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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo lavoro descrive la sintesi e la caratterizzazione di un omo-PROTAC bimalidomide a base di pomalimmide come un nuovo approccio per indurre l'ubiquitinazione e la degradazione della cereblon della ligase dell'ubiquitina E3 (CRBN), l'obiettivo degli analoghi di talidomide.

Abstract

I farmaci immunomodulatori (IMid) e i suoi analoghi, lenalidomide e pomalidomide, tutti i farmaci approvati dalla FDA per il trattamento del mieloma multiplo, inducono l'ubiquitazione e la degradazione dei fattori di trascrizione linfoide Ikaros (IK-F1) e Aiolos (IK-F3) tramite il cereblon (CRBN) E3 ubiquitina ligase per degradazione proteasomica. Gli IMID sono stati recentemente utilizzati per la generazione di chimere di proteolisi bifunzionale targeting (PROTAC) per indirizzare altre proteine per l'ubiquitinazione e la degradazione proteasomica da parte della ligase CRBN E3. Abbiamo progettato e sintetizzato proTAC omobifunzionali basati su pomalidomide e analizzato la loro capacità di indurre l'ubiquitinazione e la degradazione di CRBN. Qui, CRBN serve come entrambi, l'E3 ubiquitin ligase e l'obiettivo allo stesso tempo. Il composto omo-PROTAC 8 degrada il CRBN con un'alta potenza con solo effetti residui minimi su IK-F1 e IK-F3. L'inattivazione di CRBN da parte del composto 8 non ha avuto alcun effetto sulla vitalità cellulare e sulla proliferazione di diverse linee cellulari multiple del mieloma. Questo omo-PROTAC abroga gli effetti degli IMID in più cellule del mieloma. Pertanto, i nostri composti omodimeri a base di pomalidomide possono aiutare a identificare i substrati endogeni e le funzioni fisiologiche del CRBN e a studiare il meccanismo molecolare degli IMID.

Introduzione

I farmaci immunomodulatori (IMid) e i suoi analoghi, lenalidomide e pomalidomide, tutti approvati per il trattamento del mieloma multiplo, si legano alla sigillante ligase dell'ubiquitina E3 (CRBN), un adattatore substrato per l'ubiereanzi a 2la-RING E3 (CRL4CRBN)1,2,3. L'associazione degli IMiD aumenta l'affinità di CRL4CRBN ai fattori di trascrizione linfoidi Ikaros (IK-F1) e Aiolos (IK-F3), portando alla loro ubiquitazione e degradazione (Figura 1)4,5, 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8. Dal momento che iK-F1 e IK-F3 sono essenziali per le cellule multiple del mieloma, la loro inattivazione provoca inibizione della crescita. SALL4 è stato recentemente trovato come un ulteriore neo-substrato indotta da IMiD di CRBN che è probabilmente responsabile della teratogenicità e della cosiddetta catastrofe Contergan negli anni '50 causata dalla talidomide9,10. Al contrario, la cassicina 1 è un substrato di CRBN specifico di lenalidomide che è implicato nell'effetto terapeutico nella sindrome della mielodiplastico con cromosoma 5q eliminazioni11.

La capacità delle piccole molecole di indirizzare una proteina specifica per la degradazione è un'implicazione interessante per lo sviluppo di farmaci moderni. Mentre il meccanismo della talidomide e dei suoi analoghi è stato scoperto dopo il loro primo utilizzo negli esseri umani, la cosiddetta Proteolisi Targeting Chimeras (PROTAC) sono stati progettati per indirizzare specificamente una proteina di interesse (POI) (Figura 2)12,13,14,15,16,17,18. I PROTAC sono molecole eterobifunzionali costituite da un ligando specifico per il POI collegato tramite un linker a un ligando di una ligase ubiquitina E3 come CRBN o von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. I PROCAC inducono la formazione di un complesso ternario transitorio, dirigendo il POI alla ligase dell'ubiquitina E3, con conseguente ubiquitinazione e degradazione proteasomica. I principali vantaggi dei PROTAC rispetto agli inibitori convenzionali sono che il legame a un POI è sufficiente piuttosto che la sua inibizione e quindi i PROTAC possono potenzialmente indirizzare uno spettro molto più ampio di proteine, comprese quelle considerate infarmacibili come fattori di trascrizione15. Inoltre, le molecole chimetriche agiscono cataliticamente e quindi hanno un'alta potenza. Dopo il trasferimento dell'ubiquitina al POI, il complesso ternario si dissocia ed è disponibile per la formazione di nuovi complessi. Pertanto, concentrazioni molto basse di PROTAC sono sufficienti per la degradazione della proteina bersaglio23.

Qui descriviamo la sintesi di una pomalimide-pomalidomide coniugata homo-PROTAC (composto 8) che recluta CRBN per la degradazione di se stesso24. L'E3 ubiquitin ligase CRBN è sia il reclutatore che l'obiettivo contemporaneamente (Figura 3). Per convalidare i dati, abbiamo anche sintetizzato un controllo di rilegatura negativo (composto 9). I nostri dati confermano che l'omo-PROTAC appena sintetizzato è specifico per la degradazione CRBN e ha solo effetti minimi su altre proteine.

Protocollo

1. Preparazione di molecole PROTAC

AVVISO: consultare tutte le schede tecniche di sicurezza dei materiali pertinenti (MSDS) prima dell'uso. Molte delle sostanze chimiche utilizzate in queste sintetisi sono tossiche e cancerogene. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate e le attrezzature di protezione personale.

  1. Preparazione del carbamate tert-butyl N-(2,6-dioxo-3-piperidyl)carbamate (composto 1)
    1. Aggiungere 1,1'-carbonyldiimidazole (1,95 g, 12 mmol) e una quantità catalitica di 4-(dimethylamino)pyridine (5 mg) a una miscela di Boc-Gln-OH (2,46 g, 10 mmol) in THF (50 mL) in 100 mL toder tostante in pallone da stiro con una barra di stir. Riscaldare a reflusso per 10 h mescolando fino a quando non si forma una soluzione chiara.
    2. Rimuovere il solvente a pressione ridotta con un evaporatore rotante, aggiungere EtOAc (200 mL) e trasferirlo in un imbuto separatore. Lavare lo strato organico con H2O (50 mL) e salamoia (50 mL) e asciugarlo su 52SO4.
    3. Filtrare la soluzione attraverso un breve cuscinetto di gel di silice (5 cm di diametro e 5 cm di altezza) ed eludere con un ulteriore volume (200 mL) di EtOAc.
    4. Evaporare il solvente e asciugare il solido incolore ottenuto in vacuo.
  2. Preparazione del carbamate tert-butyl N-(1-metil-2,6-dioxo-3-piperidyl)carbamate (composto 2)
    1. Unire composto 1 (2,28 g, 10 mmol) con carbonato di potassio macinato (2,76 g, 20 mmol) e DMF (25 mL) in un pallone rotondo rotondo da 100 mL. Aggiungere iodometano (1,42 g, 0,62 mL, 10 mmol) gocciolante utilizzando una siringa ed equipaggiare il pallone con un setto di gomma forato. Posizionare il vaso di reazione in un bagno di ultrasuoni per 2 h.
    2. Diluire la miscela di reazione con EtOAc (100 mL) e trasferirla in un imbuto separatore. Lavare lo strato organico con 1 N NaOH (2x 25 mL), H2O (25 mL) e salamoia (25 mL) e asciugarlo su Na2SO4.
    3. Filtrare ed far evaporare il solvente. Purificare il prodotto per cromatografia a colonna su gel di silice (6 cm di diametro della colonna e 20 cm di altezza) utilizzando etere di petrolio/EtOAc (2:1).
  3. Preparazione di 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-fluoroisoindoline-1,3-dione (composto 3)
    1. Combinare 3 acridride fluorofalico (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimide 1 (1,14 g, 5 mmol) e una soluzione di acetato di sodio (0,50 g, 6,0 mmol) in acido acetico glaciale (20 mL) in un fiascheggiante rotondo da 50 mL con una barra di stir e dotato di un condensatore di reflusso. Riscaldare il composto a 120 gradi centigradi per 6 h.
    2. Dopo il raffreddamento, versare la miscela viola su H2O (100 mL) e mescolare per 10 min. Raccogliere il solido formato per filtrazione, lavare con H2O (3 x 5 mL) e l'etere petrolifero (3 x 5 mL) e asciugare in vacuo.
  4. Preparazione di 4-fluoro-2-(1-metil-2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindoline-1,3-dione (composto 4)
    1. Combinare 3 acridride fluorofalico (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimide 2 (1,21 g, 5 mmol) e una soluzione di acetato di sodio (0,50 g, 6,0 mmol) in acido acetico glaciale (20 mL) in un flacone rotondo da 100 mL con una barra di stir dotata di un reflusso. Riscaldare il composto a 120 gradi centigradi per 6 h.
    2. Dopo il raffreddamento, versare la miscela viola su H2O (100 mL) e mescolare per 10 min. Raccogliere il solido formato per filtrazione, lavare con H2O (3 x 5 mL) e l'etere petrolifero (3 x 5 mL) e asciugare in vacuo.
  5. Preparazione del carbamate (composto 7) composto (composto 7) (composto 7)
    1. Caricare un pallone rotondo sul fondo da 50 mL con tert-butyl N-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate (5, 0,41 g, 1,65 mmol), composto 3 (0,41 g, 1,50 mmol), DMF secco (10 mL) e DIPEA (0,39 g, 0,51 mL, 3,0 mmol). Equipaggiare con una barra di agitazione e un condensatore di reflusso. Riscaldare sotto l'atmosfera argon a 90 gradi centigradi per 10 h.
    2. Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, versare la miscela verde scuro su H2O (100 mL) ed estrarre con EtOAc (3x 50 mL) in un imbuto separatore. Lavare gli strati organici combinati con H2O (50 mL) e salamoia (50 mL), asciugare su Na2SO4, filtrare e concentrarsi in vacuo.
    3. Purificare il prodotto grezzo per cromatografia a colonna su gel di silice (3 cm di diametro della colonna e 60 cm di altezza) utilizzando un gradiente di etere di petrolio/EtOAc (1:1 a 1:2).
  6. Preparazione dell'omodimero (composto 8)
    1. Combinare il linker di z, e diamina 6 (0,22 g, 0,22 mL, 1,50 mmol), DIPEA (1,05 mL, 6,00 mmol) e una soluzione di 3 (0,83 g, 3,00 mmol) in DMSO secco (20 mL) in una flacone di fondo tondo da 50 ml con una barra di collegsi. Riscaldare sotto l'atmosfera argon a 90 gradi centigradi per 18 ore.
    2. Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, versare la miscela verde scuro su H2O (100 mL) ed estrarre con EtOAc (3x 50 mL) in un imbuto separatore. Lavare gli strati organici combinati con H2O (50 mL) e salamoia (50 mL), asciugare su Na2SO4, filtrare e concentrarsi in vacuo.
    3. Purificare il prodotto grezzo per colonna cromatografia su gel di silice (3 cm di diametro colonna e 50 cm di altezza) utilizzando un gradiente di etere di petrolio / EtOAc (1:2) a EtOAc.
  7. Preparazione dell'eterodimero (composto 9)
    1. Sciogliere il composto 7 (0,83 g, 1,65 mmol) in secco CH2Cl2 (10 mL). Aggiungere l'acido trifluoroacetico (10 mL) e mescolare la miscela gialla a 40 gradi centigradi per 2 h in una fiaschetta rotonda chiusa da 50 ml.
    2. Rimuovere le sostanze volatili e coevaporare con CH2Cl2 (4x 5 mL). Asciugare il residuo in vacuo per 10 h.
    3. Sciogliere il materiale in DMF secco (20 mL). Aggiungere il composto 4 (0,44 g, 1,50 mmol) e DIPEA (0,78 g, 1,05 mL, 6,00 mmol) ed equipaggiare il pallone con un condensatore di reflusso. Riscaldare sotto l'atmosfera argon a 90 gradi centigradi per 10 h.
    4. Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, versare la miscela verde scuro su H2O (100 mL) ed estrarre con EtOAc (3x 50 mL) in un imbuto separatore. Lavare gli strati organici combinati con NaHCO3 saturo saturo (50 mL), H2O (50 mL), 10% KHSO4 (50 mL), H2O (50 mL) e salamoia (50 mL), asciugare su Na2SO4, filtrare e concentrare in vacuo.
    5. Purificare il prodotto grezzo per colonna cromatografia su gel di silice (3 cm di diametro colonna e 50 cm di altezza) utilizzando un gradiente di etere di petrolio / EtOAc (1:2) a EtOAc.
    6. Elucidate e verificate la struttura delle molecole (Figura 5A composta 8, composto 5B 9) di 1H NMR e 13C Spettri NMR in DMSO-d6 su una risonanza magnetica nucleare (NMR) Spettrometro. Verificare che la purezza di entrambi i composti sia superiore al 97% mediante la spettrometria linfografia-massa liquida (LC-MS), applicando un rilevamento di array didi diodi (DAD) a 220-500 nm.

2. Convalida funzionale delle molecole PROTAC

  1. Analisi western della degradazione di CRBN da parte dei PROTAC
    NOTA: Gli effetti dei composti8 (IN vioe composto9 (in viesul livello delle proteine CRBN sono stati testati dall'analisi delle macchie occidentali. Inoltre, l'impatto sui livelli di IK-F1 e IK-F3 potrebbe essere confermato (Figura 6).
    1. Preparazione del campione
      1. Sciogliere i composti 8 e 9, lenalidomide (Len), pomalidomide (Pom), MG132, e MLN-4924 in DMSO ad una concentrazione di 10 mM, e conservare a -80 gradi centigradi fino a un ulteriore utilizzo.
      2. Seme 1 x 106 cellule MM1S in una piastra a 6 pozze con supporto da 2,5 mL e trattare le cellule con 100 nM o 1 composto M 8 o 9 per 24 h.
      3. Raccogliere le cellule dopo il trattamento e centrifugare a 700 x g, 5 min, 4 gradi centigradi. Lavare il pellet cellulare con 1x PBS freddo per rimuovere i supporti rimanenti, centrifugare a 700 x g, 5 min, 4 gradi C, e scartare supernatante. Ripetere questo passaggio una volta.
      4. Cellule di lysise nel buffer di lisi (25 mM Tris HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% glicerolo, 1x Protease & Fosfono Inibitore Cocktail) per 10 min sul ghiaccio, centrifuga a 320 x g per 10 min, 4 C. Raccogliere supernatante e determinare la concentrazione di proteine da un saggio di proteine acido bicinchoninico (saggio BCA) secondo il protocollo del produttore.
      5. Proteine di denaturazione (15-30 g/campione) con tampone di carico 1x LDS (5% 2-mercaptoetanolo) e far bollire 10 min, 75 gradi centigradi.
    2. Pagina SDS-PAGE
      1. Fissare sandwich gel con un 10% gel di separazione [4 mL 3x gel buffer (3 M Tris/HCl, 0,3% (w/v) solfato di sodio al sodio di sodio (SDS), pH 8,45), 4 mL di acrilamma 30%, 2,52 mL di licerone 50%, 1,395 mL H2O, 75 - 11 % ammonial perlato (APS) e 9,75 TEMED l'EL [1,992 mL 3x gel buffer, 0,792 mL 30% acrilamide, 3,168 mL H2O, 36 L 11% APS e 6 TEMED] in un'unità di assemblaggio di elettrodi. Rimuovere pettini, lavare i pozzi con tampone catodo (100 mM Tris/HCl, 100 mM tricine, 0,1% (w/v) SDS) e caricare i campioni.
      2. Riempire il buffer anode (100 mM Tris/HCl, pH 8.9) nel serbatoio. Caricare il campione proteico dal passo 2.1.1.4 e eseguire SDS-PAGE a 70 V, 20 min, seguito da 115 V, 150 min a tensione costante.
    3. Immunoblotting e rilevamento di CRBN, IK-F1 e IK-F3
      1. Attivare la membrana PVDF (0,45 m) nel 100% di metanolo per 1 min. membrana e gel di separazione nel buffer di trasferimento 1x [10x buffer di trasferimento (192 mM glicina, 25 m Tris-base/HCl, 900 mL H2O), 20% metanolo, 0.1% SDS, pH 8.3].
      2. Assemblare cassetta gonfia secondo il protocollo del produttore. Gel di trasferimento a 180 mA per 90 min.
      3. La membrana di lavaggio 3 x in 1x TBS-T (25 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6, 0,1% Tween 20) per 5-10 min ciascuno a temperatura ambiente. Membrana a blocchi in 5% di latte essiccato non grasso (NFDM), TBS-T per 1 h a temperatura ambiente. Lavare la membrana 3 volte in 1X TBS-T per 5-10 min ciascuno a temperatura ambiente.
      4. Membrana di incubatura con anticorpo primario per CRBN (1:500 nel 5% BSA, TBS-T) con agitazione delicata a 4 gradi centigradi durante la notte.
      5. Lavare la membrana 3 volte in 1X TBS-T per 5-10 min ciascuno a temperatura ambiente. Membrana di incubazione con anti-topo (1:10.000 nel 5% NFDM, TBS-T) o anti-coniglio (1:5.000 nel 5% NFDM, TBS-T) anticorpo secondario accoppiato al rafano perossidase HRP (1 h a temperatura ambiente.)
      6. Lavare la membrana 2x in 1X TBS-T per 5-10 min ciascuno a temperatura ambiente. Ripetere questo passaggio due volte con 1x TBS.
      7. Membrana di incubazione per 2 min con soluzione di substrato HRP secondo i protocolli del produttore e rilevamento della chemiluminescenza in un dispositivo di rilevamento della chemiluminescenza.
      8. Lavare la membrana 1x in 1X TBS per 5-10 min ciascuno a temperatura ambiente. Per il rilascio di anticorpi, striscia membrana in buffer di stripping disponibile in commercio per 15 min.
      9. Riblocco della membrana in 5% di latte essiccato, TBS-T per 1 h a temperatura ambiente. Lavare la membrana 3 volte in 1 TBS-T per 5-10 min ciascuno a temperatura ambiente e risondare con IK-F1, IK-F3 o tubulina secondo il passo 2.1.3.4.
  2. Esperimenti di competizione con MG132, MLN4942 o pomalidomide
    NOTA: Per confermare se il CRBN è degradato attraverso il percorso onniquitina-proteasome, abbiamo effettuato esperimenti di competizione con l'inibitore proteasoso MG132 e un inibitore dell'enzima di attivazione della neddylation (NAE) MLN4942 (Figura7).
    1. Seme 1 x 106 celle MM1S per pozzo in una piastra di 6 pozzetti. Pretrattare le cellule con 10 m MG132, 10M MLN4942 o lenalidomide (100x) e incubare 1 h a 37 gradi centigradi, 5% DI CO2.
    2. Aggiungere 100 nM composto 8 per 3 h a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
    3. Raccogliere le cellule per la macchia occidentale secondo il passo 2.1.1.
  3. Saggi di sopravvivenza cellulare in più linee cellulari del mieloma
    NOTA: Questo test viene utilizzato per testare l'impatto sulla vitalità delle cellule e, inoltre, antagonizzare l'effetto di IMiD su più cellule di mieloma pretrattamento delle cellule con composto 8 (Figura 8, Figura 9A,B).
    1. Seme 5 x 104 MM1S cellule per pozzo in una piastra di 96 po in triplicati biologici per il saggio di fattibilità. Per l'analisi western blot, semi 1 x 106 cellule MM1S per bene in una piastra di 6 pozzetti in triplicati biologici.
    2. Trattare le cellule con DMSO o 100 nM, 1 M, o 10 M composto 8, composto 9 o pomalidomide e incubare per 24 h, 48 h, o 96 h a 37 c, 5% CO2. Per gli esperimenti di salvataggio, trattare le cellule con 100 nM composto 8 per 3 h, prima o dopo l'aggiunta di 1 M pomalidomide e incubare per 96 h.
    3. Misurare la luminescenza della piastra di 96 pozze con un saggio di vitalità delle cellule luminescenti, secondo il protocollo del produttore su un lettore di piastre o raccogliere cellule dalla piastra 6-po' per l'analisi delle macchie occidentali.

Risultati

Qui abbiamo descritto la progettazione, la sintesi e la valutazione biologica di un PROTAC omodimerico basato su pomalidomide per la degradazione del CRBN. Il nostro PROTAC interagisce contemporaneamente con due molecole CRBN e forma complessi ternari che inducono l'auto-ubiquitinazione e la degradazione proteasomica del CRBN con solo effetti rimanenti minimi su neo-substrati indotti dalla pomalimofe IK-F1 o IK-F3.

Da una serie ...

Discussione

La progettazione di tali omo-PROTAC come descritto qui per CRBN si basa sulla specifica affinità della pomalimofilia con CRBN, che è stata utilizzata con successo in numerosi PROTAC eterobifunzionali e ha portato allo sviluppo di PROTAC 8 come degrado CRBN selettivo. La specificità della nostra molecola è già stata confermata dalle analisi proteomiche24. Per knockout geneticamente mediato, l'esclusione e la convalida degli effetti collaterali è impegnativo e richiede tempo. ...

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano un potenziale conflitto di interessi finanziario.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (Programma Emmy-Noether Kr-3886/2-1 e SFB-1074 a J.K.; DA FOR2372 a M.G.)

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1,1'-CarbonyldiimidazoleTCI chemicalsC0119
2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine)Sigma-Aldrich385506Compound 6
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3-Fluorophthalic anhydride, 98 %Alfa AesarA12275
4-Dimethylaminopyridine, 99 %Acros148270250Toxic
Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)Carl Roth3029.1
Aiolos (D1C1E) mABCell signaling15103S
Anti-CRBN antibody produced in rabbitSigmaHPA045910
Anti-rabbit IgG HRP-linked antibodySigma7074S
Ammonium PersulfateRoth9592.2
Boc-Gln-OHTCI chemicalsB1649
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7906-100G
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability AssayPromegaG7571
ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
DMF, anhydrous, 99.8 %Acros348435000Extra Dry over Molecular Sieve
DMSO, anhydrous, 99.7 %Acros348445000Extra Dry over Molecular Sieve
GlycineSigma-Aldrich15523-1L-R
Goat anti-mouse (HRP conjugated)Santa Cruz biotechnologysc-2005
Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X)Thermo Scientific1861280
Ikaros (D6N9Y) MabCell signaling14859S
ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm)MerckIPVH000010
Iodomethane, 99 %Sigma-AldrichI8507Highly toxic
MethanolSigma-Aldrich32213-2.5L
Mg132SelleckchemS2619
Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cellBio-Rad1703930
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellBio-Rad1658004
MLN4942biomol (cayman)Cay15217-1
Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512)SigmaT5168
N-Ethyldiisopropylamine, 99 %Alfa AesarA11801
Nonfat dried milk powderPanReac AppliChemA0830,0500
Nunc F96 MicroWell White Polystyrene PlateThermo Scientific136101
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)Thermo ScientificNP0008
Pierce BCA Protein Assay kitThermo Scientific23225
PomalidomideSelleckchemS1567
RestoreTM Western Blot Stripping BufferThermo Scientific46430
sodium dodecyl sulfateCarl Roth183.1
Sodium ChlorideSigma-AldrichA9539-500g
TEMEDCarl Roth2367.3
tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamateSigma-Aldrich89761Compound 5
TricinCarl Roth6977.4
Trizma baseSigma-AldrichT1503-1kg
Tween-20Sigma-AldrichP7949-500ml
WesternBright ECL sprayAdvanstaK-12049-D50

Riferimenti

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  3. Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
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