Opsonophagocytic öldürme tahlil bakteriyel patojenlere karşı immünolojik yanıt değerlendirmek için

Özet

Bu opsonophagocytic öldürme tahlil yeteneği yanıt ve farklı tedaviler ve/veya koşullar üzerinde temel bakterileri öldürmek için fagositik bağışıklık hücrelerinin karşılaştırmak için kullanılınır. Klasik, bu tahlil bir bakteri bağlar olarak karşı kaldırdı antikorlar efektör fonksiyonları değerlendirmek için altın standart olarak hizmet vermektedir.

Özet

Bir anahtar için ev sahibi bakteriyel kolonizasyon bağışıklık yanıtının fagositoz yönüdür. Bir opsonophagocytic öldürme tahlil (OPKA) Fagositlerlerce bakteriyel birimleriyle işbirliği kültürlü olan deneysel bir işlemdir. Bağışıklık hücreleri phagocytose ve bakteri kültürleri bir tamamlayıcı bağlı şekilde öldürmek. İmmün aracılı hücre öldürme verimliliğini bir dizi faktöre bağlıdır ve ne kadar farklı bakteriyel belirlemek için kullanılan kültürler karşılaştırmak direnç hücre ölümü ile ilgili olarak. Bu şekilde, potansiyel bağışıklık tabanlı tedavi etkinliğinin belirli bakteri suşları ve/veya serotipleri karşı tespit edilebilir. Bu protokol için temel kültür koşulları ve tedavi koşulları ve HL-60 bağışıklık hücreleri ile ortak kültür sonra bakteri hücre canlılığı belirlemek için sayma hücre kullanır bir basitleştirilmiş OPKA açıklar. Bu yöntem başarılı bir şekilde birkaç farklı pnömokok serotipleri, kapsül ve acapsular suşları ve diğer bakteriyel türler ile kullanıldığında vardır. (Bu tahlil antikor tedavisi opsonins olarak sınırlı değildir) bu OPKA Protokolü avantajları sadeliği çok yönlülük şunlardır ve zaman ve temel deneysel grupları değerlendirmek için reaktif indirilmesi.

Giriş

Tahlil (OPKA) öldürme opsonophagocytic bağışıklık yanıtı ve fonksiyon sonraki değişiklikler değişiklikler bakteriyel yapısı veya işlev bağlamak için önemli bir araçtır. Bu nedenle, bu sık sık antikor tedavisi, aşı adaylar, enzim optimizasyonu, vb bağışıklık tabanlı etkinliğini belirlemek için tamamlayıcı bir tahlil olarak kullanılır. İçinde vivo deneyleri etkili temizleme veya koruma bir bakteriyel enfeksiyon modeli belirlemek gerekli olmakla birlikte, OPKA bakteriyel hücre ölümü bağışıklık katkısı en temel bileşenleri değerlendirmek için kullanılabilir: bakteri, bağışıklık hücreleri ve deneysel tedaviler. Önceki çalışmalarda OPKAs değiştiren ve bakteri ve serotipleri, Streptococcus pneumoniae¹, Staphylococcus aureus², Pseudomonas aeruginosa³de dahil olmak üzere çeşitli için kullanılan göstermiştir. Ayrıca, bu en iyi duruma getirilmiş deneyleri bakteri Kompleman aracılı bağışıklık hücreleri⁴ ve antikor tedavileri geliştirmek için daha erişilebilir kılan bir enzim da dahil olmak üzere farklı deneysel tedaviler değerlendirmek için kullanılabilir opsonizasyonla⁵. Klasik, OPKA tahlil başarıyla temel ve klinik araştırmada kullanılmıştır ayarları korumak için güçlü bir göstergesi olarak indüklenen patojen özel antikorlar^6,7,8tarafından^,9 .

Bağışıklık hücreleri türleri opsonophagocytic öldürme değerlendirilmesi için kullanılan. Bir sık kullanılan fagositik nüfus HL-60 insan lösemik hücre çizgidir. Bu hücre kültürünü Inaktif promiyelosit kültür olarak tutulabilir; Ancak, onlar farklı ilaç tedavisi^10,11ile çeşitli aktif Birleşik Devletleri içine farklı. Tedavisi HL60 n, N-dimethylformamide içine güçlü fagositik aktivite¹¹ile aktif nötrofil hücre ayırır. HL-60 hücreleri optimize edilmiştir ve bu fagositoz deneyleri¹⁰için sık sık kullanılır, diğer birincil polimorfonükleer lökosit¹²deneme bağışıklık kolu olarak kullanılabilir.

Ayrıca, bu deneyleri Basitleştirilmiş¹³ olabilir veya test edilecek bakterilerin birden çok antibiyotik dirençli suşların bakmak için¹⁴ multiplexed. Çoğaltılmış yöntemi daha verimli bir şekilde bakteriyel koloni başına bir agar plaka¹⁵oracıkta birimleri (CFUs) oluşturan güvenebilirsiniz yazılım geliştirme yoluyla uygun hale getirilmiştir. Burada, bir bakteriyel zorlanma, HL-60 hücreleri, bebeği tavşan tamamlayıcı ve kan Ağar kaplamalar kullanarak akıcı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemle, birden fazla tedavi hızlı bir şekilde nasıl bakteriyel enfeksiyon doğuştan gelen bağışıklık yanıtı modülasyonlu üzerinde belirli araştırma soruları gidermek tespit edilebilir.

Protokol

1. Kültür, farklılaşma ve HL-60 hücre doğrulama

1. HL-60 hücre kültür medya 500 mL RPMI L-glutamin ve 50 mL ısı inaktive fetal sığır serum ile oluşan hazırlayın. Bu HL-60 hücrelere farklılaşma etkileyebilir gibi antibiyotikler eklemeyin.
2. HL-60 hücrelerinin yayılma/bakım için kültür 5 x 10⁶ hücre HL-60 hücre kültür medya 75 cm² ' deki 10 ml şişe 37 ° C ve % 5 CO₂Bacalı. Geçiş hücreleri 3−4 günde optimum hücre konsantrasyonları korumak için.
   Not: Hücre konsantrasyonu 5 x 10⁶/mL aşmaması gerekir.
3. HL-60 hücrelerinin çalışma stokları aliquoting yaklaşık 1 x 10⁶ hücre/mL % 10 Dimetil sülfoksit (DMSO) ile HL60 kültür medya tarafından 1 mL kriyojenik tüpler içine oluşturur.
   Not: Çalışan hisse senetleri-80 ° C'de depolanmış olabilir Ana stok-120 ° C'de muhafaza edilmelidir
4. HL-60 hücreleri kodlamayla 1.5 x 10⁷ hücrelerde 15 mL %0,6 N, N-dimethylformamide (DMF) ile HL-60 hücre kültür medya tarafından 37 ° C ve % 5 CO₂ filtre şapkalı steril 75 cm² şişe'de 3 gün önce OPKA için ayırt etmek.
5. HL-60 hücreleri başarıyla ayrıştırılan ve canlılık ve hücre yüzey işaretleyicileri kurulan Akış Sitometresi protokolleri^{16,17göre test ederek OPKA tahlil kullanımına uygun doğrulamak, 18,19}. Farklılaşma sonra HL-60 hücre hasat ve CD71, CD35, annexin V ve propidium iyodür için yaklaşık 1 x 10⁴ hücreleri ile fluorescently Birleşik antikorlar/lekeleri leke.
   Not: Farklılaşmış hücreler-meli var olmak ≥65% uygun, ≥55% CD35⁺ve ≤20% CD71^{aracılığıyla belirlenen +} kurulan doğrulama protokolleri¹⁴ (şekil 1).

2. OPKA arabellekleri ve Kimyasalları hazırlanması

1. Steril opsonizasyonla arabelleği B (OBB) 50 mL steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 42,5 mL Ca^{2 +}/Mg^{2 +}, ısı inaktive fetal sığır serum 5 mL ve 2.5 mL % 0.1 ile steril jelatin karıştırarak hazırlayın. 4 ° C'de mağaza
2. Bebeği tavşan tamamlayıcı almak ve-80 ° C'de depolamak
3. Elde etmek veya bakteriyel kültür Tabaklar (yani, 15 x 100 mm^%2 5 koyun kan agar tabaklar) hazırlamak.

3. bakteriyel hisse senedi örnekleri hazırlanması

1. Test edilecek bakteriyel strain(s) bir hisse senedi alın.
   Not: Bu iletişim kuralı için serotip 3 pnömokok (WU2, Dr. Moon Nahm tarafından cömertçe karşılanmıştır) kullanılır.
2. Yaklaşık olarak 37 ° C'de s 2−4 için (yani, Todd-Hewitt suyu + %0.5 Maya özü bu WU2 zorlanma için) uygun bir suyu bakteriyel zorlanma büyümek
   Not: Optik yoğunluk 600 nm (OD₆₀₀) kültür 0.6 ve 0.8 arasında olmalıdır.
3. Santrifüjü 6.000 x g 2 min için de tarafından bakteri cips ve uygun suyu % 15 gliserol 10−30 mL hücrelerde resuspend. Aliquot steril 1,5 mL santrifüj tüpleri ve-80 ° C'de mağaza içine bakteri kültürü (aliquot başına 500 µL)
4. Bakteriyel bir 37 ° C su banyosu stokta bir şişe dışarı çözülme. Bakteri hücreleri cips ve OBB 500 µL steril koşullar altında resuspend.
5. OBB (yani, hiçbir seyreltme 10 µL, 10 µL 1:10, 1: 100, vb 10 µL) bakteriyel stokunun farklı dilutions hazırlayın. OPKA tahlil (Bölüm 4-6, dahil HL-60/tamamlayıcı ortak kültür) tedavi edilmezse bakteri stokunun çeşitli dilutions kullanarak aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin. Plakayı gecede 30 ° C'de (hiçbir CO₂) kültür.
   Not: Sıcaklığı 30 ° C WU2 aşırı büyüme önlemek özeldir; diğer suşların/serotipleri 37 ° C'de en iyi şekilde ulaşması
6. Colonies için her seyreltme tedavi edilmezse bakteri stokunun HL-60 hücreleri ve tamamlayıcı ile birlikte kültürlü saymak. Belirlemek hangi seyreltme bakterilerin sayılabilir koloniler (yaklaşık 80−120 CFUs tedavi edilmezse bakteri HL-60 hücrelerle birlikte kültürlü için) en iyi sayısını verir. Bu seyreltme için gelecekteki OPKAs bakteriyel bu hisse senedi içeren dikkat edin.

4. bakteriyel tedavi ve kültür

1. 3.3. adımda hazırlanan bakteriyel stokunun bir tüp çözülme. Bakteri (6.000 x g için 2 dk) cips ve hücre Pelet 3.6. adımda belirlenen en uygun seyreltme, OBB içinde resuspend.
2. Resuspended bakteriyel seyreltme iyi bir yuvarlak alt 96-şey hücre kültür plaka başına 10 µL pipet.
3. Uygun antikor veya uyuşturucu tedavi 20 µL yinelenen deneysel her kuyuya ekleyin.
   Not: Bu iletişim kuralı, farelerde oluşturulan bir serotip özgü antikor tedavisi X eklenir ve serotip 3 polisakkarit kapsülü aşağılamak için bilinen bir glikozid hidrolaz enzim tedavisi olarak Y (Şekil 2)^4,20eklenir. Denetim kuyular için PBS veya OBB, x 1 tedavi kuyular için kullanılan arabellek bağlı olarak kullanın.
4. Oda sıcaklığında 1 h için yaklaşık 90 devirde örnek plaka sallamak. Bu koşullara bağlı olarak en uygun sıcaklık veya test edilen tedavilerin sallayarak koşulları ayarlayın.

5. HL-60 bakteriyel ortak kültür

1. HL-60 hücreleri DMF ile üç gün önceden (bkz. Adım 1.4) 15 mL konik tüpler içine kabul edilir HL-60 farklılaşmış hücre hasat tarafından hazırlayın. Hücreler (500 x g, 3 dk) cips, süpernatant atmak ve en az 10 mL 1 x PBS yıkayın.
2. Yıkanmış hücreler (500 x g, 3 dk) cips, süpernatant atmak ve OBB hücrelerde resuspend (1 mL OBB ile başlatmak ve 1 x 10⁷/mL Hücre sayımı sonra son bir konsantrasyon için ayarlayabilirsiniz).
3. Bebeği tavşan tamamlayıcı (steril, su katılmamış bebeği tavşan serum, Yaş 3−4 hafta) 1:5 son seste ekleyin.
   Not: HL-60-tamamlayıcı karışımı son konsantrasyonu 1 x 10⁷/mL olmalıdır. Tamamlayıcı bağımlılık sınama olumlu sonuçlanırsa, ısı inaktive tamamlayıcı ile etkin HL-60 hücreleri içeren ikinci bir çözüm kullanılabilir (tamamlayıcı inaktive olur bir su banyosunda kuluçka > için en az 30 dk. 55 ° C).
4. 1 h bakteri kültürü tam (4.4) adımdır sonra yinelenen kuyular iki grup (yani, kullanım sadece 20 µL pipetting hata için hesap için orijinal 30 µL ortak kültür) için her örnek (yani, her 30 µL örneği de iki yeni kuyu içine 10 µL) bölün : bir set HL-60-tamamlayıcı ile birlikte kültürlü olacak ve bir bakteri yalnızca yer alacak. 50 µL wells deneysel her dizi için (Kimden adım 5.3) HL-60-tamamlayıcı karışımı ekleyin (temsilci seçilen + HL-60); OBB yalnız 50 µL bakteri sadece (temsilci seçilen -HL-60) kuyu için ekleyin.
   Not: Bu örnekte, yaklaşık 800 bakteriyel CFUs 5 x 10⁵/50 µL HL-60 hücrelerle ilk ortak kültürü için kullanılır. Bu çeşitlilik enfeksiyon çok yüksek veya çok düşük son koloni numaraları tarafından belirtildiği şekilde ise, ilk bakteriyel seyreltme HL-60 hücre sayısı olarak ayarlayın.
5. 96-şey plaka için 1 h (hiçbir CO₂) 37 ° C'de sallamak.

6. örnek kaplama ve gecede kuluçka

1. Her örnek en az 50 µL hacmi böylece her şey 1:5 ile OBB, oranında seyreltin.
2. Doğrudan üzerine örnekleri arasında yeterli boşluk sağlanması bakteriyel kültür plaka, belirlenmiş bir alanda her örneğinin 50 µL pipet. 15 x 100 mm için² yuvarlak Ağar Kaplamalar, damlalıklı yaklaşık 4 örnekleri üzerine bir tabak.
3. Kapak ve örnekleri, oda sıcaklığında yaklaşık 15 dakika kurumasını bekleyin.
4. Kaplamalar ve kültür gecede 30 ° C'de (hiçbir CO₂) tersine çevirin. Alternatif olarak, tabak anoksik koşulların Bakteriyel büyüme etkiler olup olmadığını sınamak için anaerobik kavanoz veya denetime Morfoloji için kültür.
5. Gecede kültür sonra her belirlenen örnek alanı kolonilerde saymak. Her sette karşılık gelen denetim ve/veya HL-60 cep ortak kültür almazsınız örnekleri canlı hücre sayısı karşılaştırarak veri analiz (gösterge % %0 100 hücre kurtulma hücre öldürme).

Sonuçlar

Doğrulama HL-60 farklılaşma OPKA başlamadan önce gerçekleştirilmelidir. Bu hücre dışı ifade CD11b, CD35, CD71 ve annexin V (şekil 1) belirlemek için Akış Sitometresi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Propidium iyodür bir canlılık marker olarak da kullanılabilir. DMF ile 3 gün sonra tedavi altına, CD35 ifade artırılmalıdır (tüm hücreleri ≥55%) ve CD71 ifade düşmüştür (tüm hücreleri ≤20%). Annexin V + ve propidium iyodür (PI +) hücreleri birlikte yü...

Tartışmalar

OPKAs antikor aracılı bağışıklık yanıtı aşılar^6,8tarafından indüklenen değerlendirmede önemli roller hizmet. Adaptasyon koşullarında test edilecek bu Basitleştirilmiş OPKA ana önemi nedir (antikorlar, enzim tedavisi, vs.). Bu tahlil opsonins (yani, antikorlar) katkısını fagositoz içinde test etmek için kullanılan bu anlamda, bu da normalde fagositik yolları inhibe virülans faktörleri (yani kapsüler polisakkaritler) aşmak için yolla...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V (APC conjugated)	BioLegend	640919
anti-CD35, human (PE conjugated)	BioLegend	333405
anti-CD71, human (PE conjugated)	BioLegend	334105
bacterial strain to be used (i.e., Streptococcus pneumoniae, WU2)	Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm)
blood agar plates	Hardy Diagnostic	A10
Fetal Clone serum	HyClone	SH30080.03
glycerol	Sigma	G9012-1L
HL-60 cells	ATCC	CCL-240
IgG Isotype Control (PE conjugated)	BioLegend	400907
N,N-dimethylformamide (DMF)	Fisher Chemical	UN2265
propidium iodide	Sigma	P4864
RPMI media with L-glutamine	Corning	10-040-CV