Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا العمل التوليف والتوصيف لـ pomalidomide القائم على، ثنائي ة وظيفية هومو-بروتك كنهج جديد للحث على كل مكان وتدهور E3 ubiquitin ligase cereblon (CRBN)، وهو الهدف من النظائر الثاليدوميد.

Abstract

الأدوية المناعية (IMiDs) الثاليدوميد ونظائرها، lenalidomide وpomalidomide، وافقت جميع ادارة الاغذية والعقاقير لعلاج الورم النقوي المتعدد، والحث على كل مكان وتدهور عوامل النسخ اللمفاوي ة Ikaros (IKZF1) وAiolos (IKZF3) عن طريق سيريبلون (CRBN) E3 يوبيكويتين الرباطي للتدهور البروتياسومال. وقد استخدمت مؤخرا IMiDs لتوليد التحلل البروتيوليسي ثنائي وظيفية التي تستهدف chimeras (PROTACs) لاستهداف البروتينات الأخرى للتدهور في كل مكان وبروتياسومال من قبل الرباط يَكِنْ ر. بنُ3. قمنا بتصميم وتوليف PROTACs المتجانسة القائمة على pomalidomide وحللت قدرتها على الحث على توجيه ذاتي في كل مكان وتدهور CRBN. هنا, CRBN بمثابة على حد سواء, وE3 في كل مكان ligase والهدف في نفس الوقت. مركب هومو-بروتك 8 يتحلل CRBN مع فعالية عالية مع الحد الأدنى فقط من الآثار المتبقية على IKZF1 و IKZF3. لم يكن للتعطيل CRBN بواسطة مركب 8 أي تأثير على صلاحية الخلية وانتشار خطوط الخلايا النقوية المتعددة المختلفة. هذا homo-PROTAC يلغي آثار IMiDs في خلايا الورم النقوي متعددة. ولذلك، قد تساعد مركباتنا المستندة إلى بوماليدوميد المتجانسة على تحديد الركائز الذاتية والوظائف الفسيولوجية لـ CRBN والتحقيق في الآلية الجزيئية للـ IMiDs.

Introduction

الأدوية المناعية (IMiDs) الثاليدوميد ونظائرها، lenalidomide وpomalidomide، وكلها معتمدة لعلاج الورم النقوي المتعدد، وربط E3 يوبيكويتين ligase cereblon (CRBN)، محول الركيزة لcullin4A-RING E3 في يوبيكويتين ligase (CRL4CRBN)1،2،3. ربط IMiDs يعزز تقارب CRL4CRBN لعوامل النسخ اللمفاوي ة Ikaros (IKZF1) وAiolos (IKZF3)، مما يؤدي إلى كل مكان والتدهور (الشكل1)4،5، 6 , 7 , 8.منذ IKZF1 و IKZF3 ضرورية لخلايا الورم النقوي متعددة, نتائج تعطيلها في تثبيط النمو. تم العثور على SALL4 مؤخرا كالركيزة الجديدة التي يسببها IMiD من CRBN التي من المرجح أن تكون مسؤولة عن المسخ وما يسمى كارثة Contergan في 1950s الناجمة عن الثاليدوميد9،10. وعلى النقيض من ذلك، فإن الكازين كيناز 1α (CK1α) هو الركيزة الخاصة بالليناليدوميد من CRBN التي تورطت في التأثير العلاجي في متلازمة خلل التنسج النخاعي مع حذف كروموسوم 5q11.

إن قدرة الجزيئات الصغيرة على استهداف بروتين معين للتحلل هي دلالة مثيرة على تطوير الأدوية الحديثة. في حين تم اكتشاف آلية الثاليدوميد ونظائرها بعد استخدامها لأول مرة في البشر، ما يسمى Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) وقد تم تصميمها لاستهداف على وجه التحديد بروتين من الفائدة (POI) (الشكل 2)12،13،14،15،16،17،18. PROTACs هي جزيئات heterobifunctional التي تتكون من ligand محددة لPOI متصلة عن طريق رابط إلى الرباط من الليغا سمعة E3 ubiquitin مثل CRBN أو فون هيبل لينداو (VHL)18,19,20, 21،22. PROTACs الحث على تشكيل مجمع ثلاثي عابر، وتوجيه POI إلى الليغا في كل مكان E3، مما أدى إلى وجود في كل مكان والتدهور البروتياسومال. المزايا الرئيسية لPROTACs على مثبطات التقليدية هو أن ملزمة لPOI كافية بدلا من تثبيط لها، وبالتالي PROTACs يمكن أن تستهدف مجموعة أوسع بكثير من البروتينات بما في ذلك تلك التي كانت تعتبر غير قابلة للمخدرات مثل [ ترجمفب 15] وبالإضافة إلى ذلك، تعمل جزيئات الشميرية بشكل حفاز، وبالتالي يكون لها قوة عالية. بعد نقل ubiquitin إلى POI، ينفصل المجمع الثلاثي وهو متاح لتشكيل مجمعات جديدة. وهكذا، تركيزات PROTAC منخفضة جدا كافية لتدهور البروتين المستهدف23.

هنا نقوم بوصف التوليف من pomalidomide-pomalidomide مترافق homo-PROTAC (مجمع 8) أن يجند CRBN لتدهور نفسها24. وE3 ubiquitin ligase CRBN بمثابة كل من المجند والهدف في نفس الوقت (الشكل3). للتحقق من صحة بياناتنا، قمنا أيضًا بتوليف عنصر تحكم سلبي ملزم (مركب 9). وتؤكد بياناتنا أن هومو-بروتك التوليف حديثا ً محدد لتدهور CRBN ولا له سوى آثار طفيفة على البروتينات الأخرى.

Protocol

1. إعداد جزيئات بروتك

تنبيه: يرجى الرجوع إلى جميع أوراق بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في هذه المرادفات سامة ومسرطنة. يرجى استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية.

  1. إعداد tert-butyl N-(2,6-ديوكسو-3-piperidyl) كارباميت (مركب 1)
    1. إضافة 1,1'-كاربونيلديميدازول (1.95 غرام، 12 مليمول) وكمية حفازة من 4-(ثنائي ميثيل أمينو)بيريدين (5 ملغ) إلى خليط من Boc-Gln-OH (2.46 غرام، 10 ملمول) في THF (50 مل) في 100 مل قارورة أسفل جولة مع شريط ضجة ومجهزة مكثف الجزر. يُسخّن المزيج في الجزر لمدّة 10 ساعة مع التحريك حتى يتمّ التوصل إلى حل واضح.
    2. إزالة المذيب تحت ضغط منخفض مع المبخر الدوارة، إضافة EtOAc (200 مل) ونقله إلى قمع فاصل. اغسل الطبقة العضوية بـ H2O (50 مل) ومحلول ملحي (50 مل) وجففها فوق Na2SO4.
    3. تصفية الحل من خلال لوحة قصيرة من هلام السيليكا (5 سم قطرها وارتفاع 5 سم) وeluate مع حجم إضافي (200 مل) من EtOAc.
    4. تتبخر المذيبات وتجف الصلبة التي تم الحصول عليها عديم اللون في vacuo.
  2. إعداد tert-butyl N-(1-ميثيل-2،6-ديوكسو-3-بيبيريديل) كارباميت (مركب 2)
    1. الجمع بين مركب 1 (2.28 غرام، 10 مليمول) مع كربونات البوتاسيوم المطحون (2.76 غرام، 20 مليمول) وDMF (25 مل) في قارورة أسفل جولة 100 مل. إضافة يودوميثان (1.42 غرام، 0.62 مل، 10 مل) قطرة الحكمة باستخدام حقنة وتجهيز قارورة مع الحاجز المطاطي المثقوب. وضع وعاء رد الفعل في حمام ultrasonication لمدة 2 ح.
    2. تمييع خليط التفاعل مع EtOAc (100 مل) ونقله إلى قمع فاصل. اغسل الطبقة العضوية بـ 1 N NaOH (2x 25 مل)، H2O (25 مل)، ومحلول ملحي (25 مل)، وجففها على Na2SO4.
    3. تصفية وتبخر المذيب. تنقية المنتج عن طريق الكروماتوغرافيا العمود على هلام السيليكا (6 سم قطر العمود وارتفاع 20 سم) باستخدام الأثير النفط / EtOAc (2:1).
  3. إعداد 2-(2,6-ديوكسوبيبريدين-3-yl)-4-فلوروإيزويندولين-1,3-ديون (مركب 3)
    1. الجمع بين 3-الفلوروفثاليك أنهيدريد (1.25 غرام، 7.5 مليمول)، غلوتاريميد 1 (1.14 غرام، 5 مليمول) وحل خلات الصوديوم (0.50 غرام، 6.0 مل) في حمض الخليك الجليدي (20 مل) في قارورة أسفل جولة 50 مل مع شريط ضجة ومجهزة مكثف الجزر. يُسخّن المزيج عند 120 درجة مئوية لمدّة 6 ساعة.
    2. بعد التبريد، صب الخليط الأرجواني على H2O (100 مل) ويحرك لمدة 10دقيقة.
  4. إعداد 4-فلورو-2-(1-ميثيل-2،6-ديوكسوبيبريدين-3-yl) إيزويندولين-1،3-ديون (مركب 4)
    1. الجمع بين 3-الفلوروفثاليك أنهيدريد (1.25 غرام، 7.5 مليمول)، غلوتاريميد 2 (1.21 غرام، 5 مليمول) وحل خلات الصوديوم (0.50 غرام، 6.0 مليمول) في حمض الخليك الجليدي (20 مل) في قارورة أسفل جولة 100 مل مع شريط تحريك ومجهزة مكثف الجزر. يُسخّن المزيج عند 120 درجة مئوية لمدّة 6 ساعة.
    2. بعد التبريد، صب الخليط الأرجواني على H2O (100 مل) ويحرك لمدة 10دقيقة.
  5. إعداد tert-butyl N-[2-2-[2-[[2-(2,6-dioxo-3-piperidyl)-1,3-dioxo-isoindolin-4-yl]amino]ethoxy]ethoxy]ethyl]carbamate (compound 7)
    1. شحن قارورة أسفل جولة 50 مل مع tert-butyl N-[2-2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate (5, 0.41 g, 1.65 mmol), compound 3 (0.41 g, 1.50 mmol), DMF الجافة (10 مل) وDIPEA (0.39 غرام, 0.51 مل, 3.0 مل). تجهيز مع شريط تحريك ومكثف الجزر. الحرارة تحت الغلاف الجوي الأرجون في 90 درجة مئوية لمدة 10 ساعة.
    2. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة، صب الخليط الأخضر الداكن على H2O (100 مل) واستخراج مع EtOAc (3X 50 مل) في قمع فاصل. غسل الطبقات العضوية مجتمعة مع H2O (50 مل) ومحلول ملحي (50 مل)، والجافة على Na2SO4،مرشح، والتركيز في vacuo.
    3. تنقية المنتج الخام عن طريق الكروماتوغرافيا العمود على هلام السيليكا (3 سم قطر العمود وارتفاع 60 سم) باستخدام تدرج من الأثير النفط / EtOAc (1:1 إلى 1:2).
  6. إعداد هوموديمر (مركب 8)
    1. الجمع بين α،ω-ديامين linker 6 (0.22 غرام، 0.22 مل، 1.50 مل)، ديبا (1.05 مل، 6.00 مل مول) وحل 3 (0.83 غرام، 3.00 مل) في DMSO الجافة (20 مل) في قارورة أسفل جولة 50 مل مع شريط تحريك ومجهزة مكثف الجزر. الحرارة تحت الغلاف الجوي الأرجون في 90 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
    2. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة، صب الخليط الأخضر الداكن على H2O (100 مل) واستخراج مع EtOAc (3X 50 مل) في قمع فاصل. غسل الطبقات العضوية مجتمعة مع H2O (50 مل) ومحلول ملحي (50 مل)، والجافة على Na2SO4،وتصفية والتركيز في vacuo.
    3. تنقية المنتج الخام عن طريق الكروماتوغرافيا العمود على هلام السيليكا (3 سم قطر العمود وارتفاع 50 سم) باستخدام تدرج من الأثير النفط / EtOAc (1:2) إلى EtOAc.
  7. إعداد هيتروديمر (مركب 9)
    1. حل مركب 7 (0.83 غرام، 1.65 مليمول) في CH الجافة2كل2 (10 مل). يُضاف حمض ثلاثي فلورو سيتيك (10 مل) ويُحرّك المزيج الأصفر عند درجة حرارة 40 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في قارورة سفلية مستديرة بمقدار 50 مل.
    2. إزالة المتطايرات وcoevaporate مع CH2Cl2 (4X 5 مل). تجفيف بقايا في vacuo لمدة 10 ساعة.
    3. إعادة إذابة المواد في DMF الجافة (20 مل). إضافة مركب 4 (0.44 غرام، 1.50 مليمول) وDIPEA (0.78 غرام، 1.05 مل، 6.00 مل) وتجهيز قارورة مع مكثف الجزر. الحرارة تحت الغلاف الجوي الأرجون في 90 درجة مئوية لمدة 10 ساعة.
    4. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة، صب الخليط الأخضر الداكن على H2O (100 مل) واستخراج مع EtOAc (3X 50 مل) في قمع فاصل. غسل الطبقات العضوية مجتمعة مع المشبعة NaHCO3 (50 مل)، H2O (50 مل)، 10٪ KHSO4 (50 مل)، H2O (50 مل)، ومحلول ملحي (50 مل)، والجافة على Na2SO4،فلتر والتركيز في vacuo.
    5. تنقية المنتج الخام عن طريق الكروماتوغرافيا العمود على هلام السيليكا (3 سم قطر العمود وارتفاع 50 سم) باستخدام تدرج من الأثير النفط / EtOAc (1:2) إلى EtOAc.
    6. توضيح هيكل الجزيء والتحقق منه (مركبالشكل 5A 8،مركب 5B 9)بواسطة 1H NMR و 13C NMR الأطياف في DMSO-d6 على الرنين المغناطيسي النووي (NMR) مطياف. تحقق من أن نقاء كلا المركبين أعلى من 97٪ عن طريق قياس الطيف الكتلي اللوني السائل (LC-MS)، وتطبيق الكشف عن صفيف الصمام الثنائي (DAD) في 220-500 نانومتر.

2. التحقق الوظيفي من جزيئات بروتك

  1. تحليل اللطخة الغربية لتدهور CRBN من قبل PROTACs
    ملاحظة: آثار مركب8ومجمع9على مستوى البروتين CRBN تم اختبارها من قبل تحليل وصمة عار الغربية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تأكيد التأثير على مستويات IKZF1 و IKZF3 (الشكل 6).
    1. إعداد العينات
      1. حل المركبات 8 و 9، lenalidomide (لين) ، pomalidomide (بوم) ، MG132 ، وMLN-4924 في DMSO بتركيز 10 MM ، aliquot وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
      2. البذور 1 × 106 خلايا MM1S في لوحة 6 جيدا مع وسائل الإعلام 2.5 مل وعلاج الخلايا مع 100 nM أو 1 مجمع ميكرومتر 8 أو 9 لمدة 24 ساعة.
      3. خلايا الحصاد بعد المعالجة والطرد المركزي في 700 × ز، 5 دقيقة، 4 درجة مئوية. غسل بيليه الخلية مع الباردة 1X PBS لإزالة الوسائط المتبقية، الطرد المركزي في 700 × ز، 5 دقيقة، 4 درجة مئوية، وتجاهل supernatant. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
      4. خلايا الليس في التحلل العازلة (25 mM تريس حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.4، 150 مل NaCl، 1٪ NP-40، 1 MM EDTA، 5٪ الجلسرين، 1X البروتياز وPhosphatase كوكتيل المانع) لمدة 10 دقائق على الجليد، الطرد المركزي في 320 × ز لمدة 10 دقائق، 4 درجة مئوية. حصاد supernatant وتحديد تركيز البروتين عن طريق اختبار بروتين حمض bicinchoninic (اختبار BCA) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      5. البروتينات تشوه (15-30 ميكروغرام / عينة) مع 1X LDS تحميل العازلة (5٪ 2-mercaptoethanol) ويغلي 10 دقيقة، 75 درجة مئوية.
    2. SDS-PAGE
      1. إصلاح ساندويتش هلام مع هلام فصل 10٪ [4 مل 3X هلام العازلة (3 M تريس / حمض الهيدروكلوريك، 0.3٪ (ث / الخامس) كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS)، درجة الحموضة 8.45)، 4 مل أكريلاميد 30٪، 2.52 مل الجلسرين 50٪، 1.395 مل H2O، 75 ميكرولتر 11٪ كبريتات الأمونيوم (APS)، و 9.75 ميكرولتر TEMED] و هلام التراص 4٪ [1.992 مل 3X هلام العازلة، 0.792 مل 30٪ أكريلاميد، 3.168 مل H2O، 36 ميكرول 11٪ APS، و 6 درجة مئوية TEMED] في وحدة تجميع القطب الكهربائي. إزالة أمشاط، وآبار دافق مع العازلة الكاثود (100 MM تريس / حمض الهيدروكلوريك، 100 mM tricine، 0.1٪ (ث / الخامس) SDS)، وتحميل العينات.
      2. ملء المخزن المؤقت الأنود (100 mM Tris/HCl، الحموضة 8.9) في الخزان. تحميل عينة البروتين من الخطوة 2.1.1.4 وتشغيل SDS-PAGE في 70 V، 20 دقيقة، تليها 115 V، 150 دقيقة في الجهد المستمر.
    3. مناعة والكشف عن CRBN، IKZF1 و IKZF3
      1. تنشيط غشاء PVDF (0.45 ميكرومتر) في الميثانول 100٪ لمدة 1 دقيقة. غشاء Equilibrate وفصل هلام في 1X نقل العازلة [10X نقل العازلة (192 مل غليسين، 25 mM تريس قاعدة / حمض الهيدروكلوريك، 900 مل H2O)، 20٪ الميثانول، 0.1٪ SDS، pH 8.3].
      2. تجميع كاسيت النشاف وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. نقل هلام في 180 مأ لمدة 90 دقيقة.
      3. غسل غشاء 3X في 1X TBS-T (25 MT Tris / HCl، 150 مل NaCl، درجة الحموضة 7.6، 0.1٪ توين 20) لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. كتلة غشاء في 5٪ الحليب المجفف غير الدهون (NFDM)، TBS-T لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل غشاء 3X في 1X TBS-T لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة.
      4. احتضان غشاء مع الأجسام المضادة الأولية لCRBN (1:500 في 5٪ BSA، TBS-T) مع هز لطيف في 4 درجة مئوية، بين عشية وضحاها.
      5. غسل غشاء 3X في 1X TBS-T لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. الغشاء الحضانة مع المضادة للماوس (1:10.000 في 5٪ NFDM، TBS-T) أو المضادة للأرنب (1:5.000 في 5٪ NFDM، TBS-T) الأجسام المضادة الثانوية إلى جانب الفجل peroxidase HRP (1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.)
      6. غسل غشاء 2X في 1X TBS-T لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة مرتين مع TBS 1x.
      7. احتضان غشاء لمدة 2 دقيقة مع حل الركيزة HRP وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة والكشف عن chemiluminescence في جهاز الكشف عن chemiluminescence.
      8. غسل غشاء 1X في 1X TBS لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. للإفراج عن الأجسام المضادة، غشاء الشريط في المخزن المؤقت تجريد المتاحة تجاريا لمدة 15 دقيقة.
      9. إعادة حظر الغشاء في 5٪ الحليب المجفف غير الدهون، TBS-T لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل غشاء 3X في 1X TBS-T لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة وإعادة التحقيق مع IKZF1، IKZF3 أو توبولين وفقا للخطوة 2.1.3.4.
  2. تجارب المنافسة مع MG132، MLN4942 أو pomalidomide
    ملاحظة: للتأكد من ما إذا كان CRBN المتدهورة عبر مسار ubiquitin-proteasome، قمنا بإجراء تجارب المنافسة مع مثبطات بروتياسوم MG132ومثبط تنشيط الإنزيم (NAE) MLN4942 (الشكل 7).
    1. البذور 1 × 106 MM1S الخلايا لكل بئر في لوحة 6 جيدا. خلايا الإنقراض مع 10 ميكرومتر MG132، 10 μM MLN4942، أو lenalidomide (100x)، وحضانة 1 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
    2. إضافة 100 nM مركب 8 لمدة 3 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
    3. خلايا الحصاد لللطخة الغربية وفقا للخطوة 2.1.1.
  3. اختبار صلاحية الخلايا في خطوط خلايا الورم النقوي المتعددة
    ملاحظة: يتم استخدام هذا الفحص لاختبار التأثير على قدرة الخلية على البقاء، بالإضافة إلى ذلك، تعادي تأثير IMiDs على خلايا الورم النقوي المتعددة عن طريق المعالجة المسبقة للخلايا مع المركب 8 (الشكل 8، الشكل 9A ، B).
    1. البذور 5 × 104 خلايا MM1S لكل بئر في لوحة 96 جيدا في triplicates البيولوجية للحصول على اختبار الصلاحية. لتحليل وصمة عار الغربية، البذور 1 × 106 خلايا MM1S في بئر في لوحة 6 جيدا في triplicates البيولوجية.
    2. علاج الخلايا مع DMSO أو 100 nM، 1 μM، أو 10 م مركب 8،مركب 9 أو pomalidomide وحضانة لمدة 24 ساعة، 48 ساعة، أو 96 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. لتجارب الإنقاذ، علاج الخلايا مع 100 nM مركب 8 لمدة 3 ساعة، قبل أو بعد إضافة 1 μM pomalidomide وحضانة لمدة 96 ساعة.
    3. قياس الإنارة لوحة 96 جيدا مع اختبار صلاحية الخلية الإنارة، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة على قارئ لوحة أو خلايا الحصاد من لوحة 6-جيدا لتحليل وصمة عار الغربية.

النتائج

هنا وصفنا تصميم، والتوليف والتقييم البيولوجي لPROTAC المستندة إلى pomalidomide المتجانسة لتدهور CRBN. يتفاعل PROTAC لدينا في وقت واحد مع اثنين من جزيئات CRBN وتشكل المجمعات الثلاثية التي تحفز على التحلل الذاتي في كل مكان وتدهور البروتياسومال من CRBN مع الحد الأدنى فقط من الآثار المتبقية ...

Discussion

تصميم مثل هذه proTACs الإنسان كما هو موضح هنا لCRBN يعتمد على تقارب محددة من pomalidomide إلى CRBN، والتي تم استخدامها بنجاح في العديد من PROTACs heterobifunctional وأدى إلى تطوير PROTAC 8 باعتبارها عالية انتقائية CRBN المهينة. وقد تم بالفعل تأكيد خصوصية جزيء لدينا من قبل التحليلات البروتيومية24. با...

Disclosures

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن احتمال وجود تضارب مالي في المصالح.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل برنامج "برنامج إيمي- نوثير Kr-3886/2-1" وSFB-1074 إلى J.K.؛ FOR2372 إلى M.G.)

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,1'-CarbonyldiimidazoleTCI chemicalsC0119
2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine)Sigma-Aldrich385506Compound 6
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3-Fluorophthalic anhydride, 98 %Alfa AesarA12275
4-Dimethylaminopyridine, 99 %Acros148270250Toxic
Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)Carl Roth3029.1
Aiolos (D1C1E) mABCell signaling15103S
Anti-CRBN antibody produced in rabbitSigmaHPA045910
Anti-rabbit IgG HRP-linked antibodySigma7074S
Ammonium PersulfateRoth9592.2
Boc-Gln-OHTCI chemicalsB1649
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7906-100G
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability AssayPromegaG7571
ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
DMF, anhydrous, 99.8 %Acros348435000Extra Dry over Molecular Sieve
DMSO, anhydrous, 99.7 %Acros348445000Extra Dry over Molecular Sieve
GlycineSigma-Aldrich15523-1L-R
Goat anti-mouse (HRP conjugated)Santa Cruz biotechnologysc-2005
Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X)Thermo Scientific1861280
Ikaros (D6N9Y) MabCell signaling14859S
ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm)MerckIPVH000010
Iodomethane, 99 %Sigma-AldrichI8507Highly toxic
MethanolSigma-Aldrich32213-2.5L
Mg132SelleckchemS2619
Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cellBio-Rad1703930
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellBio-Rad1658004
MLN4942biomol (cayman)Cay15217-1
Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512)SigmaT5168
N-Ethyldiisopropylamine, 99 %Alfa AesarA11801
Nonfat dried milk powderPanReac AppliChemA0830,0500
Nunc F96 MicroWell White Polystyrene PlateThermo Scientific136101
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)Thermo ScientificNP0008
Pierce BCA Protein Assay kitThermo Scientific23225
PomalidomideSelleckchemS1567
RestoreTM Western Blot Stripping BufferThermo Scientific46430
sodium dodecyl sulfateCarl Roth183.1
Sodium ChlorideSigma-AldrichA9539-500g
TEMEDCarl Roth2367.3
tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamateSigma-Aldrich89761Compound 5
TricinCarl Roth6977.4
Trizma baseSigma-AldrichT1503-1kg
Tween-20Sigma-AldrichP7949-500ml
WesternBright ECL sprayAdvanstaK-12049-D50

References

  1. Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
  2. Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
  3. Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
  4. Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
  5. Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).
  6. Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
  7. Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
  8. Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
  9. Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
  10. Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
  11. Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
  12. Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
  13. Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
  14. Schneekloth, J. S., et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
  15. Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).
  16. Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
  17. Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017).
  18. Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
  19. Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).
  20. Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
  21. Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
  22. Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
  23. Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
  24. Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
  25. Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
  26. Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
  27. Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
  28. Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
  29. Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
  30. Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
  31. Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
  32. Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
  33. Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
  34. Kim, H. K., et al. Cereblon in health and disease. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).
  35. Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147CRBNPROTACIMiDpomalidomideubiquitin ligase

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved