طريقه خاليه من الانزيمات للعزل والتمدد للخلايا الجذعية الدهنية المستمدة من الدهون البشرية

Summary

يوفر هذا البروتوكول طريقه خاليه من الانزيمات لعزل الخلايا الجذعية المسمارية من البطن والعينات الشحمية باستخدام طريقه الشرح. عدم وجود الانزيمات القاسية أو الخطوات طرد يوفر للخلايا الجذعية ذات الصلة سريريا التي يمكن استخدامها للدراسات في المختبر أو نقلها مره أخرى إلى العيادة.

Abstract

الخلايا الجذعية المسمارية (MSCs) هي مجموعه من الخلايا المتعددة القوية التي يمكن عزلها عن مختلف الانسجه البالغة والجنينية ، بما في ذلك الانسجه الدهنية. كنوع الخلية ذات الصلة سريريا ، هناك حاجه إلى الطرق المثلي لعزل وتوسيع هذه الخلايا في المختبر. معظم الطرق لعزل MSCs المستمدة من الدهنية (ADSCs) تعتمد علي الانزيمات القاسية ، مثل كولاجيناز ، لهضم الانسجه الدهنية. ومع ذلك ، في حين فعاله في تحطيم الانسجه الدهنية والغلة الانتعاش ADSC عاليه ، وهذه الانزيمات مكلفه ويمكن ان يكون لها تاثير ضار علي Adsc-بما في ذلك مخاطر استخدام مكونات xenoجينه في التطبيقات السريرية. هذا البروتوكول تفاصيل طريقه لعزل ADSCs من الدهون الطازجة وعينات شد البطن دون الانزيمات. وباختصار ، تعتمد هذه الطريقة علي التفكك الميكانيكي لأي نسيج سائب يتبعه نظام ثقافي من نوع الشرح. يسمح لل ADSCs للهجرة من الانسجه وعلي لوحه ثقافة الانسجه ، وبعد ذلك ADSCs يمكن ان تكون مثقفه وتوسيعها في المختبر لأي عدد من البحوث و/أو التطبيقات السريرية.

Introduction

الخلايا الجذعية المستوية (MSCs) هي فئة من الخلايا الجذعية البالغة القوية التي يمكن عزلها عن مختلف الانسجه البالغة والجنينية ، بما في ذلك من الانسجه الدهنية. هذه الخلايا هي نوع خليه جذابة لكل من البحوث الاساسيه والتطبيقات السريرية بسبب اللدونة الخاصة بهم للتمييز في خلايا جميع الطبقات الجرثومية في المختبر ، عبر الحواجز الخيفيه ، موطن لمناطق التهاب ، وقمع التهاب (مراجعه في شيرمان ، وآخرون.¹). الدهنية المشتقة MSCs (ASCs) جذابة بشكل خاص نظرا لسهوله حصول علي ، كما يعتبر الانسجه الدهنية عموما الانسجه المرتجعة بعد شفط الدهون الروتينية وإجراءات شد البطن. ومع ذلك ، وبمجرد الحصول عليها ، وتخضع العينات عموما لظروف قاسيه – اما الانزيميه أو طرد — من أجل عزل ascs^2,3. يوضح هذا الأسلوب اجراء بسيط لعزل ASCs باستخدام طريقه شرح ، في غياب الانزيميه القاسية أو الخطوات طرد.

الطريقة الأكثر شيوعا لعزل ASCs يتكون من غسل عينه الدهنية ، انزيمي هضم العينة مع كولاجيناز ، يطرد العينة ، وأخيرا ليسينج خلايا الدم الحمراء قبل ان الخياطة ASCs⁴. في حين كفاءه في عزل الغلة عاليه من ascs ، واستخدام مكونات xenoجينه (علي سبيل المثال ، الهضم الانزيمي مع كولاجيناز) يعتبر أكثر من "الحد الأدنى من التلاعب" من قبل الولايات الامريكيه الغذاء والدواء ، ويمكن ان تشكل مخاطر مثل رد فعل المناعي ، ومنع استخدام الخلايا في العيادة^5،6. للتقليل من مخاطر المكونات الغريبة ، اقترحت العديد من المجموعات غير الحيوانية المشتقة ، والانزيمات المصنعة لهضم الانسجه الدهنية. ومع ذلك ، هذه الانزيمات لا تزال قاسيه ، ويمكن ان يغير النمط الظاهري الخلية⁷.

وتشمل الطرق الأخرى لعزل ASCs طرد عاليه السرعة ، وذلك باستخدام قوات عاليه مثل 1,200 x g، و vortexing لعزل ascs⁸. حتى القوات منخفضه مثل 400 x g كانت كافيه في عزل ascs القابلة للاستمرار⁹. في حين ان هذه الخلايا تنتج كميه كبيره من الخلايا القابلة للحياة ، فشلت العديد من البروتوكولات في التكاثر بعد 14 يوما⁸. وعلاوة علي ذلك ، العزلة الميكانيكية غله عدد اقل من الخلايا المستعادة من الهضم الانزيمي ، ولكن نسبه اعلي من الخلايا المعزولة كانت ASCs بالمقارنة مع الخلايا الأخرى الذاتية للانسجه الدهنية في الممر 0¹⁰.

عزل الأنقى ، والسكان أكثر قابليه للحياة من ASCs في وقت اقل ، إلى جانب تكلفه ومخاطر المكونات xenoجينه ، يجعل الهضم الانزيميه اقل واقل جاذبيه للترجمة إلى العيادة. في حين ان العزلة الميكانيكية هي في البداية نهج إيجابي ، هناك تفاوت كبير في الأساليب المستخدمة ، وحجم الانسجه المعالجة يقتصر علي حجم وحدات الطرد المركزي المتخصصة ، ويمكن ان تعتمد علي الاتساق المشغل².

في حين ان كلا من الهضم الانزيمي والطرد بسرعة الغلة كميه كبيره من ASCs, هذه الخلايا المعزولة تظهر التغيرات الظاهرية, الرضوخ الاسئله حول سلوكهم عندما عاد إلى المريض². التالي فان الأسلوب القائم علي الشرح للعزل ASC ، كما هو موصوف في هذا البروتوكول ، يستخدم من قبل بعض المجموعات ، حيث تهاجر الخلايا الدهنية من قطع صغيره من الانسجه الشحمية الصلبة^3،11،12. هذه الهجرة من المحتمل ان يكون تاثير الخلايا التي يتم سحبها إلى وسائل الاعلام الغنية بالمغذيات. مثل السكان الآخرين من MSCs, ASCs التمسك البلاستيك, والبقاء علي قيد الحياة وتتكاثر في وسائل الاعلام الانسجه المستخدمة الثقافة (المكونات أدناه), السماح عزلتهم من أنواع الخلايا الأخرى من الانسجه الدهنية. في حين يتم استرداد عدد اقل من الخلايا في البداية — غالبا ما تستغرق > أسبوع واحد حتى تظهر الخلايا علي لوحه ثقافة الانسجه — فان هذه الاقراص غير المعالجة ستتكاثر في المختبر ، مما يسمح بتوسيع الخلايا للمجلدات ذات الصلة السريرية^11،12،13.

Protocol

تمت الموافقة علي استخدام عينات الشفط الشحمي وشد البطن من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في جامعه روتجرز – الحرم الجامعي في نيوارك.

1. اعداد وسائل الاعلام الثقافة النسيج

1. تعقيم اعداد 500 مل من وسائل الاعلام الثقافة الانسجه قبل عزل ASCs. لاعداد وسائل الاعلام الثقافية ، أضافه 10 ٪ مصل الساق الجنين المحدد (FCS) والبنسلين-ستربتوميسين (10,000 U/100 مل) إلى الحد الأدنى من وسائل الاعلام دولبيكو الاساسيه (DMEM) مع ارتفاع الجلوكوز و 2 مم L-الجلوتامين. يمكن تخزين وسائل الاعلام في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 3 أسابيع ، وينبغي ان تستخدم دائما الدافئة (بين درجه حرارة الغرفة إلى 37 درجه مئوية).
   1. إذا كانت الوسائط المختلفة مفضله لثقافة الخلايا الجذعية ، فقم باعداد تلك الوسائط بدلا من ذلك.

2. عزل ASCs من الانسجه الدهنية

1. الحصول علي الشفط الشحمي أو عينه (ق) لشد البطن. بعد موافقه الهجرة ، الحصول علي عينات مثل الانسجه المرتجعة بعد العمليات الجراحية المختلفة. نقل الدهون إلى المختبر في اي سفينة الجراح أزاله الانسجه. النقل عينات البطن في حقيبة غرفه العمليات أو الحاويات العينة.
2. تخزين العينة (ق) في درجه حرارة الغرفة لمده تصل إلى 6 ساعات أو عند 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 24 ساعة إذا لم تعالج علي الفور. عينات الانسجه المعالجة بعد الأوقات المذكورة أعلاه من المرجح ان يكون لها انخفاض الغلة الخلية. إبقاء عينات شد البطن رطبه باضافه 1x الفوسفات معقمه مخزنه المالحة.
3. من هذه النقطة فصاعدا ، واجراء جميع الخطوات في غطاء المحرك الرقائقي تدفق تحت ظروف العقيم. ارتداء قفازات للحماية الشخصية. الحفاظ علي 10 ٪ التبييض ، 70 ٪ الايثانول ، والمناشف الورقية في مكان قريب لتنظيف بسرعة اي انسكابات البيولوجية. التخلص من اي الانسجه الزائدة والنفايات الطبية الحيوية.
4. فرم العينات في < قطعه 1 مم. إذا كانت كتله شد البطن كبيره جدا بحيث لا يمكن العمل بها ، فقم بقطع حجم الانسجه القابلة للاداره من الكتلة قبل الفرم. نقل نسيج شد البطن إلى غطاء لوحه معقمه 100 مم. استخدام ابره معقمه لعقد قطعه من الانسجه في مكان واستخدام مشرط معقمه لفرم القطع من قبل اما قطع أو تمزيق بلطف قباله الانسجه السائبة.
   1. هذه الخطوة ليست ضرورية بشكل عام لشفط الدهون. ومع ذلك ، إذا لوحظت قطع الانسجه الكبيرة في الدهون ، وأزاله هذه القطع مع ملقط معقمه وعمليه علي النحو الوارد أعلاه.
5. نقل الانسجه إلى أنبوب جديد وعكس أو يهز عينه 5-6 مرات لضمان خلط جميع الطبقات. اختياري: إذا كانت الدهون قد استقرت تماما ، وأزاله وتجاهل طبقه الزيت قبل الاختلاط.
6. نقل 2.5-5 مل من الانسجه إلى 100 مم فراغ-الغاز البلازما معالجه الانسجه لوحه ثقافة (جدول المواد). قياس حجم العينة عن طريق سكب في أنبوب الطرد المركزي الطازج. إذا لزم الأمر ، استخدم ملعقة معقمه للمساعدة في نقل الانسجه.
7. أضف كميه مكافئه من وسائط ثقافة الانسجه إلى اللوحة. دوامه بلطف لوحه لخلط المحتويات.
8. احتضان اليافوخات في 37 درجه مئوية في 5 ٪ CO₂ حتى يتم مشاهده عدد كاف من الخلايا علي قاعده لوحه. مع مرور الوقت ، سوف تهاجر الخلايا من داخل الانسجه علي سطح اللوحة ، وعند هذه النقطة انها سوف تلتزم البلاستيك. وفي الخروج من الانسجه ، ستظهر الخلايا ككتل صغيره حول قطع الانسجه.
9. كل 24 ساعة ، قم بازاله أكبر قدر ممكن من السوائل واستبدلها بكميه مماثله من الوسائط. ترك قطعه من الانسجه في مكان ، إذا كان ذلك ممكنا.
10. بمجرد الاشاره إلى عدد كاف من الخلايا علي لوحه (> 10 مجموعات من الخلايا ال>ه 15-25 علي لوحه) أو بعد 7 أيام ، أيهما أقرب ، أزاله جميع القطع المتبقية من الانسجه.
11. ثقافة ال [اسبس] في نسيج ثقافة أوساط حتى هم يبلغون 70% كونفلوينسي أو حتى المجموعات يصبح كثيفه (> 5 مجموعه كثيفه خلايا علي اللوحة, كل مع قطر من تقريبا > 500 μm), في اي نقطه الخلايا ان يكون [بسمسن].

3 ثقافة ال [اسيتس]

1. تمرير ASCs عندما تصل اللوحة الام تقريبا 70 ٪ كونفلوينسي. الحرص علي تجنب أكثر من كونفلوينسي من الثقافات ASC.
2. شطف الصفيحة برفق مع الفوسفات 1x المحلول الملحي المخزن والخلايا الملتصقة. إلى ترسينايز الخلايا ، يستنشق الفوسفات المالحة مخزنه وأضافه 1 مل من التريبسين مع 0.25 ٪ أدتا إلى كل لوحه واحتضان في 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق. بعد 5 دقائق ، تاكد من أزاله التزام بالمجهر. إذا كانت الخلايا لا تزال ملتصقة ، وأعاده الخلايا إلى الحاضنة لمده 5 دقائق اضافيه.
3. أضافه كميه صغيره من وسائل الاعلام (ما يقرب من 25 ٪ من حجم التريبسين الإجمالي) إلى لوحه لتعطيل التريبسين ، ويغسل بلطف قاعده لوحه باستخدام وسائل الاعلام/التريبسين. لغسل لوحه ، وعقد لوحه في زاوية طفيفه وماصه بلطف وسائل الاعلام/التريبسين من اعلي اللوحة إلى أسفل ، وتخفيف اي الخلايا المرفقة الاسبوعيه من لوحه. يمكن أعاده مطلي الخلايا بنسبه 1:3 أو المصنفة في كثافة 120000 – 500000 الخلايا لكل لوحه.
   1. إذا البذر استنادا إلى عدد الخلايا ، ونقل التريبسين/وسائل الاعلام من لوحه إلى أنبوب الطرد المركزي المخروطي ، وبيليه الخلايا بواسطة طرد في 300 x g ل 7 دقيقه. أعاده تعليق الخلايا في وسائل الاعلام ثقافة الانسجه (ما يقرب من 1 مل لكل لوحه الاوليه) وعد الخلايا قبل البذر. لحساب الخلايا ، ونقل 10 μL من تعليق الخلية في الكريات الدموية وحساب الخلايا الموجودة في 4 × 4 رباعي في كل زاوية من الشبكة. متوسط هذه القيم معا وضرب القيمة 10⁴ لحساب رقم الخلية.
   2. أضافه وسائل الاعلام إلى لوحه قبل بذر الخلايا. أضافه الخلايا بطريقه القطرات ومن ثم دوامه لوحه لضمان التوزيع حتى عبر لوحه.
      ملاحظه: بعد 3 مقاطع ، يجب ان تظهر الخلايا الملتصقة غير متناظرة والمغزل علي شكل. يمكن تاكيد النمط الظاهري ASC والسلوك باستخدام قياس التدفق الخلوي واختبارات التمايز.
4. تاكيد النمط الظاهري ASC والسلوك باستخدام قياس التدفق الخلوي واختبارات التمايز
   1. قياس التدفق الخلوي
      1. جمع وبيليه الخلايا كما هو موضح أعلاه. غسل التكوير مع 1x الفوسفات مخزنه المالحة وتسميه الخلايا مع الشركة المصنعة أوصت كميات من الأجسام المضادة. ويمكن الاطلاع علي بروتوكول مفصل لقياس التدفق الخلوي ، وهو اجراء مختبري مشترك ، هنا^12،14،15.
      2. حدد لوحات علامات السطح من التالية لتاكيد النمط الظاهري ASC: سالب ل CD14 ، CD31 ، CD34 ، CD45 ، و CD106; وايجابيه بالنسبة لCD29 ، والCD36 ، والCD44 ، والCD73 ، والCD90 ، والCD105^16،و^17،و^18،و¹⁹. وجود CD36 وغياب CD106 تمييز ASCs من نخاع العظم المشتقة MSCs²⁰.
   2. اختبارات التمايز: تاكيد التمايز متعدد النسب باستخدام مجموعه التمايز MSC. مجموعات متاحه من الشركات المصنعة متعددة لتاكيد القدرة علي التمايز ، والعظم ، والتفاضل والتشوندروجينيك. تغيير الوسائط المتوفرة بالعدة كل 3-4 أيام وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة لمده 3 أسابيع أو حتى يتم ملاحظه التمايز المورفولوجية.
5. ثقافة الخلايا لمقاطع متعددة ؛ سيعتمد عدد المقاطع المطلوبة علي التطبيق (التطبيقات). في كل مقطع ، تاكد من المورفولوجية الخلية MSC والنمط الظاهري باستخدام علامات سطح الخلية المذكورة أعلاه ، وضمان عدم فقدان القدرة علي التمايز متعدد السلالات. وفي حين يختلف احتمال التوسع بين المانحين ، يمكن توسيع معظم العينات لتصل إلى 6-9 ممرا.
6. بالتبريد الخلايا وتخزينها في النيتروجين السائل للاستخدام في المستقبل.

4 الحفظ بالتبريد لل ASCs

1. اعداد 10 مل من حلول التجميد A و B.
   1. لتجميد الحل A ، أضافه 20 ٪ FCS إلى DMEM مع ارتفاع الجلوكوز.
   2. لتجميد الحل ب ، أضافه 20 ٪ FCS و 20 ٪ كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO) إلى DMSO مع ارتفاع الجلوكوز.
2. بيليه الخلايا بواسطة يطرد في 300 x g ل 5 دقيقه. أعاده تعليق الخلايا في حجم صغير من محلول التجميد a وعد الخلايا باستخدام مقياس الكريات الدموية كما في الخطوة 3-3-1.
3. حساب الحجم النهائي الذي سيتم أعاده تعليق الخلايا في للوصول إلى تركيز الخلية النهائية من 500000-1000000 الخلايا/مل. استخدام محلول تجميد A لأعاده تعليق بيليه في 50 ٪ من هذا الحجم النهائي. أضافه ببطء حجم متساو من محلول تجميد B قطره في حين التحريض علي أنبوب للوصول إلى تركيز الخلية النهائية.
4. فورا تجميد الخلايا في 1-2 مل تخزن. تجميد التخزن في الفريزر معدل الخاضعة للرقابة أو في حاويه تجميد وضعت في-80 درجه مئوية ، والذي يقلل من درجه الحرارة بنسبه 1 درجه مئوية/دقيقه. بعد التجميد الخاضع للرقابة (بين عشيه وضحيها لتجميد الحاويات) ، نقل الخلايا إلى النيتروجين السائل للتخزين علي المدى الطويل.

النتائج

باستخدام الطريقة المفصلة هنا ، تم عزل ASCs بنجاح من العينات الشحمية وشد البطن (الشكل 1). بعد ثلاثه مقاطع ، تم العثور علي الخلايا المعزولة ان يكون المورفولوجية MSC (غير متناظرة ، شكل المغزل) والنمط الظاهري ، علي غرار ASCs بعد الهضم الانزيمي (الشكل 2). وقد أظهرت الدراسات السابقة من مجموعتنا وغيرها هذه ascs للتمييز في الخلايا الشحمية, الخلايا العظمية, والخلايا العصبية مثل mscs الأخرى, بما في ذلك ascs معزولة بوسائل أخرى^11,21.

في معظم الحالات ، يمكن تصور الهجرة ASCs علي لوحه ثقافة الانسجه في غضون 3-5 أيام عن طريق المجهر الميداني مشرق. ومع ذلك ، في بعض الحالات ، ستكون الخلايا المتفرقة فقط مرئية بعد 7 أيام. في حالات نادره ، لن تهاجر الخلايا إلى الصفيحة و/أو لن تتكاثر حتى الممر الثالث. وترتبط هذه النتيجة عموما بتاخير في معالجه عينه الانسجه.

الشكل 1: التمثيل التخطيطي للعزل ASC من شد البطن والعينات الشحمية. تم الحصول علي عمليات شد البطن والعينات الشحمية كانسجه مرتجعه بعد الإجراءات الجراحية الروتينية. وقد مزقت عينات شد البطن ، وبعد ذلك اما شد البطن أو العينات الشحمية كانت مطليه بالشرح في وسائل الاعلام الثقافة الانسجه. هاجرت ال ASCs من النسيج ، نحو وسائل الاعلام الغنية بالمغذيات. بعد أسبوع واحد ، تمت أزاله الشرح ومثقف ASCs للاختبار المصب و/أو التطبيق السريري. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: ألواح العازلة المعزولة مع شكل الماجستير والنمط الظاهري. ASCs معزولة بواسطة الانزيم خاليه ، طريقه الشرح لديها المورفولوجية MSC والنمط الظاهري في مرور 3. (A) مثل mscs الأخرى ، هذه ascs لديها غير متناظرة ، وشكل المغزل ، سواء كانت معزولة عن طريق الشرح أو طريقه الانزيميه (علي سبيل المثال ، كولاجيناز). ال [اسيكس] يعزل يستعمل الانزيم أسلوب غله طويلة, يشكل شكل ضيقه بالمقارنة إلى ال [اكسثنت] يعزل [اسيتس]; تشبه هذه الاخيره MSCs المشتقة من أساليب العزل الخالية من الانزيمات الأخرى ، مثل نخاع العظم المشتقة-MSCs. (ب) مثل mscs الأخرى ، تكون ascs المعزولة التوضيحية سالبه ل CD45 وايجابيه ل CD73 و CD90 و CD105. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Discussion

ASCs هي مصدر جذاب من MSCs نظرا لسهوله الوصول إلى الانسجه. النسبة للتطبيقات السريرية والبحثية علي حد سواء ، يجب علي العلماء ان يضعوا في اعتبارهم تباين المانحين عند عزل هذه الخلايا وزراعتها. ولأسباب لم يتم توضيحها بعد ، تظهر MSCs من مختلف الجهات المانحة قدرات مختلفه للانتشار في المختبر ، والتي ستؤثر لاحقا علي هجره الشركة من القدرة علي التكاثر والانتشار الدهني. في حين يمكن ملاحظه تقلب في الوقت الذي يستغرقه لل ASCs معزولة من هذه التفسيرات خاليه من الانزيمات للوصول إلى كونفلوينسي, كان من النادر بالنسبة للعينه لا تتكاثر في المختبر.

والي جانب تقلبات الجهات المانحة ، فان المصدر الأكثر احتمالا لفشل الخلايا في الهجرة من الانسجه و/أو التكاثر في المختبر هو طول الوقت الذي تم فيه تخزين النسيج قبل المعالجة. وعندما سمح للعينات بالجلوس لمده > 12 ساعة قبل التجهيز أو لم يتم الاحتفاظ بها رطبه بين الحصاد والتجهيز ، لوحظت معدلات هجره وانتشار أكثر فقرا. العينات الوحيدة التي كثيرا ما فشلت في التكاثر هي عينات شد البطن التي لم تكن رطبه مع محلول ملحي: في هذه الحالات ، كان النسيج في مركز كتله الانسجه في كثير من الأحيان رطبه بما يكفي لمعالجه ، ولكن في بعض الأحيان تحتاج إلى التخلص منها. التالي فمن المهم للحفاظ علي الانسجه رطبه من وقت الحصاد من خلال تجهيز.

في الحالات التي لا يلاحظ فيها ASCs علي لوحه في 1 علامة الأسبوع ، يجب أزاله المواد التوضيحية الدهنية لا يزال من لوحات ثقافة الانسجه لئلا يحدث نخر الانسجه. في بعض الأحيان هناك عدد قليل جدا من الخلايا لتحديد بسهوله ، ولكن تلك الخلايا القليلة ستكون قادره علي التوسع داخل نظام الثقافة. إذا كانت الخلايا لا تزال لا تلاحظ في 3 أسابيع ، يجب ان تعتبر العزلة فشل.

في بعض الحالات ، وخاصه من شد البطن ، فانه ليس من الممكن الحصول علي عينه معقمه حقا بسبب القيود داخل الساحة الجراحية. إذا لم يكن من الممكن استخدام سفينة معقمه لنقل الانسجه من غرفه العمليات إلى غطاء التيار الصفحي ، وأزاله الخارجي 1 سم من الانسجه عموما كافيه لمنع تلوث الكائنات الحية المجهرية. إذا تم إرفاق عينه شد البطن بالجلد ، يمكن مسح الجلد باستخدام الايثانول 70% لتعقيم ذلك السطح قبل فرم الانسجه الدهنية.

اثناء عمليه الفرم ، من المهم ان يكون النسيج مفروما في قطع صغيره ودقيقه. إذا كان الشرح كبيرا جدا ، سيكون هناك مساحة سطح غير كافيه ل ASCs للهجرة من الانسجه وعلي لوحه. وعلاوة علي ذلك ، فمن الاهميه بمكان ان الانسجه لا تبقي في لوحه اي أطول من اللازم خشيه ان تصبح الانسجه نخريه.

الحد من هذه الطريقة هو استخدام انزيم (في البروتوكول الموصوف ، التريبسين) لفصل الخلايا الشحمية اثناء عمليه استزراع الانسجه. الانزيمات الأخرى غير الحيوانية المشتقة ، مثل Accutase ، يمكن استبدالها لأزاله الحاجة للمنتجات الحيوانية المشتقة ، ومع ذلك ، فان هذا سيزيد من تكلفه ثقافة الانسجه. لهذا السبب ، من بين أمور أخرى ، تقوم العديد من المجموعات بالتحقيق في أساليب زراعه الانسجه غير الثنائية الابعاد مثل المفاعلات الحيوية والنظم القائمة علي السقالات لزيادة إمكانات نمو MSC مع تقليل الحاجة إلى فصل الخلايا عن الركيزة²².

عند نقل ASCs إلى العيادة ، والحد الرئيسي من طريقه العزلة الشرح هو الاعتماد علي ممارسه التصنيع الجيدة (GMP) مستوي الانسجه ثقافة المرفق ، التي تفتقر إلى العديد من المراكز الطبية. وفي هذه الحالات ، سيلزم استخدام اي من الأساليب المتاحة تجاريا القائمة علي الانزيمات أو الطرد الذاتي. ومع ذلك ، وبما ان مرافق GMP أصبحت أكثر انتشارا ، فمن المتوقع ان يكون هذا التاثير محدودا. في هذه الاثناء ، حتى مثل هذه المرافق التي تفتقر إلى مرافق الزراعة الانسجه GMP يمكن النظر في استخدام طريقه الشرح لدراسة ASCs في المختبر: واقل التلاعب ، وأكثر أقرب هذه الخلايا هي لنظراءهم في الجسم المجري¹¹.

توفر هذه الطريقة طريقه بسيطه لعزل الانسجه الدهنية من النسيج الشحمي — الشفط الشحمي والبطني — في غياب الانزيمات القاسية أو الخطوات الطردة. وفي حين ان الغلة الاوليه لهذه المراكز اقل من الطرق الأخرى ، فانها ستتكاثر في المختبر ، مما يقلل من تاثير الغلة الاوليه المنخفضة. وعدم وجود تلاعب مفرط أو قوي يجعل المراكز المذكورة معزولة بهذه الطريقة ذات الاهميه الخاصة ، حيث ان هناك عددا اقل من الاسئله (اي ما إذا كانت الآثار المرصودة ترجع إلى الخلايا نفسها أو إلى تلاعب الخلايا اثناء عمليه العزل ).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Bioreagents	BP231
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5671
Falcon 3003 tissue culture plates	Corning	Corning
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	serum is batch tested to ensure it supports MSC growth
L-Glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513
Mr. Frosty	Nalgene	5100-0001
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049