所有程序均由动物护理和使用委员会批准。

1. 肝 S-100 胞质蛋白或 CYP2E1 表位的三氟乙酰化

注意:首先，制备三氟乙酰化S100（TFA-S100）和三氟乙酰基化CYP2E1表位（TFA-JHDN5）。因为免疫需要同源S100蛋白，并且需要BALB / c小鼠来产生免疫原。该制剂产生大量的免疫原;因此，预计每年执行此部分大约四次。将使用相同的方法来制造TFA-JHDN5。环氧乙烷2E1表位（JHDN5），GII/ FNN / 英国储备金/西九加/ 内部勘测/自由交易体系/三氟碳纳米管反洗钱/三通电阻，可以进行测序或购买。

1. 分离肝脏的S100部分。
   1. 在用40-60mg / kg氯胺酮与4-6mg / kg甲苯噻嗪混合的5-10 BALB / c小鼠镇静后，通过观察肌肉张力的减少和对疼痛刺激（例如脚趾捏（戒断反射）无反应）以及纠正反射丧失和睑反射丧失来确认适当的麻醉深度。
   2. 使用显微外科剪刀，使用中线切口暴露腹腔内内容物，并在下腔静脉中做一个小切口以除去血液。
   3. 将24号血管导管放入门静脉中，并在4°C的水浴中将40mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4灌注肝脏10mL / min。 取出并称量混合的肝脏，并将其切成小块（10 - 15毫米）。
      注意:腹膜内注射额外的氯胺酮/甲苯噻嗪（80mg / kg:8mg / kg），然后颈椎脱位并打开胸腔使肺部塌陷而诱导安乐死。这种方法为动物提供了最小的疼痛和不适。这种方法符合美国兽医协会安乐死小组的建议。
   4. 根据制造商的建议，加入4倍于蔗糖（250 mM）-TRIS（10mM）-EDTA（1mM）均质缓冲液（pH 7.4）的重量，并补充完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（见 材料表）。在15 mL聚丙烯管中均质化，使用一般实验室组织均质机在冰上以中速搅拌直至光滑。在冰上均质化以防止组织在均质过程中变热。
   5. 将肝脏以1500× g 离心匀浆10分钟，然后倒出上清液。将上清液以100，000×g离心1小时。快速冷冻上清液并储存在-80°C。 上清液为胞质S-100。
2. S100 和 JHDN5 的三氟乙酰化反应
   注意:S-100赖氨酸残基的ε氨基的三氟乙酰化将按照Satoh¹⁸的程序进行。除透析后期外，该实验的所有部分都在通风橱中进行。
   1. 使用双新春酸测定（BCA测定）测定胞质S-100的总蛋白质浓度⁷。在 50 mL 锥形瓶中将 20 mg BALB/c 小鼠 S100 或 JHDN5 稀释至 10 mL，dH₂O。用1N KOH将pH值调节至10。
   2. 向溶液中加入4.7毫米的S-乙基三氟硫代乙酸酯（S-ETFA）。通过以液滴方式施用KOH约1小时，将pH值保持在9.9 – 10.0之间，并给予1N KOH。记录每个反应的KOH总体积。
   3. 将溶液转移到单独的透析盒中（不要过量填充）。将暗盒透析72小时，对4升dH₂O，每天更换三次。透析后，记录TFA-S100或TFA-JHDN5的最终体积，然后等分试样到标记的试管中。快速冷冻并储存在–80°C。
   4. 通过将S100或JHDN5的初始量（以毫克为单位）除以透析后的最终体积（mL）来确定估计浓度。为了确定天然蛋白¹⁹的修饰百分比，在单独的子弹管中用dH₂O将每种天然和TFA改变的蛋白质的1.0mg（如果最终浓度大于1.0mg）稀释至1.0mL，并使用1.0 mL dH₂O制备空白。如果TFA改变的蛋白质的浓度小于1.0毫克，不要稀释
      1. 为了分离96孔板的孔，加入50μL空白，天然和改变的蛋白质。向每个孔中加入50μL4%NaHCO₃ ，然后加入50μL0.1%2，4，6-三硝基苯磺酸。
      2. 将板在40°C孵育2小时。孵育后，向每个孔中加入50μL10%SDS，然后加入25μL1N HCl。
      3. 在334nm的OD下读取，然后记录200 – 600nm范围内每种化合物的吸光度，以确认334nm处吸光度的特征下降。使用以下公式计算TFA对赖氨酸残基的修饰百分比:
         

2. 小鼠免疫诱发肝炎

注意:DIH在BALB / c小鼠中通过用肝细胞质蛋白进行免疫来建模，这些蛋白已被三氟乙酰氯（TFA），模型药物代谢物TFA-S100⁶ 或CYP2E1的表位共价改变TFA⁹，TFA-JHDN5诱导肝炎，自身反应性T细胞和CYP2E1自身抗体。小鼠在初始免疫后2周表现出脾活化阶段，在3周时表现出肝期，其特征在于粒细胞炎症。在该模型中，雌性BALB / c小鼠比雄性更容易感染肝炎。

1. 在第0天，用200μgTFA-S100或100μgTFA-JHDN5乳化在等体积的完全弗氏佐剂（CFA）中，在颈部底部皮下免疫6-8周龄的BALB / c小鼠。在第0天，用50ng百日咳毒素对小鼠进行免疫，在其中一条后腿肌内注射。在第7天，用200μgTFA-S100或100μgTFA-JHDN5乳化在等体积的CFA中，皮下在尾巴底部对小鼠进行免疫，以确保每只小鼠接受两次相同的免疫原注射。
   注意:在免疫接种后的前6小时内每小时监测一次小鼠，然后每天至少监测两次，持续一周。如果小鼠表现出疼痛或痛苦的迹象，例如驼背的姿势或褶皱的皮毛，应根据当地的ACUC施用镇痛药。如果注意到明显的疼痛或痛苦，应由兽医评估小鼠以确定是否需要安乐死。
2. 使用流式细胞术测定CD4 + T细胞对整个自身蛋白，自身蛋白表位或TFA半抗原的免疫反应
   1. 通过腹膜注射用40-60mg / kg氯胺酮与4-6mg / kg甲苯噻嗪混合的小鼠镇静后，按照步骤1.1.1所述确认适当的麻醉深度，然后使用显微外科剪刀暴露腹腔后识别脾脏。切开椎弓根处的脾脏，放入装有PBS / 2%胎牛血清（FCS）的培养皿中。
      注意:腹膜内注射额外的氯胺酮/甲苯噻嗪（80mg / kg:8mg / kg），然后颈椎脱位并打开胸腔使肺塌陷，从而在小鼠中诱导安乐死。这种方法为动物提供了最小的疼痛和不适。这种方法符合美国兽医协会安乐死小组的建议。
   2. 使用磨砂载玻片释放细胞并转移到50 mL锥形聚丙烯管中。用PBS/2%FCS洗涤，将体积提高到50 mL，并使用台式冷冻离心机以335 x g 离心。倒出上清液并重复此步骤。
   3. 使用1 mL ACK裂解缓冲液除去红细胞1分钟，并用PBS / 2%FCS使体积高达50 mL。以335× g 离心并倒出上清液。
   4. 对细胞进行计数。按照制造商的说明，在黑暗中用CFSE标记细胞30分钟。将单细胞悬浮液悬浮到PBS / 2%FCS中每孔3x10 6个细胞/ mL的⁶ 孔板中。
   5. 用CYP2E1，JHDN5或TFA-OVA（10μg/ mL）在37°C下在5%CO 2，95%空气（加湿）中刺激标记的细胞₇₂小时。孵育后，用CD4-APC（1:100）在冰上染色细胞30分钟，并在3天内用流式细胞术分析。
   6. 利用以下门控策略来鉴定CD4 + CFSE +细胞:CD4 + CFSE +细胞将从门控活细胞中鉴定出来，并显示为增殖细胞的直方图。
3. 从免疫小鼠中分离浸润的免疫细胞。
   1. 为了在第14天或第21天分离肝脏中浸润的免疫细胞，通过腹膜内注射用40-60mg / kg氯胺酮与4-6mg / kg木拉嗪混合麻醉小鼠，并确认步骤1.1.1中所述的麻醉深度。使用1.1.2中所述的用微手术剪刀制成的中线切口进行剖腹手术后，用25号针头囊状静脉穿刺，然后切除肾静脉下方的下腔静脉。
   2. 在37°C的水浴中以10 mL / min的流速与40 mL PBS一起灌注每个肝脏。 灌注后，使用微手术剪刀切开肝蒂处的肝脏，取出胆囊，然后在肺门处切开肝脏。
   3. 使用20 mL无菌注射器杵和冷PBS在网状不锈钢筛上破坏肝脏。使用300目筛将产生的细胞悬浮液过滤到50 mL预灭菌的离心管中。使用冷PBS将每个悬浮液降至50mL，然后通过以370×g离心10分钟来洗涤悬浮液。
   4. 弃去上清液，然后通过处理将每个沉淀池入新的50 mL管中（建议每只小鼠一个管，但是，如果样品合并，建议使用2-4个沉淀/管）。将混合的沉淀悬浮在45 mL珍珠棉35%（PBS）和100 IU / mL肝素中。
   5. 在20°C下以500×g旋转每个管10分钟。 弃去上清液并将沉淀悬浮在5mL PBS中，然后将1mLACK裂解缓冲液加入每个沉淀中，在冰上放置10分钟。
   6. 将每个管与PBS一起带到50 mL，并以370×g离心10分钟。弃去上清液，然后用PBS / 2%FCS以370×g离心10分钟洗涤细胞。对细胞进行计数。
   7. 使用流式细胞术分析细胞类型
      注意:以下是如何检测诱导的Foxp3 + 特雷格的示例。
      1. 用FcR阻断试剂孵育1x10⁶ 个细胞，并用1:100稀释的CD4-FITC，CD25-PE和CD45-PerCP染色30分钟。接下来，用FoxP3-APC在细胞内染色细胞。
      2. 用250μL固定缓冲液固定细胞（参见 材料表），并储存在4°C，直到3天内通过流式细胞术分析。
      3. 建议使用流式细胞术检测来自肝脏、脾脏或淋巴结的单细胞悬浮液中诱导的 Foxp3+Tregs 的门控策略:使用活/死固定水死细胞染色试剂盒鉴定活细胞。接下来，对 CD45+（PerCP，克隆 RA3-6B2）的肝细胞进行门控，并对来自 CD45+ 门的 CD4+ 细胞（FITC、克隆 GK1.5）进行门控。从CD4 +细胞中，鉴定CD25 +（PE，克隆7D4）和FoxP3 +（APC，克隆3G3）细胞的百分比。
4. 肝组织对肝炎的组织学分析
   1. 在第21天，将肝脏切片（5μm厚）固定在10%中性缓冲福尔马林中，并用苏木精&EOSIN染色。
   2. 在平均 2 次查看中，首先在低功率 （40X） 下确定组织学评分，并在 64X 时确认。组织切片评分如下:0级=无炎症或坏死;1级=轻微小叶炎症，无坏死;2级=小叶炎症，涉及<50%的切片;3级=小叶炎症，累及≥50%的切片;和4级=炎症伴坏死。
5. 测定脾脏和肝脏中的组织细胞因子水平。
   1. 在第14天或第21天，将每只小鼠的肝脏或脾脏样品（1g）在1 mL RPMI / 2%FCS中均质化，直到在培养基设置上使用一般实验室均质器使其光滑。将样品放在冰上冷藏。
   2. 使用冷冻台式离心机在4°C下以1455×g离心匀浆15分钟。快速冷冻上清液并储存在-80°C直至准备使用。细胞因子和趋化因子水平可以使用商用ELISA试剂盒根据试剂盒说明进行测量。通过将细胞因子的水平（以mL或μL为单位）转换为组织的pg / g来标准化细胞因子的水平。
6. 检测血清抗体，以检测细胞介苗2E1，CYP2E1表位JHDN5和TFA药物代谢物。
   1. 在第14天或第21天，用40-60mg / kg氯胺酮与4-6mg / kg甲苯噻嗪混合镇静小鼠。通过观察肌肉张力的降低和对疼痛刺激（如脚趾捏（戒断反射））无反应，以及矫正反射的丧失和睑下反射的丧失，确认麻醉的深度。利用连接到结核菌素注射器上的25G针头，通过将针头缓慢推进到肋骨下方的胸腔并立即向剑突外侧来接近心脏。使用心内穿刺收集血液。
   2. 一旦血液被收集，让它在室温下凝结。在室温下以295× g 离心血液样品20分钟。小心地除去血清，等分血清并在-20°C下快速冷冻。
   3. 将100μLCYP2E1，JHDN5或TFA-卵清蛋白（OVA）测试抗原（PBS中为5μg/ mL）施用于96孔板中，在4°C下至少18小时过夜。第二天，用洗涤缓冲液（PBS / 2%FCS）洗涤板，2个周期（每个循环4次洗涤）。
   4. 在PBS / 2%FCS中一式三份在平板上施用100μL小鼠血清（1:100），并在室温下孵育2小时。2小时后，按照步骤2.6.2中所述，用洗涤缓冲液洗涤板。
   5. 加入100μL碱性磷酸酶（AKP）-山羊抗小鼠IgG，AKP-大鼠抗小鼠IgG1或AKP-大鼠抗小鼠IgG2a二抗（1:1000）2小时，然后用洗涤缓冲液洗涤1个周期和1个周期的PBS洗涤步骤。使用AKP底物试剂盒检测抗体，并用分光光度计每15分钟在OD 405nm处测量一次。TFA通常在15分钟内完全发展，而CYP2E1和CYP2E1表位可以在30至60分钟内7^发展。
7. 研究JHDN5 IgG诱导的体外氧化应激的发展。
   1. 使用12孔板，在1000μL补充谷氨酰胺和一般补充剂（参见材料表）的1000μL威廉姆斯E培养基中，在37°C，5%CO₂，95%湿度下，每孔孵育10⁶个终末分化的肝细胞，以达到7天的推荐值，以最大限度地提高CYP2E1活性。
   2. 加入JHDN5 IgG（1:40）或小鼠IgG（1:1000）以分离孔并在37°C，5%CO 2，95%湿度下孵育₂小时。杂交瘤血清非常稀释。向所有孔中加入深红色荧光抗体检测器（参见 材料表）30分钟。
   3. 在黑暗中用1 mL PBS洗涤孔3x。将细胞固定在3.7%甲醛中10分钟。在24小时内通过共聚焦显微镜检查。
8. JHDN5 IgG与细胞内细胞器（如线粒体）的体外共定位研究。
   1. 为了证明JHDN5 IgG与线粒体的共定位，在纤连蛋白覆盖的覆盖物上稀疏培养（〜30%汇合）终末分化的肝细胞在无染料的威廉姆斯培养基E中滑移7天，如步骤2.7中所述。
   2. 确定正确的吸收波长后，加入绿色荧光，488nm共轭小鼠IgG或JHDN-5（1:100）和红色荧光，594共轭水母跟踪器红色（1:100）2小时（37°C），5%CO₂，95%湿度。
   3. 使用带有DAPI的抗褪色试剂安装标记的纤连蛋白覆盖的盖玻片，并通过共聚焦显微镜检查。

3. 一般协议说明

1. 当临床使用配方中没有化合物时，请使用非药物级工具。但是，从此方法中确定的可靠商业供应商处获取这些工具中的每一个。始终使用符合美国化学学会分析试剂委员会定义的至少试剂级规格的化学品。对于我们的方法，请尽可能使用分析级试剂。
2. 遵循严格的无菌技术来配制TFA改变的蛋白质，以防止可能对动物福利或数据解释产生不利影响的污染。
3. 根据可用的技术信息，在制剂保持效力的持续时间内储存和使用非医药级制剂。将CFA储存在室温下，CYP2E1及其表位在-20或-80°C。 将TFA改变的蛋白质储存在-80°C，并在用CFA乳化之前使其达到4°C。将TFA改变的蛋白质储存在-80°C并储存在等分试样中，以防止重复冻融循环。

结果

图1所示用于诱导DIH的免疫计划代表了颈部底部（第0天）和尾巴底部（第7天）所需的两次免疫接种。图2显示了使用CFSE响应CYP2E1，JHDN5，CYP2E1表位和麻醉剂的三氟乙酰基（TFA）代谢物在第14天获得的代表性增殖数据。图3显示了第14天获得的诱导CD4 + CD25 + FoxP3 + Tregs的门控策略和代表性流式细胞术分析。图4显示?...

讨论

该协议的优势在于其可重复性;因此，遵守建议的步骤至关重要。免疫原的配方对某些人来说可能是一个障碍;然而，我们已经使用文档中描述的表位重现了我们的模型，这消除了分离肝脏S100部分的需要。额外的表位或蛋白质很可能被改变，并在免疫接种后诱发肝炎;然而，我们描述了那些我们已经使用的蛋白质，并获得了可靠的结果。几种蛋白质已被证明在卤化麻醉剂暴露时是三氟乙酰化的。最有...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)	ThermoFisher	28997
AKP Substrate Kit	BioRad	172-1063
BALB/c mice	Jackson
CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit	ThermoFisher	C34554
CFA H37Ra	Becton Dickinson (Difco Bacto)	231131
FcR Blocking reagent	Milteyi	130-092-575
General supplement	ThermoFisher	HPRG770
HepaRG™ cells cryopreserved	ThermoFisher	HPR GC10
Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit	ThermoFisher	L34965
NaHC03	Millipore Sigma	S5761
Percoll®	Millipore Sigma	P1644-1L
Pertussis Toxin	List Biologicals	180
Phosphate Buffered Saline pH 7.4	Various
Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free	ThermoFisher	88666
Potassium Hydroxide	JT Baker	3140-01
S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA)	Millipore Sigma	177474
Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml)	ThermoFisher	66810
UltraPure™ SDS Solution, 10%	ThermoFisher	24730020
Williams Media E, no phenol red	ThermoFisher	A1217601