Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هذا هو بروتوكول لاعداد الانسجه الأمثل لالجينوم ، الناسخ ، وتحليلات بروتينيه من الخفافيش اشتعلت في البرية. وهو يتضمن بروتوكولات للتقاط الخفافيش والتشريح ، والحفاظ علي الانسجه ، والذبح الخلية من انسجه الخفافيش.

Abstract

ومع تقدم تكنولوجيات التسلسل العالية الانتاجيه ، فان الطرق الموحدة لاكتساب الانسجه عاليه الجودة والحفاظ عليها تسمح بتمديد هذه الأساليب إلى الكائنات غير النموذجية. وقد وضعت سلسله من البروتوكولات لتحسين جمع الانسجه من الخفافيش لسلسله من النهج تسلسل الانتاجيه العالية. وترد هنا بروتوكولات للقبض علي الخفافيش ، والديموغرافيات المطلوبة لجمعها لكل الخفافيش ، والأساليب الأمثل للحد من الإجهاد علي الخفافيش اثناء جمع الانسجه. وحددت بالتحديد طرق لجمع ومعالجه الانسجه للحصول علي (ط) الحمض النووي للتحليلات الجينية عاليه الوزن الجزيئي, ' 2 ' RNA لناسخات الانسجه الخاصة, و ' 3 ' البروتينات للتحليلات المستوي البروتيني. وأخيرا ، فان الخطوط العريضة أيضا هي طريقه لتجنب أخذ عينات مميته عن طريق خلق ثقافات خلايا أوليه قابله للاستمرار من مقاطع الجناح. والدافع الرئيسي لهذه الطرق هو تعظيم كميه البيانات الجزيئية والمورفولوجية المحتملة لكل مضرب واقتراح الطرق المثلي للحفاظ علي الانسجه بحيث تحتفظ بقيمتها مع تطور الأساليب الجديدة في المستقبل. وقد أصبح هذا التوحيد مهما بشكل خاص كمبادرات لتسلسل مستوي الكروموسوم ، والجينوم خاليه من الأخطاء من الأنواع في جميع انحاء العالم قد برزت ، والتي العديد من الأحزاب العلمية تتصدر تسلسل التصنيفية المختلفة مجموعات. البروتوكولات المبينة هنا تحدد جمع الانسجه المثالية وأساليب الحفاظ علي الانسجه ل Bat1K ، الاتحاد الذي هو تسلسل الجينوم من كل نوع من أنواع الخفافيش.

Introduction

وقد أحرزت أساليب التسلسل العالية الانتاجيه تقدما سريعا في الكفاءة وانخفضت في التكلفة ، وأصبح من الممكن الآن توسيع نطاق هذه النهج لتضم مئات أو آلاف العينات. والرؤى التي يحصل عليها تطبيق هذه التكنولوجيات لها تاثيرات هائله علي التخصصات العلمية المتعددة ، من الطب الإحيائي إلى التطور والإيكولوجيا1و2و3. ومع ذلك ، تعتمد العديد من تطبيقات "الشام" بشكل حاسم علي الأحماض النووية عاليه الجودة من مصدر حي. هذا القيد من المحتمل ان تصبح إشكاليه بشكل متزايد مع تطوير تسلسل الجيل الثالث استنادا إلى جزيئات قراءه طويلة4. ولهذه الأسباب ، هناك حاجه إلى تركيز الجهود علي وضع أفضل الممارسات لجمع عينات الانسجه الطازجة من الكائنات البرية خارج المختبر ، مما يزيد من فائده المواد ويقلل من عدد الافراد الذين يحتاجون إلى جمع.

Bat1K هو اتحاد دولي من العلماء مع مبادرة مستمرة لتسلسل الجينوم من كل نوع من أنواع الخفافيش إلى الجمعية علي مستوي كروموسوم5. تمثل الخفافيش 20% من تنوع الثدييات ولها تعديلات استثنائيه لها اثار علي فهم الشيخوخة والامراض البيئية والبيولوجيا الحسية والأيض5،6. كما ان العديد من الخفافيش مهدده أو معرضه للخطر بسبب الاستغلال البشري7 أو انها تنخفض بسرعة بسبب مسببات الامراض8،9، والتسلسل علي مستوي الجينوم ذات اهميه كبيره للحفاظ علي هذه الأنواع. علي الرغم من ان Bat1K يهدف حاليا إلى تسلسل الجينوم من جميع أنواع الخفافيش ، وتوحيد جمع عينات الانسجه للتسلسل الجيني عاليه الجودة لا تزال تشكل تحديا رئيسيا في جميع انحاء مجتمع علماء الاحياء الأسطح. الاضافه إلى البيانات الجينية ، يتطلب الفهم الوظيفي لتنوع التعديلات التي تجري علي الخفافيش النسخ الورقية الخاصة بالانسجه وتحليل البروتين ، وغالبا ما يتطلب بروتوكولات جمع منفصلة. وعلاوة علي ذلك ، وكما هو الشان بالنسبة لجميع المجموعات التصنيفية ، وفي حين ان جمع الانسجه وحفظها علي النحو الأمثل أمر ضروري للحصول علي اعلي جوده لتحليل البيانات ، فان الإبلاغ عن أفضل الممارسات غالبا ما يكون صعبا بسبب التكنولوجيات السريعة التغير فرق بحثيه متعددة تعمل بشكل مستقل.

ومن الملح بصفه خاصه الحاجة إلى اعتماد أفضل الممارسات للبحوث المتعلقة بالخفافيش ، نظرا لان العديد من أنواع الخفافيش نادره أو مهدده. وخلافا لغيرها من الثدييات الصغيرة مثل القوارض والفئران ، والخفافيش طويلة الأمد ، والتي تعزي إلى أليات إصلاح الحمض النووي استثنائيه10 وبطء الاستنساخ11، مع معظم الأنواع تلد واحده فقط أو (في حالات قليله) اثنين من الشباب في السنه. لهذه الأسباب ، يمكن ان يكون السكان الخفافيش بطيئه للتعافي من الاضطرابات ، وجمع العديد من الافراد من البرية ليس من المستحسن ولا ممكن. وبعبارة أخرى ، يجب تحسين البروتوكولات للحصول علي اقصي قدر من البيانات لعينه واحده ، مما يقلل من الحاجة إلى تكرار جهود أخذ العينات دون داع.

هنا ، يركز هذا البروتوكول تحديدا علي الطرق الموحدة لجمع وأخذ عينات من انسجه الخفافيش لتحليل التسلسل الجيني والناسخ والبروتين. وتتمثل أولويته القصوى في ضمان جمع انسجه الخفافيش بطريقه اخلاقيه ومسؤوله ، بدءا من عمليه السماح بالجمع ، وتصدير الانسجه إلى تقليل الإجهاد إلى الحد الأدنى للحيوان ، وظروف التخزين طويلة الأجل. وقد وضعت الأجزاء المفصلة بهدف التدقيق في المستقبل لفائدة المواد المختلفة التي تم جمعها. تقدم هذه المخطوطة دليلا تدريجيا لجمع الخفافيش بطريقه انسانيه تهدف إلى تقليل التاثير علي السكان وتعظيم القيمة العلمية. في حين ان تركيز هذا البروتوكول هو علي وجه التحديد لاستخدامها في الخفافيش ، والعديد من الخطوات ذات الصلة لفقاري taxa الأخرى ، وخاصه الثدييات.

نظره عامه علي جمع الانسجه
سيتم تحديد إجراءات جمع الانسجه ، بما في ذلك درجه الحرارة للتخزين واختيار وكيل الحفاظ ، من خلال طبيعة اي تحليلات المصب المخطط لها. ومع ذلك ، يوصي بشده بأنه ، عند الإمكان ، يتم جمع الانسجه تحت مجموعه من الطرق لتعظيم فائدتها في المستقبل حتى لو لم يتم التخطيط لتحليل محدد. بشكل عام ، يتم جمع الانسجه والحفاظ عليها للتحليلات اللاحقة اما الأحماض النووية (DNA والحمض النووي الريبي) ، أو البروتين. بالنسبة لكل من هذه التطبيقات ، يمكن الحفاظ علي الانسجه بشكل مثالي من خلال التجميد المباشر في النيتروجين السائل (LN2). ومع ذلك ، الغمر الفوري في LN2 ليس من الممكن دائما في الميدان. ومع تقدم التكنولوجيا ، أصبحت الموارد مثل القوارير المتخصصة لتخزين الحمض النووي والحامض الريبي النيبالي في درجات الحرارة المحيطة متاحه بسهوله أكبر. في حين اننا لم التحقق من صحة جميع هذه المواد في هذا البروتوكول ، ونحن نشجع الباحثين الآخرين لتحليل نسبيا أداء المواد الجديدة بالنسبة لما نقدمه هنا. نحن نقدم أساليب للحفاظ علي الانسجه المثالية للتطبيقات المختلفة في الحالات التي لا يمكن الوصول إلى LN2 ، علي سبيل المثال ، عندما LN2 النقل غير ممكن بسبب الوصول إلى الموقع عبر طائره صغيره في الأمازون. الاضافه إلى ذلك ، ونحن نقدم طريقه لجمع الانسجه التي يمكن ان تزرع الخلايا الحية ونشرها. وفيما يلي موجز للاعتبارات الرئيسية لجمع المواد لكل هدف من هذه الأغراض ، ويرد في الجدول 1لمحه عامه عن أساليب الجمع.

الانسجه للحمض النووي
بالنسبة لجميع الانسجه المقطوعة التي يتم جمعها ، ستحدد وسائط التخزين ما إذا كان يمكن استخدامها اما لاستخراج الحمض النووي القياسي أو العالي الوزن الجزيئي (HMW). مطلوب HMW لتسلسل القراءة الطويلة والمطلوبة حاليا لتوليد الجمعيات الجينوم مستوي الكروموسوم ، أو الجينوم "معيار البلاتين". ). الحمض النووي المعزول بواسطة الطرق المختبرية القياسية (علي سبيل المثال ، الاعمده الدوارة لغشاء هلام السيليكا ، الفينول-كلوروفورم) ، قد لا تزال تنتج شظايا الحمض النووي تصل إلى ~ 20 كيلوبت في الدقيقة (kb). ولذلك ، شريطه ان يكون هناك ما يكفي من الغلة ، يمكن استخدام هذا النموذج من الحمض النووي معزولة لاعداد مكتبه حجم ادراج واحده ، والتي في حجم ادراج في كثير من الأحيان ~ 500 قاعده أزواج (bp) ، ويقرا تسلسل قصير من ~ 100 bp يتم إنشاؤها12. هذا الحمض النووي مفيد بشكل خاص لمشاريع "أعاده التوازن" أو الدراسات التي لا تتطلب بيانات الكروموسومات كامله الطول. الحمض النووي HMW (10-150 kb) هو أكثر تحديا ويمكن الحصول عليها بشكل موثوق به فقط باستخدام الانسجه التي تم المجمدة بسرعة في LN2 الحصاد التالية والحفاظ علي الحد الأقصى من-80 درجه مئوية حتى الاستخراج.

وكثيرا ما يكون الوزن الجزيئي المنخفض أو الحمض النووي المجزا كافيا للنهج المستهدفة ، بما في ذلك تضخيم الجينات عن طريق PCR والتسلسل القصير القراءة13. التحقيقات المستندة إلى PCR باستخدام الحمض النووي lmw التي تستهدف سوي واحد أو عدد قليل من الجينات كانت مفيده للغاية في فهم التكيف والتطور الجزيئي لعلم الاحياء الحسية الخفافيش6,14, فسيولوجيا15, الفيلوجيني 5,16, وحفظ17,18. كما تم التدليل علي التسلسل المستهدف الناجح لاستعاده الوزن الجزيئي المنخفض والحمض النووي المجزا للعديد من المجموعات الفقارية ، بما في ذلك الخفافيش19. هذه الطرق غالبا ما تكون فعاله من حيث التكلفة وطفيفه التوغل في الخفافيش ، كما عينات البراز وعينات الانسجه غير الفتاكة عن طريق مسحات شدق أواللكمات خزعة الجناح هي أيضا طرق شائعه للحصول علي الحمض النووي لتحليل الوزن الجزيئيمنخفضه 20 ، 21-الآن

ومع ذلك ، تعتمد الجودة بشكل كبير علي نوع الوسائط التي تخزن فيها العينة22. بعد المقارنات المنهجية والكمية من مسحات البوق واللكمات خزعة ، وقد ثبت اللكمات خزعة الجناح لتسفر عن مستويات اعلي باستمرار من الحمض النووي وكانت اقل إرهاقا علي الخفافيش خلال جمع22. وأظهرت هذه المقارنات أيضا انه تم الحصول علي أفضل النتائج عندما تم الحفاظ علي لكمه الجناح في السيليكا المؤشر (اي نوع من المجففة مصنوعة من الخرز هلام السيليكا ان يتغير لون عندما لوحظ الرطوبة) بدلا من وسائل التخزين الشعبية الأخرى مثل الايثانول أو DMSO22؛ علي الرغم من انه لم يتم فحص وسائل التخزين الأخرى بما في ذلك حل تثبيت الانسجه. ويمكن أيضا ان تستخدم اللكمات الجناح لزراعه الخلايا الليفية في الثقافة ، مثل في كاتبرسك وآخرون23 وعلي النحو المبين أدناه (انظر القسم 6). النسبة لهذه الطرق ، ينبغي تمديد الجناح أو اوروباتيوم برفق ، وينبغي استخدام الخزعة النظيفة ، التي يبلغ قطرها عاده 3 مم ، للحصول علي العينة. ويبدو ان هذا النهج لا يسبب ضررا دائما ، مع التئام الندوب خلال أسابيع في معظم الحالات24.

الحمض النووي HMW (10-150 kb) هو أكثر تحديا ويتم الحصول عليها حاليا بشكل موثوق به فقط باستخدام الانسجه التي تم تجميدها بسرعة المجمدة في LN2 بعد الحصاد والحفاظ علي الحد الأقصى من-80 درجه مئوية حتى الاستخراج. [همو] [دنا] (10-150 [كب]) حاسمه لطويلة يقرا [دنا] تسلسل ولذلك ل [د] [نوفو] جينوم تجميع. في الواقع ، في حين يمكن استخدام معظم مجموعات التجارية لعزل بعض الحمض النووي HMW القياسية ، واحجام الجزيئات الناتجة في كثير من الأحيان لا تفي بمتطلبات تقنيات التسلسل الجيل الثالث [علي سبيل المثال ، تلك التي أطلقتها شركات مثل باسيفيك العلوم البيولوجية (PacBio) ، أكسفورد نانو تكنولوجيز ، والجينوم 10x ، أو من خلال أساليب التجميع التي تقدمها بيومانو الجينوم أو الجينوم تتوافق]. علي هذا النحو ، هناك طلب جديد علي الحمض النووي "الترا HMW" (> 150 kb). عند الحصول علي الحمض النووي HMW الترا من الخفافيش ، عينات جديده من الكبد والدماغ ، أو العضلات كلها مناسبه ، ولكن يجب ان تكون هذه فلاش علي الفور المجمدة في LN2 دون اي مخزن مؤقت أو تبريد. والوصف الكامل لهذه الخطوات يتجاوز نطاق هذه الورقة ولكنه متاح في موضع آخر من25.

نسيج ل [رنا]
RNA هو جزيء واحد تقطعت به السبل التي هي اقل استقرارا من الحمض النووي. علي الرغم من ان هناك العديد من اشكال الحمض الريبي النيبالي ،-تحليلات omics تميل إلى التركيز علي mRNA (رسول الجيش النيبالي الريبي) والصغيرة RNAs (علي سبيل المثال ، ميكرورناس). بعد النسخ ، يتم تقسيم mRNA لتشكيل نص الناضجة التي لا تحتوي علي الداخل ويمثل الجزء الترميز من الجينات/الجينوم. تمثل الجينات الترميز جزءا صغيرا من حجم الجينوم (1 ٪-2 ٪) ، مما يجعل استهداف mRNA وسيله فعاله من حيث التكلفة للحصول علي بيانات التسلسل للجينات. ميكرورناس هي فئة من RNAs التي تنظم عمليه ترجمه mRNA إلى البروتينات التالي المستجيبين التنظيمية الهامه. الحمض الريبي المستنسخ النسخ يمكن ان تكون متسلسلة بشكل فردي ، أو أكثر شيوعا لتحليلات الomics26،27،28،29،30، كجزء من ناسخه ؛ وهذا هو ، مجموع جميع النسخ الخاصة بالحمض الريبي النيبالي موجودة في عينه معينه.

يمكن اجراء التسلسل بعد عده طرق (اي ، عن طريق القراءة القصيرة الحمض الريبي-المتسلسل أو القراءة الطويلة الكاملة المتسلسلة) ، مما يسمح بتحليل وفره الحمض الريبي النيبالي واستخدام الايزوفورم. كما تختلف كميه وتنوع النصوص mRNA بين الخلايا والانسجه ، وتسلسل RNA يجعل من الممكن لدراسة ومقارنه التعبير الجيني والتنظيم عبر العينات. الاهتمام في تسلسل RNAs الصغيرة والتسلسل ايزوفورم كامل ينمو ، لان هذه الأساليب أصبحت أكثر بشكل متزايد من المعلومات بيولوجيا. اعداد عينات الانسجه لتسلسل فئات مختلفه من الجيش النيبالي الريبي يمكن ان يؤديها بنفس الطريقة كما هو مبين في هذه المخطوطة ، مع فقط طرق الاستخراج اللاحقة المختلفة31،32. وأخيرا ، نظرا لان النصوص المكتوبة تقدم مجموعه فرعيه عاليه التغطية من الجينوم الذي يرمز إلى البروتين ، فان مجموعه البيانات المجمعة قد تكون مفيده في تجميع الجينوم والتعليق التوضيحي ، مما يجعل من جمع معطيات الحمض الريبي النيبالي المتسلسل عبر مجموعه من الانسجه المختلفة عنصرا هاما في مبادرة Bat1K.

علي النقيض من الحمض النووي ، RNA غير مستقر كيميائيا والتي تستهدفها أيضا انزيمات rnase ، والتي هي موجودة بشكل مطلق في لست] الانسجه كاستراتيجية دفاعيه ضد الفيروسات المستندة إلى RNA. لهذه الأسباب ، يبدا الكسر RNA في الخلايا والانسجه تتحلل بعد فتره وجيزة من نقطه أخذ العينات و/أو القتل الرحيم. ولذلك يتطلب الحفاظ علي الحمض الريبي النيبالي اتخاذ خطوات لمنع تدهوره. وهذا يشمل عاده الحفاظ علي الانسجه التي تم جمعها حديثا في 4 درجه مئوية في عامل استقرار مثل الحمض الريبي النيبالي استقرار الحل للغاء تنشيط RNases الموجودة بشكل طبيعي في الانسجه ، تليها تجميد لتخزين طويل الأجل. كبديل مفضل ، يمكن ان تكون الانسجه المجمدة فلاش في LN2 ؛ علي الرغم من انه كما ذكر أعلاه ، نقل LN2 إلى الميدان والحفاظ علي مستويات لمنع ذوبان الانسجه يمكن ان تكون صعبه لوجستيا.

نسيج للبروتين
يختلف تركيب البروتين ووفرته النسبية بين الخلايا والانسجه بطريقه مماثله لما تمت مناقشته للجيش النيبالي الريبي ؛ ومع ذلك, البروتينات في المتوسط أكثر استقرارا من RNA. وعاده ما يطابق تعريف البروتين باستخدام البروموميات جزءا من تسلسل البروتين ، وليس كاملا ، ولكنه يمكن ان يزود المعلومات عن التعبير عبر الانسجه ويميز مسببات الامراض الموجودة. كما يتم حفظ العديد من متواليات البروتين عبر الثدييات ، يمكن بسهوله ان تكون عينات الخفافيش للبروتينات ملوثه بالبروتينات البشرية المحفوظة ، والتي تتطلب بروتوكولات معقمه (مثل القفازات والملقط) اثناء الجمع. في حين تجميد فلاش في LN2 هو أفضل وسيله لمنع تدهور البروتينات ، واستخدام الجليد الجاف ،-20 درجه مئوية المجمدات ، وحتى الجليد هي مناسبه إذا لم تكن هناك وسيله أخرى. ومع زيادة درجات الحرارة ، يرتفع أيضا خطر انهيار البروتين التفاضلي. عوامل الاستقرار مثل حل تثبيت الانسجه فعاله في الحفاظ علي جزء البروتين من الانسجه في درجه حرارة الغرفة وهي مناسبه للحفاظ علي المدى القصير (تصل إلى أسبوع واحد) عندما تجميد فلاش ليست قابله للحياة.

الشخصية الانزيميه للانسجه معينه تؤثر مباشره علي الحفاظ علي البروتين فيها. الانسجه مع النشاط الانزيمي منخفضه مثل العضلات يمكن الحفاظ علي ملامح البروتين حتى في درجات الحرارة العالية في الفريزر المنزلية. علي النقيض من ذلك ، نسيج الكبد هو انزيمي رد الفعل ، والبروتينات لديها احتمالات اعلي من المهينة اثناء التحضير. ويشير العدد المتزايد من البروتوكولات للحصول علي لمحات بروتينيه البشرية من formalin-ثابته البارافين-جزءا لا يتجزا من العينات (FFPE) ان تحديد بارافورمالدهيد من الانسجه يحمل وعدا للحفاظ علي البروتين منخفضه التكلفة عند تجميد علي جمع ليست قابلللتنفيذ 33,34. علي الرغم من ان تعتمد إلى حد كبير علي الحفاظ علي الوقت والشرط ، وقد تم تحديد البروتينات عن طريق مناعي من formalin-الثابتة ، الايثانول الحفاظ علي عينات الخفافيش35. هذا النهج لا يمكن تحجيمها لأخذ العينات علي المستوي البروتيني ولكن يسلط الضوء علي امكانيه الانسجه الخفافيش formalin الثابتة لإنتاج لمحات البروتين عندما تجميد فلاش غير متوفر وغيرها من عوامل استقرار مكلفه للغاية.

نسيج لثقافة الخلية
الانسجه أخذ العينات وتجميد فلاش يقدم كميه محدوده من المواد التي يمكن استخدامها ، وبمجرد استخدام المواد ، فانه لم يعد متاحا. وبدلا من ذلك ، توفر ثقافات الخلايا الخلايا الحية التي يمكن استخدامها علي الفور أو الاحتفاظ بها للدراسات المستقبلية. وتسهل الثقافات أيضا توسيع الخلايا لزيادة الغلة عندما تكون عينات الانسجه صغيره. وهو مفيد بشكل خاص في الحالات التي يكون فيها جمع الانسجه محدودا ، مثل التجارب علي الأنواع النادرة التي تعتبر أخذ العينات غير الفتاكة أمرا أساسيا ، التالي فان لها اثارا واسعه علي الحفظ. يوصف هو البروتوكول الذي ثقافة الخلية هو ممكن عن طريق أخذ عينات غير مميته من الانسجه الغشاء الجناح ، ولكن من الممكن الخياطة مع أنواع متعددة من الانسجه36،37. البروتوكول المقدم هنا يختار للخلايا الملتصقة. مزيج من الانسجه المصدر ووسائل الاعلام النمو المستخدمة يجعل هذا البروتوكول مناسبه لتحديد وزراعه الخلايا الليفية ، ولكن إذا رغبت ، يمكن استخدام بروتوكولات بديله لتحديد أنواع الخلايا الأخرى. وفي سياق مشروع Bat1K ، من المتوقع انه بالنسبة للأنواع النادرة والمهددة ، فان أخذ عينات غير فتاكة من اغشيه الاجنحه وتوسيع العينات عن طريق الزراعة أمر ضروري لتوليد حجم الحمض النووي اللازم للتكنولوجيات المتعددة المستخدمة5 .

التقاط الخفافيش
وينبغي تدريب جميع الأشخاص الذين يتعاملون مع الخفافيش بواسطة باحث مختص بالخفافيش وتطعيمهم ضد داء البشر باستخدام سلسله من الحقن السابقة للتعرض. في حاله العض ، لا تزال هناك حاجه إلى سلسله أخرى من حقن ما بعد التعرض. وتشمل الطرق القياسية للتقاط الخفافيش شبكات الضباب (الشكل 1) وفخاخ القيثارة (الشكل 2). وتستخدم شبكات الضباب الأكثر شيوعا ومثاليه للمناطق ذات النشاط المنخفض إلى المعتدل ، لأنها تتطلب الرعاية القصوى للتقليل من شده الخفافيش. الخفافيش الصغيرة هي ضعيفه بشكل خاص ويمكن ان يموت من الإجهاد إذا لم يكن يميل إلى بسرعة. وتقلل عمليات التفتيش الشبكية المتكررة من إصابات الخفافيش والوفاات فضلا عن الاضرار التي تلحق بشبكه الضباب. هذه التفاصيل مهمة لان جمع الانسجه السليم يتطلب الانسجه لتكون طازجه ، والاهتمام غير لائق لشباك الضباب في الخفافيش يمكن ان يؤدي إلى وفيات لا لزوم لها أو الوفاات المبكرة قبل الباحث يمكن معالجه العينات بشكل صحيح. لان العديد من الخفافيش يمكن ان يستريح في فخ القيثارة مع الحد الأدنى من الضائقة ، وهذا النهج هو المثالي للمناطق مع النشاط الخفافيش عاليه ، مثل بالقرب من كهف أو roost كبيره. تتوفر تعليمات مفصله للتقاط الخفافيش المناسبة ومعالجه البيانات لجمع المعلومات المورفولوجية والديموغرافية في الأساليب التكميلية.

Protocol

تمت الموافقة علي جميع الطرق الموصوفة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانية (IACUC) من جامعه ستوني برؤاك (البروتوكول #2013-2034).

1-القتل الرحيم

  1. بلل كره من القطن مع مخدر ايزوفلواني أو مخدر آخر متاح.
  2. ضع كره القطن في كيس من البلاستيك محكم الغلق. يجب ان تكون الحقيبة كبيره بما يكفي لعقد كيس في كيس من القماش الخفافيش بشكل مريح.
  3. بعد عده دقائق من السماح للكيس تتخلل مع مخدر ، وضع كيس الخفافيش التي تحتوي علي الخفافيش في كيس من البلاستيك.
  4. انتظر عده دقائق حتى رحيم الخفافيش. الخفافيش ~ 20 غرام أو اقل في الوزن تتطلب ما يقرب من 5-10 دقيقه. الخفافيش أكبر من هذا قد تتطلب ما يصل إلى 20 دقيقه. لاحظ ان طول الوقت قد يعتمد أيضا علي نفاذيه كيس الخفافيش. فمن المستحسن استخدام أنحف مواد القماش الممكنة لتعظيم انتشار التخدير.
  5. تحقق من التنفس ونبضات القلب لضمان رحيم الخفافيش قبل ان يبدا التشريح.

2. اعداد تشريح

  1. الاحتفاظ بكافة الاجهزه نظيفه بين الأجزاء ، باستخدام البروتوكول التالي.
  2. غسل الاداات مع الماء والصابون صحن. امسحها بالمبيض بنسبه 10% ، بعيدا عن منطقه التشريح ، حيث ان المبيض سيكسر الأحماض النووية.
  3. مسح إلى أسفل مع 70 ٪ الايثانول.
  4. امسح بكاشف أزاله التلوث RNAse.
  5. كرر هذا القسم بعد كل تشريح.

3. اعداد قوارير لعينات الانسجه

  1. للجيش النيبالي الريبي:
    1. اعداد جميع قوارير قبل البدء في اي الأقسام لتجنب التاخير.
    2. نضع جانبا عدد القنينات اللازمة لكل عينه. تسميه كل أنبوب مع نوع الانسجه التي سيتم جمعها ، فضلا عن معلومات تعريف عينه القياسية. ملء قارورة 50 ٪ كامله من حل استقرار الجيش النيبالي الريبي ، والبرد بشكل مثالي إلى 4 درجه مئوية.
    3. الحرص علي عدم ملء قارورة تماما مع الحمض الريبي النيبالي استقرار الحل ، والا فان الأنبوب قد تنفجر عند وضعه في LN2. عند أخذ عينات الانسجه ، تذكر ان كتل كبيره من الانسجه لن تكون تخللت تماما من قبل الحمض الريبي النيبالي استقرار الحل. لذلك ، قطع النسيج إلى قطع أصغر من لا يزيد عن 0.5 سم في بعد واحد ، والحفاظ علي نسبه لا تقل عن 10:1 حجم للحل الحمض الريبي النيبالي الاستقرار: الانسجه.
    4. في الحد الأدنى, تشريح الانسجه تحتاج إلى وضعها في حل استقرار RNA, حتى لو كان الوصول إلى LN2 أو المخازن الباردة في غير متوفرة.
  2. للحمض النووي:
    ملاحظه:     محتوي الحمض النووي DNA هو نفسه بالنسبة لجميع الانسجه تقريبا. لذلك ، يمكن ان تكون أخذ العينات مرنه. ومع ذلك, تجدر الاشاره إلى ان كثافة اعلي من الميتوكوندريا في انسجه العضلات قد يؤدي إلى فقدان القراءة للجيجين النووي38.
    1. للحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي ، واتخاذ واحد أو أكثر من النسخ المتماثلة من غشاء الجناح للتخزين في السيليكا ، و/أو العضلات للتخزين في محلول الاستقرار RNA أو حل استقرار الانسجه.
    2. للحصول علي الترا HMW DNA ، فلاش تجميد في LN2 دون اي كاشف التخزين ، ثم نقل إلى التخزين علي المدى الطويل في-80 درجه مئوية أو أكثر بروده. من تشريح الجمجمة ، وانسجه المخ هو نوع الانسجه الأكثر ملاءمة لاسترداد الترا HMW الحمض النووي39، في حين ان من التشوات بعد الجمجمة ، والكبد أو العضلات هي أكثر ملاءمة40.
    3. لتشريح الجمجمة ، استخدم قوارير 5 مل (علي عكس قارورة 2 مل القياسية) من محلول الحمض الريبي النيبالي لتحقيق الاستقرار لبعض الانسجه. يجب ان تكون جميع القنينات مبرده. الحفاظ علي قوارير علي الجليد في حين تشريح.

4. الجمجمة الانفصال عن الجيش النيبالي الريبي

  1. مباشره بعد القتل الرحيم ، قطع راس العينة مع زوج كبير من مقص أو تقطيع العظام (الشكل 3).
  2. أزاله العينين مع ملقط باستخدام قوه كافيه قويه لفصل العصب البصري. وضع العينين في قارورة 2 مل من الحمض الريبي النيبالي استقرار الحل.
  3. باستخدام الاداه المفضلة لديك ، جلد الجمجمة من الشعر ، اللفافة ، وعضلات الجمجمة ، بما في ذلك الجلد علي الأنف. يجب الحرص علي عدم كسر الطرف الامامي من الأنف.
  4. باستخدام مقص ، وجعل السهمي قطع علي الجزء البطني (الشكل 3) من الجمجمة بدءا من الرقبة ، مع الحرص علي عدم الاضرار الدماغ.
  5. باستخدام ملقط ، وسحب بلطف الظهر كلا الجانبين من الجمجمة حتى انها قد تصدع مفتوحة ويتعرض الدماغ.
  6. علي نهاية الذيليه من الجمجمة ، يجب ان تكون الآن القوقعة مرئية أفقيا علي كل جانب من الراس. فهي صغيره ، والعظام كرويه علي الجانب الأيمن والأيسر ، فقط منقاري إلى الرقبة والخلفية للعضلات مستر. باستخدام ملقط ، وسحب بلطف القوقعة ووضعها في قارورة واحده 2 مل من الحمض الريبي النيبالي استقرار الحل.
  7. كشط برفق الدماغ (والتي سوف تكون لينه جدا) مع ملقط. ستصبح لمبة حاسة الشم مرئية ، ويجلس في الجزء البطني من المناطق الداخلية من الجمجمة. في محاولة للحفاظ علي لمبة حاسة الشم المرفقة.
  8. إذا لم يتم بالفعل أزاله لمبة حاسة الشم ، كشط بلطف بعيدا الانسجه ، وسوف تصبح لوحه تجعيد الشكل واضحة. هذا هو العظم الحرج للحفاظ علي التوجه الباحث. ويمكن التعرف عليها بأنها المنطقة الاماميه الأكثر من الجمجمة مع العديد من الفوران والنقطة التي فيها اثنين من الأخاديد حيث تقع لمبة حاسة الشم.
  9. إذا كان ذلك ممكنا ، والحفاظ علي شكل الدماغ سليمه ووضع علي الفور علي الجليد الجاف للحفاظ علي الشكل أو في قارورة 5 مل من الحمض الريبي النيبالي استقرار الحل. إذا مناعي هو ان يتم علي الدماغ ، ومكان في 4 ٪ بارافورمالدهيد ، إذا كان متوفرا.
  10. جعل اثنين من الشقوق حيث الفك العلوي والسفلي الانضمام ، وأزاله الفك.
  11. وبمجرد أزاله الفك السفلي ، قم بازاله المنصة (الفك العلوي) من الجزء المتبقي من الجمجمة. تاكد من ان الفك يتضمن لوحه تجعيد الشكل.
  12. وضع الأنف في حل استقرار الجيش النيبالي الريبي وتخزين في 4 °C بين عشيه وضحيها. لان هذا هو نسيج كثيف ، فانه يتطلب الوقت للسماح الحمض الريبي النيبالي استقرار الحل لتتخلل الانسجه بأكملها.
  13. وضع قارورة الأنف في LN2 بعد نقع بين عشيه وضحيها في حل استقرار RNA.
  14. من أسفل الفك السفلي ، وقطع اللسان مع مقص ووضع في قارورة 2 مل من الحمض الريبي النيبالي لوقت لاحق.
  15. هذا البروتوكول يفقد معظم الجمجمة ويمكن استعاده الأسنان ، وخاصه تلك التي من الفك السفلي ، وقد تكون مفيده لتشخيص الأنواع. ويمكن تخزين الانسجه العظمية في 1x الفوسفات-المالحة مخزنه (تلفزيوني).

5. التشريح بعد الجمجمة ل RNA

  1. استخدم مشرط لاختراق تجويف البطن ، مما يجعل الشق الطولي يصل إلى الأضلاع (الشكل 3). هذا يفقد الإطار الهيكل العظمي. إذا العظام هو الحفاظ عليها ، تشريح بعناية من الجلد في العضلات وتخزينها في 1x برامج تلفزيونيه بعد تشريح الانسجه الرخوة كامله.
  2. تجريد الجلد للكشف عن العضلات الصدرية ، واتخاذ ما لا يقل عن عينتين من العضلات ، واحده لحل استقرار الجيش النيبالي الريبي وواحده لتبقي المجمدة للحمض النووي HMW ، وضع علي الفور في قارورة لوضعها في LN2.
  3. قطع من خلال عظم القص وسحب بعيدا الأضلاع لجمع عينات من الرئة.
  4. جمع القلب ، والتي يمكن ان تؤخذ كلها ولكن ينبغي ان تقسم في نصفين ، التالي فان حل الحمض الريبي النيبالي يستقر بدقه.
  5. خذ عينات من الكبد. تاخذ ما لا يقل عن عينتين من الكبد ، واحده لتبقي المجمدة للحمض النووي HMW ، وضع علي الفور في قارورة فارغه لوضعها في LN2. الكبد هو الانزيميه جدا ، وانه من المهم لجعل عينات صغيره بما يكفي لحل استقرار الجيش النيبالي الريبي لنقع تماما في.
  6. القناة الكبدية ، والتي تعمل علي استنزاف الصفراء من الكبد ، ويربط الكبد إلى البنكرياس والأمعاء الصغيرة. هذه السفينة يمكن التعرف عليها بسهوله عن طريق التحقق من الجزء السفلي/الخلفي من الكبد وتتبع السفينة بطريقه الخلفي. القناة في كثير من الأحيان لون مخضر ، وكذلك. اتبع القناة الكبدية للعثور علي البنكرياس والمرارة وجمع هذه بشكل منفصل. مكان في قارورة ذات الصلة من حل استقرار الجيش النيبالي الريبي.
  7. جمع المعدة ، وبجانبها ، في قاعدتها والظهور كما الظل مختلفه من اللون الأرجواني ، هو الطحال مثل ريشه. وينبغي أيضا ان يكون البنكرياس مرئيا هنا كبنيه بيضاء (الشكل 3). مكان في قارورة ذات الصلة من حل استقرار الجيش النيبالي الريبي.
  8. جمع عينات صغيره من الأمعاء الصغيرة والكبيرة. مكان في قارورة ذات الصلة من حل استقرار الجيش النيبالي الريبي. ويمكن أيضا فحص الأمعاء ل endoparasite. إذا كان عالم الطفيليات في الميدان ، يمكن اجراء فحص لطفيليات. إذا كان هذا هو الذي ينبغي القيام به في وقت لاحق ، يمكن ان تؤخذ الأمعاء بأكملها في قارورة المبردة 5 مل.
  9. تاخذ واحده من الكلي وتتبع القناات الخاصة بهم إلى المثانة. مكان في قارورة ذات الصلة من حل استقرار الجيش النيبالي الريبي.
  10. استخدام الكلي الأخرى كدليل للعثور علي الخصيتين (إذا ذكر) أو الرحم ومن خلال ذلك المبيضين (إذا انثي). جمع واحد أو كلا الغدد التناسلية ، إذا كان ذلك ممكنا.
  11. الحفاظ علي عينات من أجزاء مختلفه من الجلد من الجناح في قوارير منفصلة (العضلات مقابل الجزء غير العضلي).

6. جمع واعداد ثقافة الانسجه

  1. اعداد متوسط النمو للخلايا من خلال جعل المتوسطة النسر المعدلة دولبيكو (DMEM) التي تحتوي علي 20 ٪ الجنين البقري المصل (الدم) ، 1 ٪ البنسلين/ستربتومايسين (P/S) ، و 50 ميكروغرام/مل جنتاميسين. وينبغي جعل الارصفه من وسائل الاعلام النمو الطازجة كل يوم من البروتوكول.
  2. بعد الجمع ، يجب وضع اللكمات الجناح الخزعة مباشره في 1 مل من متوسط النمو البارد في أنبوب الطرد المركزي 1.5 mL مختومه جيدا. التفاف الأنبوب في بارافيلم لختم.
  3. وينبغي بعد ذلك نقل أنابيب في مربع البوليسترين مع عناصر التبريد للحفاظ علي عينات في 4 درجه مئوية. وينبغي التعجيل بالنقل ؛ علي الرغم من ان, الخلايا السليمة يمكن ان تكون مصنوعة من اللكمات التي تم تخزينها بهذه الطريقة لمده تصل إلى 6 أيام ولكن اقل علي النحو الأمثل23.
  4. وبمجرد نقلها إلى مرفق ثقافة الانسجه ، يمكن استخدام البروتوكول التالي لتوليد ثقافات الخلايا. وينبغي استخدام التقنيات المعقمة القياسية لبقية البروتوكول41.

7. اليوم 1 ثقافة الانسجه: تفكك الانسجه

  1. نقل محتويات الأنبوب (متوسط النمو الذي يحتوي علي خزعة الغشاء الجناح) في أنبوب الطرد المركزي المخروطية 15 مل.
  2. قم بازاله متوسط النمو بعناية. يغسل برفق الخزعة مرتين مع 500 μL من العقيمة تلفزيوني.
  3. أضافه 500 μL من كولاجيناز IV (1 ملغ/مل) إلى الأنبوب. وهذا سوف يسبب هضم الانسجه في الخلايا الفردية.
  4. احتضان بين عشيه وضحيها (الحد الأقصى 16 ح) في 37 درجه مئوية دون الانفعالات.

8. اليوم 2 ثقافة الانسجه: طلاء الخلايا

  1. تشكل المتوسطة النمو الطازجة وقبل الحارة إلى 37 درجه مئوية.
  2. اعداد 6 لوحه ثقافة الانسجه جيدا عن طريق أضافه 2 مل من الطازجة ، والمتوسطة النمو قبل تسخينها في كل بئر من لوحه لاستخدامها (1 جيدا لكل 3 مم خزعة الجناح). تخزين هذه اللوحة في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 حاضنه حتى الحاجة (الخطوة 8.7).
  3. أزاله أنبوب 15 مل التي تحتوي علي الخلايا من الحاضنة وإخماد رد فعل الهضم عن طريق أضافه 1 مل من متوسط النمو الطازج (ما قبل درجه حرارة إلى 37 °C).
  4. أعاده تعليق الخلايا عن طريق الترتيب الدقيق للحل مع طرف ماصه P1000 لتحقيق تعليق خليه واحده.
  5. تدور بلطف أسفل الخلايا في الطرد المركزي اعلي الجدول لمده 3 دقائق في 300 x g.
    ملاحظه: قطع صغيره من الانسجه قد تكون لا تزال مرئية اما في تعليق أو تعلق علي جدار أنبوب 15 مل. ولكن هذا لا يؤثر علي اعداد تعليق الخلية
  6. تخلص من السائل الفائق عن طريق أزاله 80% – 90% من السوائل برفق بماصه P1000.
    ملاحظه: إذا كان لا يزال مرئيا ، لا تتخلص من قطعه من الانسجه ، وبلطف تريرات في الخطوة التالية (8.7).
  7. أعاده تعليق بيليه في 500 μL من متوسطه النمو الحرارة السابقة ، تريريرات بلطف التعليق للتاكد من ان بيليه أو شظايا كبيره من بيليه لم تعد مرئية وان يتم تعليق الخلايا بما فيه الكفاية. قد تبدو وسائل الاعلام غائمة بسبب وجود الخلايا.
    ملاحظه: في هذه المرحلة ، يمكن اجراء عدد الخلايا القابلة للاستمرار من أجل تقييم جوده تعليق الخلايا والغلة من الخلايا المستمدة من مقطع الجناح (انظر الخطوة 10.11 لمزيد من التفاصيل).
  8. ماصه بلطف حجم كامل من تعليق الخلية في بئر واحده من 6 لوحه جيدا.
    ملاحظه: قم بتنفيذ الخطوة أعلاه فورا ولا تسمح للخلايا بالاستقرار بعد الخطوة 8.7. استخدم ماصه لتوزيع تعليق الخلية برفق عبر سطح البئر بطريقه قطره. لا ماصه pipet-x الحل بأكمله في وسط البئر ، لان هذا من شانه ان يؤدي إلى تكتل الخلايا في منتصف البئر.
    ملاحظه: إذا كانت قطعه من الانسجه لا تزال مرئية ، لا نقلها إلى وعاء الثقافة جيدا.
  9. صخره بلطف لوحه من جنبا إلى جنب والامامي إلى الخلف 2x-3x لمساعده الخلايا علي توزيع سطح البئر في طبقه واحده.
  10. تحقق من الخلايا المطلية تحت المجهر ، كما ينبغي ان تكون خلايا واحده التي تظهر بالبالون والعائمة ولكن كثيفه جدا.
  11. وضع بعناية لوحه في حاضنه قبل تعيين إلى 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.
  12. بعد ~ 24 ساعة ، ومراقبه الخلايا تحت المجهر لتحديد صحة الثقافة. وينبغي الآن ان تعلق الخلايا علي سطح اللوحة وتظهر بالأرض (الشكل 4A). قد تكون أنواع الخلايا المختلفة مرئية في الثقافة عند النظر من خلال المجهر.
  13. سيكون هناك علي الأرجح بعض الخلايا العائمة التي لم تعلق. وهناك نسبه من هذه الخلايا ميتة. إذا كان هناك نسبه عاليه من الخلايا العائمة مرئية في البئر ، يجب تحديث وسائل الاعلام. في هذه الحالة ، يستنشق بعناية ~ 50 ٪ من المتوسطة من البئر وأضافه بلطف 1 مل من متوسطه النمو قبل الحرارة إلى جانب البئر حتى لا يزعج الخلايا.
  14. الحفاظ علي الخلايا في حاضنه قبل تعيين إلى 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2. وينبغي ملاحظه الخلايا تحت المجهر بانتظام (ولكن ليس أكثر من مره واحده في اليوم) لتحديد الحاجة إلى الانتعاش وسائل الاعلام أو تقسيم.
    ملاحظه: عندما تكون الخلايا مطليه حديثا ، فانها سوف تقسم بسرعة التالي يجب فحصها كل يوم. بعد مرور بعض الوقت في الثقافة ، سيتباطا النمو ، ويمكن فحصها كل 48 – 72 ساعة.

9. تحديث وسائل الاعلام

  1. تحقق من الخلايا تحت المجهر بانتظام لمراقبه نموها وجوده الثقافة. مراقبه لون وسائل الاعلام كمؤشر علي جودتها. يجب ان تبقي الخلايا في نفس الوسائط لمده أقصاها 3 أيام أو حتى يصبح المرور ضروريا ، أيهما ياتي أولا.
    1. إذا كانت الخلايا تنمو بسرعة وتستنفد وسائل الاعلام ، وهذا سيكون أيضا مرئية للعين ، كما سيتحول لون وسائل الاعلام من الأحمر إلى الأصفر.
  2. كلما لزم الأمر يستنشق بعناية ~ 50 ٪ من المتوسطة من البئر وأضافه بلطف تقريبا نفس الحجم من متوسطه النمو قبل الحرارة إلى جانب البئر حتى لا يزعج الخلايا.
  3. أعاده الخلايا إلى 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 حاضنه.

10. خلايا العبور

  1. وتشير الخلايا العابرة إلى أخذ ثقافة قائمه وتقسيمها إلى ابار جديده. وينبغي ان يحدث المرور عندما تكون الخلايا ~ 80 ٪ متموج [اي ، عندما تحتل ~ 80 ٪ من سطح البئر وفقط ~ 20 ٪ من البلاستيك لا تزال مرئية والثغرات (الشكل 4B)].
  2. يستنشق بعناية وتجاهل ~ 90 ٪ من متوسط النمو.
  3. غسل الخلايا بلطف جدا عن طريق أضافه 1 مل من العقيمة تلفزيوني إلى جدار البئر حتى لا يزعج الخلايا. صخره بلطف لوحه ذهابا وإيابا وجنبا إلى جنب 2x-3x. يستنشق بعناية وتجاهل جميع التلفزيونية من لوحه.
  4. كرر الخطوة 10.3 لغسل الخلايا مره أخرى.
  5. أضافه بلطف 250 μL من تريبسين-أدتا (سيغما الدريتش ، القط #T4049) إلى البئر واحتضان لمده 1.5 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
    ملاحظه: تاكد من ان الحل تريبسين-أدتا يغطي السطح كله من البئر عن طريق هزاز بلطف لوحه.
  6. إرواء رد الفعل عن طريق أضافه 1 مل من المتوسطة الطازجة النمو قبل حرارة.
  7. ماصه صعودا وهبوطا ~ 5x لغسل الخلايا من سطح لوحه وضمان الخلايا في التعليق.
    ملاحظه: وينبغي ان يصبح الحل غائما بسبب وجود الخلايا.
  8. وضع تعليق الخلية في أنبوب 15 مل وتدور أسفل الخلايا في جهاز الطرد المركزي الجدول الأعلى لمده 3 دقائق في 300 x g.
  9. تخلص من السائل الفائق عن طريق أزاله 80% – 90% من السوائل برفق بماصه P1000.
  10. أعاده تعليق بيليه في 1 مل من المتوسطة النمو قبل تسخينها وبلطف تريرات التعليق. تاكد من ان بيليه أو شظايا كبيره من بيليه لم تعد مرئية ، والخلايا في تعليق خليه واحده.
  11. قم بحساب الخلايا باستخدام عداد الخلايا المؤتمت كما هو موضح هنا ، أو يدويا باستخدام مقياس الكريات الدموية كما هو موضح بالتفصيل في42الفيديو المرجعي. اخلطي 10 ميكرولتر من الخلايا المعلقة 1:1 مع الأزرق التركان للكشف عن الخلايا القابلة للحياة.
  12. احتضان لمده دقيقه واحده ، وماصه 10 μL من الحل علي الشريحة العد. قم بادراج شريحة الجرد في عداد خليه مؤتمت لحساب الخلايا باستخدام الإعدادات المناسبة. الغلة سوفت كنت حوالي 1-2 مليون خلايا من متموج بئر وحيد من 6 بئر لوحه, رغم ان هذا يمكن تغيرت [دبندينغ ون] حجم من الخلايا ونوع. إذا لم تكن الخلايا في تعليق خليه واحده ، فلن يكون عدد الخلايا دقيقا.
  13. وسوف تتسامح هذه الثقافات الخلية عموما 1:2 الانقسام [اي ، واحد متموج بئر من الخلايا يمكن تقسيمها إلى بئرين جديده (المجموع)]. للقيام بذلك ، بلطف تريرات الخلايا مره أخرى ، ثم اتخاذ تعليق الخلية في نصفين (~ 730 μL كل) ووضعها في كل من اثنين من الآبار الجديدة التي تحتوي علي 750 μL من متوسطه النمو قبل الحرارة في الأزياء القطرات.
    ملاحظه: بعد 2 – 3 أيام يجب ان تكون الآبار متموج ومره أخرى جاهزه للتقسيم. في هذه المرحلة ، من المستحسن الحفاظ علي بئر واحده من الخلايا بواسطة بروتوكول التجميد الثابت (القسم 11). ويمكن تجميد مخزونات أخرى من الخلايا خلال المزيد من المقاطع كما هو مرغوب فيه.
    ملاحظه: بعد ~ 6 الممرات ، والخلايا تميل إلى دخول الشيخوخة وسوف لم يعد الانقسام. وهذا مؤشر علي انه لم يعد بالإمكان تقسيم الخلايا أو توسيعها لزيادة أرقام الخلايا. وهذا أيضا مؤشر علي ان الخلايا لن تكون قابله للحياة لفتره أطول بكثير.

11. تجميد الخلايا الحية القابلة للحياة

  1. اعداد وسائل الاعلام المجمدة من خلال الجمع بين DMEM مع 20 ٪ من البرنامج ، و 10 ٪ DMEM ، 1 ٪ P/S ، و 50 ميكروغرام/مل جنتاميسين.
  2. يتم تنفيذ التجميد عن طريق أخذ الخلايا بالتكوير وفقا لعمليه العبور. وينبغي ان تكون مستعدة بيليه من 80 ٪-90 ٪ متموج بئر من 6 لوحه جيدا (تمثل ~ 1-2 مليون خليه) ، وفقا للخطوات 8.1-8.9.
  3. أعاده تعليق بيليه في 1.5 mL من المتوسطة تجميد.
  4. مكان ~ 750 μL من تعليق الخلية في كل من تخزن منفصلة اثنين.
  5. وضع قوارير في حاويه تجميد المبردة ، مما يؤدي إلى تجميد الخلايا ببطء للحفاظ علي حيوية الخلية. وضعها علي الفور في-80 درجه مئوية.
  6. بعد 24 – 48 ساعة ، انقل تخزن الخلايا إلى LN2 للتخزين علي المدى الطويل. تخزينها بهذه الطريقة ، يمكن احياء الخلايا وسوف تكون قابله للحياة لسنوات.

12. ذوبان الخلايا المجمدة

  1. اعداد 6 لوحه جيدا تحتوي علي 2 مل من متوسطه النمو قبل الحرارة في كل بئر التي سيتم استخدامها (1 جيدا في قارورة من الخلايا يجري أذابه). الحفاظ علي لوحه في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 حاضنه حتى الحاجة.
  2. تاخذ قنينة واحده من الخلايا من LN2 ووضعها في حمام الماء الدافئ (37 درجه مئوية) لذوبان الخلايا بسرعة. وهذا ينبغي ان يستغرق 2-3 دقيقه.
    ملاحظه: لا تترك القارورات تذوب لمده أطول من 3 – 5 دقائق ، حيث ان DMSO في وسائل التجميد الاعلاميه سامه للخلايا المذابة.
  3. حالما يتم أذابه المحلول في القارورة ، ماصه بلطف صعودا وهبوطا إلى تجانس الحل ووضع فورا الحل بأكمله (~ 750 μL) في بئر واحده من 6 لوحه جيدا (المعدة مسبقا في الخطوة 12.1).
  4. صخره بلطف لوحه من جانب إلى آخر والجبهة إلى الوراء 2-3 مرات لمساعده الخلايا توزيعها علي سطح البئر في طبقه واحده.
  5. ضع الخلايا في الحاضنة عند 37 درجه مئوية و 5% CO2 حاضنه لمده 24 – 48 ساعة.
  6. مراقبه ومرور الخلايا كما هو موضح أعلاه.

النتائج

الحمض النووي
للتحليلات القياسية منخفضه الوزن الجزيئي (lmw) ، تم استخراج الحمض النووي من ثلاثه أنواع الخفافيش مداريه. وجمعت عينات من الانسجه في الميدان من الجمهورية الدومينيكية وكوستاريكا ، وفقا للبروتوكولات الموصوفة في هذه الورقة. بعد تشريح, قطع صغيره (< 0.5 سم في...

Discussion

يصف البروتوكول الذي تمت مناقشته في هذه المخطوطة أفضل ممارسات أخذ العينات لمختلف التحليلات الجزيئية عاليه الانتاجيه للخفافيش. جميع الدراسات الناجحة-الomics تتطلب انسجه عاليه الجودة ، ولكن أخذ العينات الانسجه الخفافيش ، فضلا عن غيرها من الكائنات غير النموذجية ، وغالبا ما يحدث في الظروف المي...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

ونحن نشكر سنترو دي Ecología y Biodiversidad CEBIO ، اريكا بإليزا ، ميليسكا سانشيز ، خورخي كاريرا ، ادغار رينغيفو فاسكيز ، هارولد بوروكاريرو زاريا ، خورخي رويس ليفيو ، خايمي بيتشيكو كاستيلو ، كارلوس تيلو ، فاني كورنيخو ، وفانيي فرنانديز ميلو لصنع الانسجه تجميع في بيرو يمكن. ونشكر أيضا جميع أعضاء مجموعه جوارافا ويولاندا ليون لجعل جمع الانسجه في الجمهورية الدومينيكية ممكنا ، فضلا عن برنال رودريغيز هيرنانديز ، برنال ماتاريتا ، والجميع في محطه لا سيلفا للبحوث البيولوجية في كوستاريكا ، لجعل أخذ العينات ممكن. ونحن نشكر آيلا Lattenkamp & لوتس Wiegrebe للوصول وجمع عينه من اللكمات الجناح من الخفافيش اللون Phyllostomus لتوليد ثقافة الخلية. [ فلولوستووس] [ديسلون] خفاش نشا من يتوالد مستعمره في القسم علم الاحياء [ايي] من [لودويغ-ماكسيميليان-ونيفرستي] في ميونيخ. تم إصدار الموافقة علي الحفاظ علي وتولد الخفافيش من قبل مكتب البيطرية منطقه ميونيخ. تم تمويل LMD و SJR و KTJD و LMD من قبل NSF-DEB 1442142. تم تمويل LMD من قبل NSF-DEB 1838273. وقد تم تمويل LRY من قبل NSF-PRFB 1812035. تم تمويل SCV و PD من قبل جائزه مجموعه ماكس بلانك البحثية ، ومنحه البحوث برنامج علوم الحدود البشرية (HFSP) (RGP0058/2016). تم تمويل SJR ، JHTP المشاركة ، و KTJD من قبل مجلس البحوث الأوروبي (الاغاثه الاوليه التي بدات منحه 310482 [EVOGENO]) الممنوحة ل SJR ، تم تمويل الخ من قبل المجلس الأوروبي 2012 للبحوث منحه (StG311000).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Eppendorf Safelock tubesFischer Scientific105096911.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol
15 mL tubesSarstedt62,554,00215 mL sterile tubes used during cell culture protocol
2 mL cryovialsThomas Scientific1154P75cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen
3-mm biopsy punchMedlineMIL3332wing biopsy punch for cell culture
6 well plateGreiner83,392Culture vessle
Allprotect Tissue ReagentQiagen76405for fecal samples; tissue stabilizing solution
Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamberBio-Rad145-0011Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad
collagenase IVStemcell Technologies7909For dissociation of primary cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma AldrichD2650-5X5MLPrevents crystalization of water during freezing of the cells.
DMEM–Dulbecco's Modified Eagle MediumThermo Fisher12491-015culture media
Dulbecco's PBSInvitrogen14190169Balanced salt solution used for washing cells
Fetal bovine serum (FBS)Fischer Scientific10270106Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells
Gentamycin sulfate saltSigma AldrichG1264-250MGAntibiotic for culture media
Nalgene Mr. FrostyThermo Scientific5100-0050Freezing container which provides 1°C/min cooling rate
PARAFILMSigmaP7793Wrapping tubes etc for sealing
Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100xInvitrogen15140130Antibiotic for culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4Thermo Fisher10010023salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water
RNAlaterThermo FisherAM7021RNA stabilizing solution
RNAse awayGenetech83931-250mLbreaks down enzymes that lead to RNA degradation
Silica gelFisher Scientific7631-86-9dessicant agent
TC20 Automated Cell CounterBio-Rad1450102Automated cell counter
Trypan blueBio-Rad145-0013Cell stain used to assess cell viability
trypsin-EDTASigma AldrichT4049For dissociation of cells during splitting

References

  1. Jiao, W. B., Schneeberger, K. The impact of third generation genomic technologies on plant genome assembly. Current Opinion in Plant Biology. 36, 64-70 (2017).
  2. van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Naquin, D., Thermes, C. The third revolution in sequencing technology. Trends in Genetics. 34 (9), 666-681 (2018).
  3. Lee, H., et al. Third-generation sequencing and the future of genomics. bioRxiv. , 048603 (2016).
  4. Mayjonade, B., et al. Extraction of high-molecular-weight genomic DNA for long-read sequencing of single molecules. BioTechniques. 62 (1), xv (2017).
  5. Teeling, E., et al. Bat biology, genomes, and the Bat1K project: To generate chromosome-level genomes for all living bat species. Annual Review of Animal Biosciences. 6 (12), 1-24 (2018).
  6. Jones, G., Teeling, E. C., Rossiter, S. J. From the ultrasonic to the infrared: molecular evolution and the sensory biology of bats. Frontiers in Physiology. 4 (117), 1-16 (2013).
  7. Vincenot, C. E., Florens, F. B. V., Kingston, T. Can we protect island flying foxes. Science. 355 (6332), 1368-1370 (2017).
  8. Blehert, D. S., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen?. Science. 323 (5911), 227 (2009).
  9. Foley, J., Clifford, D., Castle, K., Cryan, P., Ostfeld, R. S. Investigating and managing the rapid emergence of White Nose Syndrome, a novel, fatal, infectious disease of hibernating bats. Conservation Biology. 25 (2), 223-231 (2011).
  10. Foley, N. M., et al. Growing old, yet staying young: The role of telomeres in bats’ exceptional longevity. Science Advances. 4, (2018).
  11. Dammann, P. Slow aging in mammals—Lessons from African mole-rats and bats. Seminars in Cell and Developmental Biology. 70, 154-163 (2017).
  12. Tsagkogeorga, G., Parker, J., Stupka, E., Cotton, J. A., Rossiter, S. J. Phylogenomic analyses elucidate the evolutionary relationships of bats. Current Biology. 23 (22), 2262-2267 (2013).
  13. Rohland, N., Reich, D. C. o. s. t. -. e. f. f. e. c. t. i. v. e. high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
  14. Yohe, L. R., et al. Trpc2 pseudogenization dynamics in bats reveal ancestral vomeronasal signaling, then pervasive loss. Evolution. 71 (4), 923-935 (2017).
  15. Shen, B., Han, X., Zhang, J., Rossiter, S. J., Zhang, S. Adaptive evolution in the glucose transporter 4 gene Slc2a4 in Old World fruit bats (family: Pteropodidae). PLoS ONE. 7 (4), e33197 (2012).
  16. Rojas, D., Warsi, O. M., Dávalos, L. M. Bats (Chiroptera: Noctilionoidea) challenge a recent origin of extant neotropical diversity. Systematic Biology. 65 (3), 432-448 (2016).
  17. Vonhof, M. J., Russell, A. L. Genetic approaches to the conservation of migratory bats: a study of the eastern red bat (Lasiurus borealis). PeerJ. 3, e983 (2015).
  18. Korstian, J. M., Schildt, A. J., Bennett, V. J., Williams, D. A., Hale, A. M. A method for PCR-based identification of bat species from fecal samples. Conservation Genetics Resources. 7 (4), 803-806 (2015).
  19. Bailey, S. E., et al. The use of museum samples for large-scale sequence capture: A study of congeneric horseshoe bats (family Rhinolophidae). Biological Journal of the Linnean Society. 117 (1), 58-70 (2016).
  20. Boston, E. S. M., et al. Empirical assessment of non-invasive population genetics in bats: Comparison of DNA quality from faecal and tissue samples. Acta Chiropterologica. 14 (1), 45-52 (2012).
  21. Puechmaille, S. J., Mathy, G., Petit, E. J. Good DNA from bat droppings. Acta Chiropterologica. 9 (1), 237-249 (2007).
  22. Corthals, A., et al. From the field to the lab: Best practices for field preservation of bat specimens for molecular analyses. PLoS ONE. 10 (3), 1-12 (2015).
  23. Kacprzyk, J., Teeling, E. C., Kelleher, C., Volleth, M. Wing membrane biopsies for bat cytogenetics: Finding of 2n = 54 in Irish Rhinolophus hipposideros (Rhinolophidae, Chiroptera, Mammalia) supports two geographically separated chromosomal variants in Europe. Cytogenetic and Genome Research. 148 (4), 279-283 (2016).
  24. Greville, L. J., Ceballos-Vasquez, A., Valdizón-Rodríguez, R., Caldwell, J. R., Faure, P. A. Wound healing in wing membranes of the Egyptian fruit bat (Rousettus aegyptiacus) and big brown bat (Eptesicus fuscus). Journal of Mammalogy. 99 (4), 974-982 (2018).
  25. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 403-414 (2018).
  26. Shaw, T. I., et al. Transcriptome sequencing and annotation for the Jamaican fruit bat (Artibeus jamaicensis). PLoS one. 7 (11), e48472 (2012).
  27. Seim, I., et al. Genome analysis reveals insights into physiology and longevity of the Brandt’s bat Myotis brandtii. Nature communications. 4, 2212 (2013).
  28. Lei, M., Dong, D., Mu, S., Pan, Y. H., Zhang, S. Comparison of brain transcriptome of the greater horseshoe bats (Rhinolophus ferrumequinum) in active and torpid episodes. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
  29. Lee, A. K., et al. De novo transcriptome reconstruction and annotation of the Egyptian rousette bat. BMC Genomics. 16 (1), 1-11 (2015).
  30. Francischetti, I. M. B., et al. The “Vampirome”: Transcriptome and proteome analysis of the principal and accessory submaxillary glands of the vampire bat Desmodus rotundus, a vector of human rabies. Journal of Proteomics. 82, 288-319 (2013).
  31. Wen, M., et al. Exploring the genome and transcriptome of the cave nectar bat Eonycteris spelaea with PacBio long-read sequencing. GigaScience. (September), 1-8 (2018).
  32. Gonzalez-Garay, M. L. Introduction to isoform sequencing using pacific biosciences technology (Iso-Seq). Transcriptomics and Gene Regulation. , 141-160 (2016).
  33. Paulo, J. A., Lee, L. S., Banks, P. A., Steen, H., Conwell, D. L. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded pancreatic tissue using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Pancreas. 41 (2), 175 (2012).
  34. Wiśniewski, J. R. Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), (2013).
  35. Sadier, A., et al. Evidence for multifactorial processes underlying phenotypic variation in bat visual opsins. bioRxiv. , 300301 (2018).
  36. Sotero-Caio, C. G., et al. Integration of molecular cytogenetics, dated molecular phylogeny, and model-based predictions to understand the extreme chromosome reorganization in the Neotropical genus Tonatia (Chiroptera: Phyllostomidae). BMC Evolutionary Biology. 15 (1), 1-15 (2015).
  37. Baker, R. J., Hamilton, M. J., Parish, D. A. . Preparations of mammalian karyotypes under field conditions. , (2003).
  38. Song, H., Buhay, J. E., Whiting, M. F., Crandall, K. A. Many species in one: DNA barcoding overestimates the number of species when nuclear mitochondrial pseudogenes are coamplified. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (36), 13486-13491 (2008).
  39. Pooniya, S., Lalwani, S., Raina, A., Millo, T., Das Dogra, T. Quality and quantity of extracted deoxyribonucleic Acid (DNA) from preserved soft tissues of putrefied unidentifiable human corpse. Journal of Laboratory Physicians. 6 (1), 31 (2014).
  40. Camacho-Sanchez, M., Burraco, P., Gomez-Mestre, I., Leonard, J. A. Preservation of RNA and DNA from mammal samples under field conditions. Molecular Ecology Resources. 13, 663-673 (2013).
  41. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Current Protocols in Cell Biology. 66 (1), 1 (2015).
  42. Database, J. S. E. Using a hemacytometer to count cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2018).
  43. Dávalos, L. M., Velazco, P. M., Warsi, O. M., Smits, P. D., Simmons, N. B. Integrating incomplete fossils by isolating conflicting signal in saturated and non-independent morphological characters. Systematic Biology. 63 (4), 582-600 (2014).
  44. Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
  45. Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA Integrity Number (RIN)-Standarization of RNA quality control. Nano. , 1-17 (2004).
  46. Leary, S., et al. . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
  47. Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post morterm interval. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
  48. Hecht, A. M., Braun, B. C., Krause, E., Voigt, C. C., Greenwood, A. D., Czirják, G. Plasma proteomic analysis of active and torpid greater mouse-eared bats (Myotis myotis). Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
  49. Ball, H. C., Levari-Shariati, S., Cooper, L. N., Aliani, M. Comparative metabolomics of aging in a long-lived bat: Insights into the physiology of extreme longevity. PLoS ONE. 13 (5), 1-20 (2018).
  50. Kacprzyk, J., et al. A potent anti-inflammatory response in bat macrophages may be linked to extended longevity and viral tolerance. Acta Chiropterologica. 19 (2), 219-228 (2017).
  51. Littlefair, J. E., Clare, E. L. Barcoding the food chain: from Sanger to high-throughput sequencing. Genome. 59 (11), 946-958 (2016).
  52. Phillips, C. D., et al. Microbiome analysis among bats describes influences of host phylogeny, life history, physiology and geography. Molecular Ecology. 21 (11), 2617-2627 (2012).
  53. Carrillo-Araujo, M., et al. Phyllostomid bat microbiome composition is associated to host phylogeny and feeding strategies. Frontiers in Microbiology. 6 (May), 1-9 (2015).
  54. Hughes, G. M., Leech, J., Puechmaille, S. J., Lopez, J. V., Teeling, E. C. Is there a link between aging and microbiome diversity in exceptional mammalian longevity?. PeerJ. 6, e4174 (2018).
  55. Pannkuk, E. L., et al. Fatty acid methyl ester profiles of bat wing surface lipids. Lipids. 49 (11), 1143-1150 (2014).
  56. Pannkuk, E. L., et al. Glycerophospholipid profiles of bats with white-nose syndrome. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (4), 425-432 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

152

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved