أوبسونوفاجوسيتيك قتل المقايسة لتقييم الاستجابات المناعية ضد مسببات الأمراض البكتيرية

Summary

هذا الإنزيم قتل أوبسونوفاجوسيتيك يستخدم لمقارنة قدرة الخلايا المناعية متجولة التجاوب وتقتل البكتيريا التي تستند إلى معالجات مختلفة و/أو شروط. كلاسيكي، هذا التحليل بمثابة المعيار الذهبي لتقييم الوظائف المستجيب للأجسام المضادة التي أثيرت ضد بكتيريا طاهية.

Abstract

أحد جوانب رئيسية للاستجابة المناعية للاستعمار الجرثومي للمضيف هو البلعمه. مقايسة قتل أوبسونوفاجوسيتيك (أوبكا) هو إجراء تجريبية التي خلايا متجولة مثقف يشترك مع وحدات البكتيرية. وسوف phagocytose الخلايا المناعية وقتل الثقافات البكتيرية بطريقة تعتمد على تكملة. كفاءة قتل الخلايا المناعية بوساطة يعتمد على عدد من العوامل، ويمكن استخدامها لتحديد البكتيريا المختلفة كيفية مقارنة الثقافات فيما يتعلق بالمقاومة لموت الخلايا. وبهذه الطريقة، يمكن تقييم فعالية العلاجات المحتملة المستندة إلى المناعة ضد السلالات البكتيرية محددة و/أو اللقاح. في هذا البروتوكول، يصف لنا أوبكا مبسطة التي تستخدم شروط الثقافة الأساسية وخلية العد لتحديد صلاحية الخلايا البكتيرية بعد ثقافة المشارك مع ظروف العلاج و HL-60 الخلايا المناعية. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح مع عدد من اللقاح المكوّرات الرئوية مختلفة، الحافظة وسلالات أكابسولار، وغيرها من الأنواع البكتيرية. مزايا هذا البروتوكول أوبكا هي بساطته، براعة (كما لا يقتصر هذا الفحص على العلاجات جسم أوبسونينس)، والتقليل إلى أدنى حد من الوقت والمواد الكاشفة لتقييم المجموعات التجريبية الأساسية.

Introduction

أوبسونوفاجوسيتيك مما أسفر عن مصرع الإنزيم (أوبكا) أداة حاسمة لربط التعديلات في هيكل البكتيرية أو دالة للتغيرات اللاحقة في الاستجابة المناعية والدالة. على هذا النحو، فإنه كثيرا ما يستخدم كتحليل تكميلي لتحديد فعالية العلاجات جسم، المرشحين اللقاح، إنزيم الأمثل، إلخ المستندة إلى جهاز المناعة. حين المجراة في فحوصات ضرورية لتحديد فعالية التخليص أو الحماية في نموذج عدوى بكتيرية، أوبكا يمكن أن تستخدم لتقييم مساهمة محصنة إلى موت الخلايا البكتيرية المكونات الأساسية في معظم: البكتيريا والخلايا المناعية، والتجريبية العلاجات. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن أوبكاس يمكن تعديلها واستخدامها لمجموعة متنوعة من البكتيريا واللقاح، بما في ذلك العقدية الرئوية¹،²من المكوّرات العنقودية الذهبية، الزائفة الزّنجاريّة³. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الاختبارات الأمثل لتقييم علاجات تجريبية مختلفة، بما في ذلك قدرة إنزيم جعل البكتيريا أكثر يسرا لتكملة بوساطة الخلايا المناعية⁴ وجسم علاجات لتحسين أوبسونيزاتيون⁵. كلاسيكي، الإنزيم أوبكا وقد استخدمت بنجاح في مجال البحوث الأساسية والسريرية الناجمة عن الإعدادات كمؤشر قوي لحماية الأجسام المضادة الخاصة بالعوامل الممرضة^6،،من^78،9 .

يمكن استخدام أنواع مختلفة من الخلايا المناعية للتقييم لقتل أوبسونوفاجوسيتيك. أحد السكان متجولة استخداماً هو خط الخلية ليوكيميك البشرية HL-60. يمكن الاحتفاظ بهذا الخط خلية بروميلوسيتيس المعطل في الثقافة؛ ومع ذلك، يمكن أن تكون متباينة في مختلف الدول المنشط عن طريق المخدرات مختلف العلاجات^10،11. علاج HL60 مع N، N-ديميثيلفورماميدي يميز خط الخلية في العَدلات مفعّلة مع النشاط متجولة قوية¹¹. حين يكون قد تم تحسين HL-60 الخلايا وتستخدم بشكل متكرر لهذه الاختبارات البلعمه¹⁰، يمكن استخدام أخرى الكريات البيض النوى الأولية كذراع محصنة من التجربة¹².

بالإضافة إلى ذلك، هذه فحوصات يمكن أن تكون مبسطة¹³ أو¹⁴ إلقاء نظرة على السلالات المقاومة للمضادات الحيوية متعددة من البكتيريا لاختبار متعدد. الأسلوب متعدد أحرز أكثر جدوى من خلال تطوير البرمجيات التي يمكن عد كفاءة مستعمرة بكتيرية تشكيل وحدات (كفوس) كل بقعة على لوحة أجار¹⁵. وهنا يصف لنا طريقة مبسطة باستخدام سلالة بكتيرية واحدة HL-60 الخلايا، وتكملة الأرنب الرضيع ولوحات أجار الدم. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن تقييم علاجات متعددة بسرعة لمعالجة مسائل بحثية محددة حول كيف يمكن أن يكون التضمين الاستجابة المناعية الفطرية للعدوى البكتيرية.

Protocol

1-الثقافة، والتمايز، والتحقق من صحة الخلايا HL-60

1. إعداد HL-60 الخلايا ثقافة وسائل الإعلام مؤلفة من 500 مل ربمي مع الجلوتامين لام و 50 مل إبطال الحرارة الجنيني البقري المصل. لا تقم بإضافة المضادات الحيوية كما قد يؤثر هذا على التفريق بين الخلايا HL-60.
2. لنشر وصيانة HL-60 الخلايا، تنفيس الثقافة 5 × 10⁶ خلايا في 10 مل HL-60 الخلايا وسائط الثقافة في 75 سم² قوارير في 37 درجة مئوية و 5% CO₂. مرور الخلايا كل أيام 3−4 للحفاظ على تركيزات الخلية أمثل.
   ملاحظة: تركيز خلية ينبغي أن لا تتجاوز 5 × 10⁶/mL.
3. توليد الأرصدة العامل HL-60 الخلايا عن طريق اليقوتينج حوالي 1 × 10⁶ خلايا/مل في وسائط الثقافة HL60 مع 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) في أنابيب التبريد 1 مل.
   ملاحظة: قد يتم تخزين مخزونات العامل في-80 درجة مئوية. يجب أن يتم تخزين المخزون الرئيسي في-120 درجة مئوية.
4. تمييز HL-60 الخلايا عن طريق تثقيف 1.5 × 10⁷ خلايا في 15 مل HL-60 الخلايا ثقافة وسائل الإعلام مع 0.6% N، N-dimethylformamide (DMF) في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ في قوارير معقمة توج تصفية 75 سم² لمدة 3 أيام قبل أوبكا.
5. التحقق من صحة أن HL-60 الخلايا المتمايزة قد تم بنجاح، وهي مناسبة للاستخدام في التحليل أوبكا باختبار صلاحية وعلامات سطح الخلية وفقا للمنشأة التدفق الخلوي البروتوكولات^{16،17، 18،19}. بعد التمايز، حصاد HL-60 الخلايا ووصمة عار حوالي 1 × 10⁴ خلايا مع الأجسام المضادة مترافق فلوريسسينتلي/البقع ل CD71، CD35، أنيكسين الخامس، ويوديد propidium.
   ملاحظة: ينبغي أن تكون الخلايا المتمايزة % إيه سيكس فايف % قابلة للحياة، إيه فايف فايف CD35⁺، ودي تو زيرو % CD71⁺ كما هو محدد من خلال إنشاء بروتوكولات المصادقة¹⁴ (الشكل 1).

2-إعداد الكواشف ومخازن أوبكا

1. إعداد 50 مل opsonization العقيمة المخزن المؤقت ب (أوب) عن طريق خلط 42.5 مل معقمة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) مع Ca^{2 +}/Mg^{2 +}, 5 مل من المصل البقري الجنين الحرارة معطل، و 2.5 مل من 0.1% الجيلاتين العقيمة. مخزن في 4 درجات مئوية.
2. الحصول على طفل أرنب مكملاً وتخزينها في-80 درجة مئوية.
3. الحصول على أو إعداد لوحات ثقافة البكتيرية (أي 15 × 100 مم² 5% الأغنام أجار الدم اللوحات).

3-إعداد نماذج المخزون البكتيرية

1. الحصول على مخزون من strain(s) الجرثومي لفحصها.
   ملاحظة: لهذا البروتوكول، النمط المصلي المسيطر يستخدم 3 العقدية الرئوية (WU2، قدمت بسخاء بالدكتور القمر Nahm).
2. تنمو السلالة البكتيرية في مرق مناسب (أي، تود هيويت مرق + مستخرج الخميرة 0.5% لهذه السلالة WU2) لما يقرب من 2−4 ح في 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD₆₀₀) للثقافة ينبغي أن يكون بين 0.6 و 0.8.
3. بيليه البكتيريا بالطرد المركزي في 6,000 س ز 2 دقيقة وريسوسبيند الخلايا في 10−30 مل من والغليسيرول 15% في المرق المناسب. قاسمة ثقافة البكتيرية (500 ميليلتر الواحدة قاسمة) إلى أنابيب الطرد المركزي معقم 1.5 مل ومخزن في-80 درجة مئوية.
4. ذوبان الجليد بقنينة واحدة من الأسهم البكتيرية في حمام مائي 37 درجة مئوية. بيليه الخلايا البكتيرية وريسوسبيند في 500 ميليلتر من أوب تحت ظروف معقمة.
5. إعداد تخفيف مختلفة من الأسهم البكتيرية في أوب (أي 10 ميليلتر من لا تمييع، 10 ميليلتر من 01:10، 10 ميليلتر من 1: 100، إلخ.). إجراء المقايسة أوبكا (المادتان 4-6، بما في ذلك ثقافة المشارك HL-60/تكملة) كما هو موضح أدناه باستخدام تخفيف مختلف الأسهم البكتيرية غير المعالجة. الثقافة لوحات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية (لا CO₂).
   ملاحظة: درجة حرارة 30 درجة مئوية محددة ل WU2 لمنع فرط؛ سلالات أخرى/اللقاح قد ينمو على النحو الأمثل عند 37 درجة مئوية.
6. عد المستعمرات لتمييع كل الأسهم البكتيرية غير المعالجة مثقف يشترك مع HL-60 الخلايا وتكملة. تحديد أي تمييع للبكتيريا غلة العدد الأمثل للمستعمرات العد (حوالي 80−120 كفوس لعلاج البكتيريا المستزرعة يشترك مع HL-60 الخلايا). ملاحظة هذا تمييع للمستقبل أوبكاس التي تنطوي على هذا المخزون البكتيرية.

4-البكتيرية في المعاملة والثقافة

1. ذوبان الجليد أنبوب واحد من الأسهم البكتيرية إعدادها في الخطوة 3، 3. بيليه البكتيريا (6,000 س ز 2 دقيقة) وريسوسبيند بيليه الخلية في أوب في تمييع الأمثل كما هي محددة في الخطوة 3، 6.
2. "الماصة؛" 10 ميليلتر لتمييع البكتيرية حراكه كل بئر في لوحة ثقافة الجولة-أسفل خلية 96-جيدا.
3. إضافة 20 ميليلتر لعلاج جسم أو العقاقير المناسبة لكل بئر تجريبية في مكررة.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول، ويتم إضافة جسم النمط المصلي المسيطر على حدة التي تم إنشاؤها في الفئران كعلاج X ويضاف إنزيم هيدرولاز غليكوزيد المعروف أن تتحلل الكبسولة السكاريد 3 النمط المصلي المسيطر كعلاج Y (الشكل 2)^4،20. لمراقبة الآبار، استخدم 1 x برنامج تلفزيوني أو OBB، اعتماداً على المخزن المؤقت المستخدم لمعالجة الآبار.
4. اهتزاز لوحة العينة حوالي 90 لفة في الدقيقة ح 1 في درجة حرارة الغرفة. ضبط هذه الشروط تبعاً لدرجة الحرارة المثلى أو ظروف تهتز من العلاجات يجري اختبارها.

5-HL-60 البكتيرية ثقافة المشارك

1. إعداد HL-60 الخلايا بحصاد الخلايا HL-60 المتباينة التي تعامل مع DMF في الأيام الثلاثة السابقة (راجع الخطوة 1، 4) إلى أنابيب مخروطية الشكل 15 مل. بيليه الخلايا (500 س ز، 3 دقيقة) وتجاهل المادة طافية، وتغسل مع مالا يقل عن 10 مل من 1 x برنامج تلفزيوني.
2. بيليه الخلايا غسلها (500 س ز، 3 دقيقة) وتجاهل المادة طافية ريسوسبيند الخلايا في أوب (ابدأ مع 1 مل أوب وضبط بتركيز 1 × 10⁷/mL نهائي بعد عد الخلايا).
3. إضافة تكملة أرنب الطفل (بيبي العقيمة، غير مخفف أرنب المصل، العمر 3−4 أسابيع) في وحدة تخزين نهائي 1:5.
   ملاحظة: ينبغي أن يكون التركيز النهائي المخلوط HL-60-تكملة 1 × 10⁷/mL. إذا كان اختبار تكملة التبعية، يمكن استخدام حل ثاني تتضمن النشطة HL-60 الخلايا مع تكملة إبطال الحرارة (قد يتم إلغاء تنشيط مكملاً بحضانة في حمام مائي في > 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل).
4. بعد ح 1 البكتيرية ثقافة كاملة (الخطوة 4، 4)، تقسيم كل عينة (أي، 10 ميليلتر من كل عينة 30 ميليلتر في آبار جديدة اثنين) إلى الآبار مكررة للفريقين (أي استخدام سوى 20 ميليلتر من ثقافة المشارك الأصلي 30 ميليلتر لحساب خطأ بيبيتينج) : مجموعة واحدة سيكون مثقف يشترك مع HL-60-تكملة وواحدة سوف تشمل البكتيريا فقط. إضافة 50 ميليلتر من خليط HL-60-تكملة (من الخطوة 5، 3) لكل مجموعة تجريبية من الآبار (تفويض + HL-60)؛ إضافة 50 ميليلتر من OBB وحدها إلى الآبار من البكتيريا فقط (تفويض-HL-60).
   ملاحظة: على سبيل المثال، تستخدم حوالي 800 كفوس الجرثومي للثقافة المشتركة الأولى مع 5 × 10⁵50 ميليلتر HL-60 الخلايا. إذا كان هذا التعدد للإصابة عالية جداً أو منخفضة جداً كما يتبين من الأرقام النهائية مستعمرة، ضبط تمييع البكتيرية الأولية بدلاً من عدد الخلايا HL-60.
5. اهتزاز لوحة 96-جيدا في 37 درجة مئوية ح 1 (لا CO₂).

6-عينة من الطلاء والحضانة بين عشية وضحاها

1. تمييع كل جيدا 1:5 مع أوب، حيث يكون لكل نموذج وحدة تخزين على الأقل 50 ميليلتر.
2. "الماصة؛" 50 ميليلتر من كل عينة مباشرة على منطقة معينة من لوحة الثقافة البكتيرية، ضمان تباعد ملائم بين العينات. 15 × 100 مم² الجولة لوحات أجار، وعينات بيبيت حوالي 4 على لوح واحد.
3. تغطية وتسمح العينات لتجف لمدة 15 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة.
4. عكس لوحات والثقافة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية (لا CO₂). وبدلاً من ذلك، ثقافة لوحات في الجرار اللاهوائية لاختبار ما إذا كانت ظروف وصول تؤثر على النمو البكتيري أو لعنصر التحكم للتشكل.
5. بعد الثقافة بين عشية وضحاها، عد المستعمرات في كل منطقة عينة المعينة. تحليل البيانات من خلال مقارنة عدد الخلايا الحية في كل مجموعة عنصر التحكم المطابق و/أو العينات التي لا تتلقى HL-60 خلية ثقافة المشارك (قتل الخلية تشير إلى بقاء الخلية 100%، 0%).

النتائج

وينبغي أن يكون إجراء التحقق من صحة التمايز HL-60 قبل البدء في أوبكا. هذا أن يمكن إنجاز باستخدام التدفق الخلوي لتحديد التعبير خارج الخلية CD11b، CD35، CD71، والخامس أنيكسين (الشكل 1). يمكن أيضا استخدام يوديد Propidium كعلامة سلامة. بعد أن تلقي علاجاً مع DMF لمدة 3 أيام، وينبغي زيادة التعبير ?...

Discussion

أوبكاس تخدم أدوار أساسية في تقييم الاستجابات المناعية الأجسام المضادة بوساطة الناجمة عن التطعيم^6،8. المغزى الرئيسي لهذه أوبكا مبسطة هو قدرة على التكيف في الظروف لفحصها (أي الأجسام المضادة، والعلاجات إنزيم، إلخ.). وبهذا المعني، بينما يمكن استخدام هذا التحلي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V (APC conjugated)	BioLegend	640919
anti-CD35, human (PE conjugated)	BioLegend	333405
anti-CD71, human (PE conjugated)	BioLegend	334105
bacterial strain to be used (i.e., Streptococcus pneumoniae, WU2)	Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm)
blood agar plates	Hardy Diagnostic	A10
Fetal Clone serum	HyClone	SH30080.03
glycerol	Sigma	G9012-1L
HL-60 cells	ATCC	CCL-240
IgG Isotype Control (PE conjugated)	BioLegend	400907
N,N-dimethylformamide (DMF)	Fisher Chemical	UN2265
propidium iodide	Sigma	P4864
RPMI media with L-glutamine	Corning	10-040-CV