Coleção de tecidos de morcegos para análises de Omics e cultura de células primárias

Resumo

Este é um protocolo para a preparação óptima do tecido para análises genomic, transcriptomic, e proteômica dos bastões capturados no selvagem. Inclui protocolos para captura e dissecção de morcegos, preservação tecidual e cultivo celular de tecido morcego.

Resumo

Como as tecnologias de sequenciamento de alta produtividade avançam, métodos padronizados para aquisição e preservação de tecidos de alta qualidade permitem a extensão desses métodos a organismos não-modelo. Uma série de protocolos para otimizar a coleta de tecido de morcegos foi desenvolvida para uma série de abordagens de sequenciamento de alta taxa de transferência. Descritos aqui estão os protocolos para a captura de morcegos, a demografia desejada a ser coletado para cada morcego, e métodos otimizados para minimizar o stress em um morcego durante a coleta de tecido. Especificamente delineados são métodos para coletar e tratar o tecido para obter (i) DNA para análises genômicas de alto peso molecular, (II) RNA para transcriptomas específicos do tecido, e (III) proteínas para análises de nível proteômico. Por fim, também esboçado é um método para evitar a amostragem letal através da criação de culturas de células primárias viáveis de clipes de asa. Uma motivação central destes métodos é maximizar a quantidade de dados moleculars e morfológicos potenciais para cada bastão e sugerir maneiras ideais de preservar tecidos assim que mantêm seu valor enquanto os métodos novos se desenvolvem no futuro. Esta padronização tornou-se particularmente importante à medida que surgiram iniciativas para sequenciar genomas de espécies em nível de cromossomo, livres de erros em todo o mundo, nos quais vários partidos científicos estão liderando o sequenciamento de diferentes taxonômicos Grupos. Os protocolos descritos neste documento definem os métodos ideais de coleta e preservação tecidual para Bat1K, o consórcio que está sequenciando os genomas de todas as espécies de morcegos.

Introdução

Os métodos de sequenciamento de alta taxa de transferência (HTS) avançaram rapidamente na eficiência e diminuíram no custo, e agora é possível dimensionar essas abordagens para centenas ou milhares de amostras. Insights obtidos pela aplicação dessas tecnologias têm enormes impactos em várias disciplinas científicas, da biomedicina à evolução e ecologia^1,2,3. No entanto, muitas aplicações HTS dependem criticamente de ácidos nucleicos de alta qualidade de uma fonte viva. Essa limitação é susceptível de se tornar cada vez mais problemática com o desenvolvimento de sequenciamento de terceira geração baseado em moléculas de leitura longa⁴. Por estas razões, há a necessidade de concentrar esforços no estabelecimento de melhores práticas para a coleta de amostras de tecido fresco de organismos selvagens fora do laboratório, o que maximiza a utilidade do material e reduz o número de indivíduos que precisam ser Coletados.

Bat1K é um consórcio internacional de cientistas com uma iniciativa em curso para sequenciar o genoma de todas as espécies de morcegos para a montagem em nível de cromossomo⁵. Morcegos representam 20% da diversidade de mamíferos e têm adaptações excepcionais que têm implicações para a compreensão do envelhecimento, ecologia de doenças, biologia sensorial e metabolismo^5,6. Muitos morcegos também estão ameaçados ou em perigo devido à exploração humana⁷ ou estão rapidamente em declínio devido a patógenos^{8,9, e}sequenciamento de nível de genoma é de grande importância para a conservação destas espécies. Embora o Bat1K atualmente vise sequenciar os genomas de todas as espécies de morcegos, a padronização da coleta de amostras de tecido para sequenciamento genômico de alta qualidade continua sendo um desafio fundamental em toda a comunidade de biólogos organizadores. Além dos dados genóricos, a compreensão funcional da diversidade de adaptações de morcegos requer análises de proteínas e transcriptomas específicas do tecido, muitas vezes exigindo protocolos de coleta separados. Além disso, como em todos os grupos taxonômicos, enquanto a coleta e preservação ideais dos tecidos é essencial para a obtenção de dados de maior qualidade para análises Omics, a comunicação das melhores práticas é muitas vezes difícil por causa de tecnologias em rápida mutação e várias equipes de pesquisa trabalhando de forma independente.

A necessidade de adotar as melhores práticas para a pesquisa bat-ômica é especialmente urgente, uma vez que muitas espécies de morcegos são raras ou ameaçadas. Ao contrário de outros pequenos mamíferos, como roedores e shrews, os morcegos são de longa duração, atribuíveis a mecanismos excepcionais de reparo de DNA¹⁰ e reprodução lenta¹¹, com a maioria das espécies dando à luz apenas um ou (em alguns casos) dois jovens por ano. Por estas razões, as populações de morcegos podem ser lentas para se recuperar da perturbação, e a coleta de muitos indivíduos da natureza não é aconselhável nem viável. Em outras palavras, os protocolos devem ser otimizados para obter a quantidade máxima de dados para uma única amostra, reduzindo assim a necessidade de replicar desnecessariamente os esforços de amostragem.

Aqui, este protocolo centra-se especificamente em métodos estandardizados para a coleção e a amostragem do tecido do bastão para o sequenciamento genomic e transcriptômica e as análises da proteína. Sua principal prioridade é garantir que os tecidos de morcego sejam coletados de forma ética e responsável, variando do processo de licenciamento para a coleta, exportação de tecidos para a minimização do estresse para o animal e condições de armazenamento de longo prazo. As dissecções elaboradas foram desenvolvidas com o objetivo de futuro-impermeabilização a utilidade de materiais diferentes recolhidos. Este manuscrito fornece um guia passo-a-passo para coletar morcegos de forma humana que se destina a minimizar o impacto sobre as populações e maximizar o valor científico. Enquanto o foco deste protocolo é especificamente para uso em morcegos, muitas das etapas são relevantes para outros táxons de vertebrados, especialmente mamíferos.

Visão geral da coleção de tecidos
O procedimento para a coleta de tecido, incluindo a temperatura para armazenamento e a escolha do agente de preservação, será determinado pela natureza de quaisquer análises a jusante planejadas. No entanto, é altamente recomendável que, quando possível, o tecido seja coletado uma variedade de métodos para maximizar sua utilidade futura, mesmo que nenhuma análise específica seja planejada. Em geral, o tecido é coletado e preservado para análises subsequentes de ácidos nucleicos (DNA e RNA), ou proteína. Para cada uma dessas aplicações, o tecido pode ser preservado de forma otimizada por congelamento direto do flash em nitrogênio líquido (LN2). No entanto, a imersão imediata em LN2 nem sempre é possível no campo. À medida que a tecnologia avança, recursos como frascos especializados para armazenar DNA e RNA em temperaturas ambientes estão se tornando mais prontamente disponíveis. Embora não tenhamos validado todos esses materiais neste protocolo, incentivamos outros pesquisadores a analisar comparativamente o desempenho de novos materiais em relação ao que apresentamos aqui. Nós fornecemos métodos para preservar idealmente tecido para diferentes aplicações em situações onde LN2 não pode ser acessado, por exemplo, quando o transporte LN2 não é possível devido ao acesso ao site através de um pequeno avião na Amazônia. Além disso, nós fornecemos um método para a coleta de tecido a partir do qual as células ao vivo podem ser cultivadas e propagadas. A seguir, Delineamos as principais considerações para a coleta de material para cada uma dessas finalidades e uma visão geral dos métodos de coleta é dada na tabela 1.

Tecido para DNA
Para todos os tecidos colhidos recolhidos, a mídia de armazenamento determinará se ele pode ser usado para a extração de DNA padrão ou de alto peso molecular (HMW). HMW é exigido para o sequenciamento de leitura longa e atualmente necessário para gerar conjuntos de genoma de nível de cromossomo, ou um "padrão de platina" genoma. O ADN do baixo peso molecular (LMW) pode ser extraído do flash congelado, AllProtect (doravante referido como a "solução estabilizando tecido"), ou mesmo RNAlater (doravante "solução de estabilização do RNA")-amostras preservadas (embora as amostras congeladas do flash permaneçam óptimas ). DNA isolado por métodos laboratoriais padrão (por exemplo, colunas de rotação de membrana de sílica gel, fenol-clorofórmio), ainda pode produzir fragmentos de DNA de até ~ 20 kilobases (KB). Conseqüentemente, contanto que há um rendimento suficiente, este formulário do ADN isolado pode ser usado para a única preparação da biblioteca do tamanho da inserção, em que o tamanho da inserção é frequentemente ~ 500 pares de base (BP), e as leituras curtas da seqüência de ~ 100 BP são geradas¹². Este DNA é particularmente útil para "resequencing" projetos ou estudos em que os dados cromossômicos de comprimento total não é necessária. HMW DNA (10-150 KB) é mais desafiador e só pode ser confiável obtido usando tecido que foi rapidamente flash congelado em LN2 após a colheita e mantido a um máximo de-80 ° c até a extração.

O baixo peso molecular ou o ADN fragmentado são frequentemente suficientes para aproximações alvejadas, incluindo a amplificação do gene através do PCR e o sequenciamento de leitura curta¹³. As investigações PCR-baseadas que usam o ADN de LMW que visam somente um ou alguns genes foram altamente informativos em compreender a adaptação e a evolução molecular da biologia sensorial^6,14do bastão, fisiologia¹⁵, phylogenetics ^5,16e conservação^17,18. A recaptura de seqüência direcionada bem-sucedida de baixo peso molecular e DNA fragmentado também foi demonstrada para numerosos grupos de vertebrados, incluindo morcegos¹⁹. Estes métodos são muitas vezes rentáveis e minimamente invasivos para o morcego, como amostras fecais e amostragem de tecido não letal através de cotonetes bucais ou socos de biópsia de asa também são formas comuns de obter DNA para análises de baixo peso molecular^{20, a 21}.

No entanto, a qualidade depende muito do tipo de mídia em que a amostra é armazenada²². Após comparações sistemáticas e quantitativas de cotonetes bucais e punção de biópsia, foram mostrados socos de biópsia de asa para produzir níveis consistentemente mais elevados de DNA e foram menos estressores para o bastão durante a coleta²². Essas comparações também mostraram que os melhores resultados foram obtidos quando o perfurador de asa foi preservado em sílica indicadora (ou seja, um tipo de dessecante feito de grânulos de sílica gel que muda de cor quando a umidade é observada) em vez de outros meios de armazenamento populares, como etanol ou DMSO²²; embora, outros meios de armazenamento que incluem a solução da estabilização do tecido não foram examinados. Os socos de asa também podem ser usados para cultivar células fibroblásticas na cultura, como em Kacprzyk et al.²³ e conforme descrito abaixo (ver seção 6). Para estes métodos, a asa ou o uropatágio devem ser estendidos delicadamente, e um perfurador limpo da biópsia, tipicamente 3 milímetros no diâmetro, deve ser usado para obter a amostra. Esta aproximação parece causar nenhum dano duradouro, com cicatrizes que curam-se sobre dentro das semanas em a maioria de casos²⁴.

HMW DNA (10-150 KB) é mais desafiador e é atualmente apenas confiável obtido usando tecido que foi rapidamente flash congelado em LN2 após a colheita e mantido a um máximo de-80 ° c até a extração. O DNA de HMW (10-150 KB) é crucial para o sequenciamento de DNA de longa leitura e, portanto, para o conjunto do genoma de de novo. Na verdade, enquanto a maioria dos kits comerciais podem ser usados para isolar algum DNA HMW padrão, os tamanhos das moléculas resultantes muitas vezes não atendem aos requisitos de tecnologias de sequenciamento de terceira geração [por exemplo, aqueles lançados por empresas como a Pacific Biosciences (PacBio), Oxford Nanopore Technologies, e 10x Genomics, ou através de métodos de montagem oferecidos pela Bionano Genomics ou Dovetail Genomics]. Como tal, há uma nova demanda por "ultra HMW" DNA (> 150 KB). Ao obter DNA ultra HMW de morcegos, amostras frescas de fígado, cérebro, ou músculo são todos adequados, mas estes devem ser imediatamente flash congelado em LN2 sem qualquer buffer de armazenamento ou crioprotectant. Uma descrição completa dessas etapas está além do escopo deste documento, mas estão disponíveis em outros lugares²⁵.

Tecido para RNA
O RNA é uma molécula única-encalhado que seja menos estável do que o ADN. Embora existam muitas formas de RNA, análises Omics tendem a se concentrar em mRNA (RNA mensageiro) e RNAs pequenas (por exemplo, microRNAs). Após a transcrição, o mRNA é emenado para formar uma transcrição madura que não contém íntrons e representa a porção de codificação de genes/genomas. Os genes codificantes respondem por uma fração minúscula do tamanho do genoma (1%-2%), tornando o mRNA alvo um meio rentável de obter dados de sequência para genes. MicroRNAs são uma classe de RNAs que regulam o processo de tradução de mRNA em proteínas e são, portanto, importantes efetoras regulatórias. As transcrições de RNA podem ser seqüenciadas individualmente, ou mais comumente para análises de-ômeros^{26,27,28,29,30}, como parte de um transcriptome; ou seja, o total de todas as transcrições de RNA presentes em uma determinada amostra.

O seqüenciamento pode ser realizado seguindo vários métodos (ou seja, via RNA-Seq de leitura curta ou isoforma inteira de leitura longa Seq), permitindo a análise da abundância de RNA e do uso de isoforma. Como a quantidade e a diversidade de transcritos de mRNA variam entre células e tecidos, o sequenciamento de RNA possibilita estudar e comparar a expressão gênica e a regulação em amostras. O interesse em arranjar em seqüência RNAs pequenas e em arranjar em seqüência inteiro do isoforma está crescendo, porque estes métodos estão tornando-se cada vez mais biologicamente informativo. A preparação de amostras de tecido para sequenciar diferentes classes de RNA pode ser realizada da mesma forma apresentada neste manuscrito, com apenas os métodos de extração subsequentes diferindo^31,32. Finalmente, porque os transcriptoma oferecem um subconjunto elevado da cobertura do genoma da proteína-codificação, o conjunto de dados montado pode ser útil na montagem e na anotação do genoma, fazendo a coleção de dados do RNA-Seq através de uma escala de tecidos diferentes um componente importante do Iniciativa Bat1K.

Em contraste com o DNA, o RNA é quimicamente instável e também direcionado por enzimas RNase, que são onipresentes em lisados teciduais como uma estratégia defensiva contra vírus baseados em RNA. Por estas razões, a fração de RNA nas células e tecidos começa a degradar logo após o ponto de amostragem e/ou eutanásia. Preservar o RNA exige conseqüentemente etapas para impedir sua degradação. Isto envolve tipicamente preservar o tecido recentemente coletado em 4 ° c em um agente de estabilização tal como a solução de estabilização do RNA para inativar os RNAses naturalmente atuais nos tecidos, seguidos congelando-se para o armazenamento a longo prazo. Como uma alternativa preferida, o tecido pode ser flash congelado em LN2; embora como observado acima, transportando LN2 no campo e mantendo níveis para impedir que o descongelamento do tecido possa ser logisticamente desafiante.

Tecido para proteínas
A composição protéica e a abundância relativa variam entre as células e os tecidos de forma semelhante ao que foi discutido para o RNA; no entanto, as proteínas são, em média, mais estáveis do que o RNA. A identificação proteica usando proteômica normalmente corresponde a uma fração de, e não a seqüência de proteínas inteiras, mas pode fornecer informações sobre a expressão entre os tecidos e caracterizar os patógenos presentes. Como muitas sequências proteicas são conservadas em mamíferos, as amostras de morcegos para proteômica podem ser facilmente contaminadas com proteínas humanas conservados, exigindo protocolos estéreis (por exemplo, luvas, fórceps) durante a coleta. Enquanto o flash-congelamento em LN2 é a melhor maneira de evitar a degradação de proteínas, o uso de gelo seco,-20 freezers ° c, e até mesmo o gelo são adequados se não houver outros meios. Enquanto as temperaturas aumentam, o risco de avaria diferencial da proteína igualmente levanta-se. Agentes estabilizadores como a solução de estabilização tecidual são eficazes na preservação da fração protéica dos tecidos à temperatura ambiente e são adequados para a preservação a curto prazo (até uma semana) quando o flash-congelamento não é viável.

O perfil enzimático de um determinado tecido influencia diretamente na preservação da proteína nele contida. Os tecidos com baixa atividade enzimática, como o músculo, podem preservar os perfis proteicos mesmo nas temperaturas mais elevadas em um freezer doméstico. Por outro lado, o tecido hepático é enzimaticamente reactivo, e as suas proteínas têm probabilidades mais elevadas de degradação durante a preparação. O número crescente de protocolos para a obtenção de perfis proteônicos humanos a partir de formalina-fixo parafina-incorporado (FFPE) amostras sugere que a fixação paraformaldeído de tecidos tem a promessa de baixo custo de preservação da proteína quando o congelamento em cima da coleta não é viável^33,34. Embora altamente dependente do tempo e da circunstância da preservação, as proteínas foram identificadas através de Immunohistochemistry dos espécimes formalin-fixados, etanol-preservados do bastão³⁵. Esta aproximação não é evolutiva à amostragem do Proteomic-nível mas realça o potencial para que os tecidos do bastão formalin-fixos produzam perfis da proteína quando o flash-congelamento está indisponível e outros agentes de estabilização são demasiado caros.

Tecido para cultura celular
Tecido de amostragem e flash-congelamento oferece uma quantidade finita de material a ser usado, e uma vez que o material é usado, ele não está mais disponível. Alternativamente, as culturas de células fornecem células ao vivo que podem ser imediatamente usadas ou preservadas para estudos futuros. As culturas também facilitam a expansão das células para aumentar o rendimento quando as amostras de tecido são pequenas. É particularmente útil nos casos em que a coleta de tecido é limitada, como experimentos com espécies raras em que a amostragem não letal é essencial e, portanto, tem amplas implicações para a conservação. É descrito um protocolo em que a cultura da pilha é possível através da amostragem não-letal do tecido da membrana da asa, mas cultivando é possível com os tipos múltiplos do tecido^36,37. O protocolo fornecido aqui seleciona para células aderentes. A combinação de tecido de origem e meios de crescimento utilizados torna este protocolo adequado para selecionar e crescer fibroblastos, mas se desejar, protocolos alternativos podem ser usados para selecionar para outros tipos de células. No contexto do projeto Bat1K, prevê-se que para espécies raras e ameaçadas, a amostragem não letal de membranas de asa e expansão de amostras através da cultura é essencial para gerar o volume de DNA necessário para as múltiplas tecnologias empregadas⁵ .

Captura de morcego
Todas as pessoas que manuseam morcegos devem ser treinadas por um pesquisador competente de morcego e vacinados contra a raiva com uma série de injeções de pré-exposição. Se mordido, uma série mais adicional de injeções da borne-exposição é ainda necessária. Os métodos padrão para capturar morcegos incluem redes de névoa (Figura 1) e armadilhas de harpa (Figura 2). As redes de névoa são mais comumente usadas e ideais para áreas com atividade de baixa a moderada, pois exigem a maioria dos cuidados para minimizar a angústia dos morcegos. Pequenos morcegos são particularmente vulneráveis e podem morrer de stress se não tendem a rapidamente. Inspeções líquidas freqüentes minimizam lesões de morcegos e mortalidade, bem como danos à rede de névoa. Este detalhe é importante porque a coleção apropriada do tecido exige o tecido de ser fresco, e a atenção imprópria às redes da névoa nos bastões pode conduzir à mortalidade desnecessária ou à mortalidade prematura antes que o investigador possa corretamente processar amostras. Porque vários morcegos podem descansar em uma armadilha de harpa com o mínimo de angústia, esta abordagem é ideal para áreas com alta atividade de morcego, como perto de uma caverna ou grande poleiro. As instruções detalhadas para a captação apropriada do bastão e o processamento de dados para a coleção da informação morfológica e demográfica estão disponíveis nos métodos suplementares.

Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade Stony Brook (protocolo #2013-2034).

1. eutanásia

1. Umedeça uma bola de algodão com um anestésico isoflurano ou outro anestésico disponível.
2. Coloque a bola de algodão em um resealable, hermético saco de plástico. O saco deve ser grande o suficiente para segurar um saco em um saco de pano de morcego confortavelmente.
3. Após alguns minutos de permitir que o saco permeiam com anestésico, coloc um saco do bastão que contem o bastão no saco de plástico.
4. Aguarde alguns minutos até que o bastão é eutanasiado. Morcegos ~ 20 g ou menos em peso exigem aproximadamente 5 – 10 min. morcegos maiores do que isso pode exigir até 20 min. Note que o período de tempo também pode depender da permeabilidade do saco de morcego. Recomenda-se usar o material de pano mais fino possível para maximizar a difusão do anestésico.
5. Verifique se há respiração e batimento cardíaco para garantir que o bastão foi eutanasiado antes da dissecção começar.

2. preparação da dissecção

1. Mantenha toda a instrumentação limpa entre as dissecções, usando o seguinte protocolo.
2. Lave os instrumentos com água e sabão de prato. Limpe-os com 10% lixívia, longe da área de dissecção, como lixívia vai quebrar os ácidos nucleicos.
3. Limpe com 70% de etanol.
4. Limpe com reagente de descontaminação de RNAse.
5. Repita esta seção após cada dissecção.

3. preparando os frascos para amostras de tecido

1. Para RNA:
   1. Prepare todos os frascos antes de iniciar quaisquer dissecções para evitar atrasos.
   2. Anular o número de frascos necessários para cada espécime. Rotule cada tubo com o tipo do tecido que será coletado, assim como a informação padrão da identificação do espécime. Encha os frascos 50% cheios da solução de estabilização do RNA, e idealmente refrigerar a 4 ° c.
   3. Tome cuidado para não encher os frascos completamente com solução de estabilização de RNA, caso contrário, o tubo pode explodir quando colocá-lo em LN2. Ao tomar amostras de tecido, lembre-se que grandes caroços de tecido não será totalmente permeado pela solução de estabilização de RNA. Portanto, cortar o tecido em pedaços menores de não maior que 0,5 cm em uma dimensão, e manter uma proporção de pelo menos 10:1 volume para solução de estabilização de RNA: tecido.
   4. No mínimo, os tecidos dissecados precisam ser colocados em solução de estabilização de RNA, mesmo se o acesso a LN2 ou armazenamentos frios em indisponível.
2. Para o DNA:
   Nota: o conteúdo de DNA nuclear é o mesmo para quase todos os tecidos; Portanto, a amostragem pode ser flexível. No entanto, deve-se notar que maiores densidades de mitocôndrias no tecido muscular podem levar a uma perda de leituras para o genoma nuclear³⁸.
   1. Para o DNA de baixo peso molecular, tomar uma ou mais repetições de membrana de asa para armazenamento em sílica, e/ou músculo para armazenamento em solução de estabilização de RNA ou solução de estabilização tecidual.
   2. Para ultra HMW DNA, Flash-Freeze em LN2 sem qualquer reagente de armazenamento, em seguida, transferir para o armazenamento a longo prazo em-80 ° c ou mais frio. A partir da dissecção craniana, o tecido cerebral é o tipo de tecido mais adequado para recuperar o DNA ultra HMW³⁹, enquanto que a partir de dissecções pós-cranianas, fígado ou músculo são mais adequados⁴⁰.
   3. Para a dissecção craniana, use frascos de 5 mL (ao contrário dos frascos padrão de 2 mL) da solução de estabilização do RNA para algum tecido. Todos os frascos devem ser criogênicos. Mantenha os frascos no gelo durante a dissecação.

4. dissecções cranianas para o RNA

1. Imediatamente após a eutanásia, decapitar o espécime com um grande par de tesouras ou cortadores ósseos (Figura 3).
2. Retire os olhos com fórceps usando força suficiente forte para separar o nervo óptico. Coloque os olhos no frasco para injetáveis de 2 mL de solução de estabilização de RNA.
3. Usando sua ferramenta de escolha, a pele do crânio do cabelo, fáscia, e os músculos do crânio, incluindo a pele no nariz. Tome cuidado para não quebrar a extremidade dianteira do nariz.
4. Usando tesouras, faça um corte sagital na porção ventral (Figura 3) do crânio começando no pescoço, tomando cuidado para não danificar o cérebro.
5. Usando o fórceps, puxe delicadamente para trás ambos os lados do crânio até que rachou aberto e o cérebro está exposto.
6. Na extremidade caudal do crânio, as cócleas devem agora ser visíveis lateralmente em cada lado da cabeça. Eles são pequenos, ossos esféricos no lado esquerdo e direito, apenas rostral para o pescoço e posterior para os músculos masseter. Usando o fórceps, puxe delicadamente as cócleas e põr os em um frasco de 2 ml da solução de estabilização do RNA.
7. Raspe delicadamente o cérebro (que será muito macio) com fórceps. O bulbo olfativo tornar-se-á visível, sentando-se na porção ventral do interior do crânio. Tente manter o bulbo olfatório anexado.
8. Se o bulbo olfativo ainda não tiver sido removido, retire suavemente o tecido e a placa cribriforme se tornará aparente. Este é um osso crítico para manter o pesquisador orientado. Ele pode ser identificado como a região mais anterior do crânio com forame múltiplo e o ponto em que dois sulcos onde o bulbo olfativo repousa.
9. Se possível, manter a forma cerebral intacta e imediatamente colocar no gelo seco para manter a forma ou em um frasco de 5 mL de solução de estabilização de RNA. Se immunohistochemistry deve ser feito no cérebro, coloc em paraformaldehyde de 4%, se disponível.
10. Faça duas incisões onde a mandíbula superior e inferior se juntam, e retire a mandíbula.
11. Uma vez que a mandíbula foi removida, retire o rostro (maxilar superior) da parte restante do crânio. Assegure-se de que a mandíbula inclua a placa cribriforme.
12. Coloque o nariz em solução de estabilização de RNA e armazene a 4 ° c durante a noite. Porque este é um tecido denso, exige o tempo para permitir que a solução de estabilização do RNA permeiam o tecido inteiro.
13. Coloque o frasco para injetáveis de nariz em LN2 após a imersão durante a noite na solução de estabilização de RNA.
14. A partir da mandíbula inferior, corte a língua com tesouras e coloque em um frasco de 2 mL de RNA para mais tarde.
15. Este protocolo perde a maior parte do crânio. Os dentes, particularmente os da mandíbula, podem ser recuperados e podem ser úteis para diagnósticos de espécies. O tecido ósseo pode ser armazenado em soro fisiológico com tampão fosfato 1x (PBS).

5. dissecções pós-cranianas para RNA

1. Use um bisturi para perfurar a cavidade abdominal, fazendo uma incisão longitudinal até as costelas (Figura 3). Isto perde o quadro esquelético. Se o osso deve ser preservado, dissece com cuidado da pele no músculo e armazene-o em 1X PBS depois que a dissecção macia do tecido está completa.
2. Descasque a pele para revelar o músculo peitoral, tome pelo menos duas amostras do músculo, uma para a solução de estabilização do RNA e uma para permanecer congelada para o ADN de HMW, coloc imediatamente em um tubo de ensaio para põr em LN2.
3. Corte através do esterno e retire as costelas para coletar amostras do pulmão.
4. Colete o coração, que pode ser tomado inteiro mas deve ser seccionado nas metades, assim que a solução de estabilização do RNA absorve completamente.
5. Pegue amostras do fígado. Tomar pelo menos duas amostras de fígado, um para permanecer congelado para HMW DNA, colocando imediatamente em um frasco vazio para colocar em LN2. O fígado é muito enzimático, e é importante fazer as amostras pequenas bastante para que a solução de estabilização do RNA mergulhe inteiramente dentro.
6. O ducto hepático, que funciona para drenar a bile do fígado, conecta o fígado ao pâncreas e intestino delgado. Este vaso é facilmente identificável através da sondagem da porção inferior/posterior do fígado e traçando o vaso de forma posterior. O duto é frequentemente uma cor esverdeado, também. Siga o duto hepático para encontrar o pâncreas e a vesícula biliar e recolher estes separadamente. Coloc em frascos respectivos da solução de estabilização do RNA.
7. Recolher o estômago e, ao lado dele, em sua base e aparecendo como um tom diferente de roxo, é o baço de penas. O pâncreas também deve ser visível aqui como uma estrutura branca (Figura 3). Coloc em frascos respectivos da solução de estabilização do RNA.
8. Colete pequenas amostras do intestino delgado e grande. Coloc em frascos respectivos da solução de estabilização do RNA. Os intestinos também podem ser rastreados para endoparasita. Se um parasitologista estiver no campo, uma inspeção para parasitas pode ser realizada. Se isto é para ser feito em um momento posterior, o intestino inteiro pode ser tomado em um frasco criogênico de 5 mL.
9. Tome um dos rins e siga seus dutos para a bexiga. Coloc em frascos respectivos da solução de estabilização do RNA.
10. Use o outro rim como um guia para encontrar os testículos (se macho) ou útero e através dele os ovários (se fêmea). Colete uma ou ambas as gônadas, se possível.
11. Manter amostras de várias partes da pele da asa em frascos separados (muscular vs. parte não-muscular).

6. coleção e preparação da cultura do tecido

1. Prepare o meio de crescimento para as células, tornando-se o meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM) contendo 20% de soro bovino fetal (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) e 50 μg/mL de gentamicina. Alíquotas de meios de crescimento deve ser feito fresco todos os dias do protocolo.
2. Após a coleta, os socos de biópsia de asa devem ser colocados diretamente em 1 mL de meio de crescimento frio em um tubo de centrífuga 1,5 mL bem selado. Enrole o tubo no parafilm para selar.
3. Os tubos devem então ser transportados numa caixa de poliestireno com elementos de arrefecimento para manter as amostras a 4 ° c. Os transportes devem ser acelerados; embora, as pilhas saudáveis possam ser feitas dos socos que foram armazenados nesta maneira por até 6 dias mas menos otimamente²³.
4. Uma vez transportado para a instalação de cultura de tecidos, o seguinte protocolo pode ser usado para gerar culturas de células. As técnicas estéreis padrão devem ser usadas para o descanso do protocolo⁴¹.

7. dia 1 cultura do tecido: dissociação do tecido

1. Transfira o conteúdo do tubo (meio de crescimento que contém a biópsia da membrana da asa) em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL.
2. Retire cuidadosamente o meio de crescimento. Lave suavemente a biópsia duas vezes com 500 μL de PBS estéril.
3. Adicionar 500 μL de colagenase IV (1 mg/mL) ao tubo. Isso fará com que a digestão do tecido em células individuais.
4. Incubar durante a noite (máximo 16 h) a 37 ° c sem agitação.

8. dia 2 cultura do tecido: células de chapeamento

1. Compo o meio fresco do crescimento e Pre-aqueça-o a 37 ° c.
2. Prepare uma placa da cultura do tecido de 6 poços adicionando 2 mL do meio de crescimento fresco, pre-aquecido em cada poço da placa a ser usada (1 poço por a biópsia da asa de 3 milímetros). Guarde esta placa numa incubadora de 37 ° c e 5% CO₂ até que seja necessário (passo 8,7).
3. Retire o tubo de 15 mL que contém as células da incubadora e saciar a reacção de digestão adicionando 1 mL de meio de crescimento fresco (pré-aquecido a 37 ° c).
4. Resuspend as pilhas cuidadosamente triturando a solução com uma ponta de pipeta P1000 para conseguir uma única suspensão da pilha.
5. Gire delicadamente para baixo as pilhas em uma centrifugação da parte superior de tabela por 3 minutos em 300 x g.
   Nota: Pequenos pedaços de tecido podem ainda ser visíveis em suspensão ou presos à parede do tubo de 15 mL. No entanto, isso não impacta a preparação da suspensão celular
6. Elimine o sobrenadante removendo suavemente 80% – 90% do líquido com uma pipeta P1000.
   Nota: se ainda estiver visível, não descarte o pedaço de tecido, e gentilmente triturá-lo na próxima etapa (8,7).
7. Ressuspender a pelota em 500 μL de meio de crescimento pré-aquecido, triturar suavemente a suspensão para garantir que a pelota ou grandes fragmentos da pelota não são mais visíveis e que as células estão suficientemente suspensas. A mídia pode parecer nublado devido à presença de células.
   Nota: Nesta fase, uma contagem de células viável pode ser realizada a fim de avaliar a qualidade das células de suspensão e rendimento de células derivadas do clipe de asa (ver passo 10,11 para mais detalhes).
8. Pipeta delicadamente o volume inteiro de suspensão da pilha em um único poço de uma placa de 6 poços.
   Nota: Execute a etapa acima imediatamente e não permita que as células se instalem após a etapa 8,7. Use uma pipeta para distribuir delicadamente a suspensão da pilha através da superfície do poço em uma forma gota gota. Não Pipet toda a solução para o centro do poço, pois isso resultaria nas células aglutenando no meio do poço.
   Nota: se o pedaço de tecido ainda está visível, não transferi-lo para a embarcação de cultura bem.
9. Balance suavemente a placa de lado a lado e frente-a-trás 2x – 3x para ajudar as células a distribuir sobre a superfície do poço em uma única camada.
10. Verific as pilhas chapeadas o microscópio, porque devem ser únicas pilhas que aparecem balled acima e flutuando mas muito denso.
11. Coloc com cuidado a placa em uma incubadora pre-ajustou-se a 37 ° c e a 5% CO₂.
12. Após ~ 24 h, observar as células o microscópio para determinar a saúde da cultura. As células devem agora ser anexadas à superfície da placa e aparecem achatado (figura 4a). Os tipos diferentes da pilha podem ser visíveis na cultura ao olhar através do microscópio.
13. Provavelmente haverá algumas células flutuantes que não foram anexadas. Uma proporção dessas células está morta. Se houver uma alta proporção de células flutuantes visíveis no poço, a mídia deve ser atualizada. Neste caso, aspirar cuidadosamente ~ 50% do meio do poço e gentilmente adicionar 1 mL de meio de crescimento pré-aquecido para o lado do poço, de modo a não perturbar as células.
14. Manter as células em uma incubadora pré-definido para 37 ° c e 5% CO₂. As células devem ser observadas o microscópio regularmente (mas não mais de uma vez por dia) para determinar a necessidade de refresco ou divisão de mídia.
    Nota: Quando as células são recém-banhado, eles vão dividir rapidamente e por isso deve ser verificado todos os dias. Depois de algum tempo na cultura, o crescimento vai abrandar, e eles podem ser verificados a cada 48 – 72 h.

9. mídia refrescante

1. Verifique as células o microscópio regularmente para observar o seu crescimento e qualidade da cultura. Monitore a cor da mídia como um indicador de sua qualidade. As células devem permanecer na mesma mídia por um máximo de 3 dias ou até que o de seja necessário, o que ocorrer primeiro.
   1. Se as células estão crescendo rapidamente e esgotar a mídia, isso também será visível para o olho, como a cor da mídia vai virar de vermelho para amarelo.
2. Sempre que necessário aspirar cuidadosamente ~ 50% do meio do poço e gentilmente adicionar aproximadamente o mesmo volume de meio de crescimento pré-aquecido para o lado do poço de modo a não perturbar as células.
3. Retorne as pilhas ao ° c 37 e à incubadora de 5% CO₂ .

10. células de passaging

1. As células passaging referem-se a tomar uma cultura existente e dividi-la em novos poços. Passaging deve ter lugar quando as células são ~ 80% confluente [ou seja, quando ocupam ~ 80% da superfície do poço e apenas ~ 20% do plástico ainda é visível como lacunas (Figura 4B)].
2. Aspirar e descartar com cuidado ~ 90% do meio de crescimento.
3. Lave as células muito suavemente, adicionando 1 mL de PBS estéril para a parede do poço de modo a não perturbar as células. Balanç delicadamente a placa para a frente e para trás e lado a lado 2x-3x. Aspirar e descartar cuidadosamente todos os PBS da placa.
4. Repita o passo 10,3 para lavar as células novamente.
5. Adicione delicadamente 250 μL de Trypsin-EDTA (Sigma Aldrich, Cat #T4049) ao poço e incubar por 1,5 minutos à temperatura ambiente.
   Nota: Certifique-se que a solução do trypsin-EDTA cobre a superfície inteira do poço balanç delicadamente a placa.
6. Saciar a reacção adicionando 1 mL de meio de crescimento pré-aquecido fresco.
7. Pipeta acima e para baixo ~ 5x para lavar as pilhas da superfície da placa e para assegurar-se de que as pilhas estejam na suspensão.
   Nota: A solução deve ficar turva devido à presença das células.
8. Coloc a suspensão da pilha em um tubo de 15 mL e gire para baixo as pilhas em uma centrífuga Table-Top por 3 minutos em 300 x g.
9. Elimine o sobrenadante removendo suavemente 80% – 90% do líquido com uma pipeta P1000.
10. Ressuscitem o pellet em 1 mL de meio de crescimento pré-aquecido e trituram suavemente a suspensão. Certifique-se de que a pelota ou grandes fragmentos da pelota não são mais visíveis, e as células estão em uma única suspensão de células.
11. Conte as células usando um contador de células automatizado, conforme descrito aqui, ou manualmente, usando um hemociômetro conforme descrito detalhadamente no vídeo de referência⁴². Misture uma alíquota de 10 μL das células suspensas 1:1 com o azul de trypan para detectar células viáveis.
12. Incubar durante 1 min, e pipetar 10 μL da solução para o slide de contagem. Insira o slide de contagem em um contador de célula automatizado para contar as células usando as configurações apropriadas. O rendimento deve ser em torno de 1 – 2 milhões de células de um poço confluente de uma placa de 6 poços, embora isso possa variar dependendo do tamanho das células e espécies. Se as células não estiverem em uma única suspensão de célula, a contagem de células não será precisa.
13. Estas culturas da pilha tolerarão geralmente uma separação 1:2 [isto é, um poço confluente das pilhas pode ser dividido em dois poços novos (total)]. Para fazer isso, triturar suavemente as células novamente, em seguida, tomar a suspensão celular em duas metades (~ 730 μl cada) e colocá-los em cada um dos dois novos poços contendo 750 μL de pré-aquecido meio de crescimento em forma gota gota.
    Nota: Após 2 – 3 dias, os poços devem ser confluentes e novamente prontos para a divisão. Neste ponto, recomenda-se preservar um poço de células pelo protocolo de congelamento (seção 11). Uns estoques mais adicionais das pilhas podem ser congelados durante umas passagens mais adicionais como desejável.
    Nota: Depois de ~ 6 passagens, as células tendem a entrar em senescência e não vai mais dividir. Esta é uma indicação de que as células não podem mais ser divididas ou expandidas para aumentar os números de células. Esta é também uma indicação de que as células não serão viáveis por muito mais tempo.

11. congelamento de células vivas viáveis

1. Prepare a mídia congelante combinando DMEM com 20% FBS, 10% DMSO, 1% P/S e 50 μg/mL de gentamicina.
2. O congelamento é realizado tomando células peletizadas de acordo com o processo de de. O pellet deve ser preparado a partir de um poço de 80% – 90% confluente de uma placa de 6 poços (representando ~ 1 – 2 milhões de células), de acordo com as etapas 8.1 – 8.9.
3. Resuspend o pellet em 1,5 mL de meio de congelação.
4. Coloque ~ 750 μL de suspensão celular em cada um dos dois criooviais separados.
5. Coloc os frascos em um recipiente de congelação criogênico, que resulte nas pilhas que congelam lentamente para manter a vitalidade da pilha. Coloque-os imediatamente em-80 ° c.
6. Após 24 – 48 h, transfira os cryovials das pilhas a LN2 para o armazenamento a longo prazo. Armazenadas dessa forma, as células podem ser revividas e serão viáveis por anos.

12. thawing células congeladas

1. Prepare uma placa de 6 poços contendo 2 mL de meio de crescimento pré-aquecido em cada poço que será utilizado (1 poço por frasco de células a ser descongelados). Mantenha a placa no ° c 37 e na incubadora de 5% CO₂ até que necessário.
2. Tome um frasco de células de LN2 e coloque-o num banho de água quente (37 ° c) para descongelar rapidamente as células. Isto deve demorar 2 – 3 min.
   Nota: Não deixe os frascos descongelados durante mais de 3 a 5 minutos, uma vez que o DMSO no meio de congelação é tóxico para as células depois de thawed.
3. Assim que a solução no frasco for descongelada, gentilmente Pipetar para cima e para baixo para homogeneizar a solução e imediatamente colocar toda a solução (~ 750 μL) em um poço de uma placa de 6 poços (pré-preparados na etapa 12,1).
4. Agitar suavemente a placa de lado a lado e de frente para trás 2 – 3 vezes para ajudar as células a distribuir sobre a superfície do poço em uma única camada.
5. Coloque as células na incubadora a 37 ° c e 5% CO₂ incubadora para 24 – 48 h.
6. Monitore e passe as células como descrito acima.

Resultados

Dna
Para as análises padrão de baixo peso molecular (LMW), o DNA foi extraído de três espécies de morcegos neotropicais. Amostras de tecido foram coletadas no campo da República Dominicana e da Costa Rica, seguindo os protocolos descritos neste artigo. Após a dissecção, as partes pequenas (< 0.5 cm na seção a mais fina) de tecidos misturados (cérebro, fígado, e intestine) foram coloc na solução de estabilização do RNA, Flash congelado, a seguir armazen...

Discussão

O protocolo discutido neste manuscrito descreve as melhores práticas de amostragem para várias análises moleculares de alta produtividade de morcegos. Todos os estudos de sucesso-Omics exigem tecido de alta qualidade, mas o tecido de morcego de amostragem, bem como outros organismos não-modelo, muitas vezes ocorre em condições de campo que não podem ser definidas para os mesmos padrões que os de um ambiente de laboratório controlado. A amostragem ocorre frequentemente em locais remotos, com recursos mínimos, in...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf Safelock tubes	Fischer Scientific	10509691	1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol
15 mL tubes	Sarstedt	62,554,002	15 mL sterile tubes used during cell culture protocol
2 mL cryovials	Thomas Scientific	1154P75	cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen
3-mm biopsy punch	Medline	MIL3332	wing biopsy punch for cell culture
6 well plate	Greiner	83,392	Culture vessle
Allprotect Tissue Reagent	Qiagen	76405	for fecal samples; tissue stabilizing solution
Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber	Bio-Rad	145-0011	Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad
collagenase IV	Stemcell Technologies	7909	For dissociation of primary cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650-5X5ML	Prevents crystalization of water during freezing of the cells.
DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher	12491-015	culture media
Dulbecco's PBS	Invitrogen	14190169	Balanced salt solution used for washing cells
Fetal bovine serum (FBS)	Fischer Scientific	10270106	Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells
Gentamycin sulfate salt	Sigma Aldrich	G1264-250MG	Antibiotic for culture media
Nalgene Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0050	Freezing container which provides 1°C/min cooling rate
PARAFILM	Sigma	P7793	Wrapping tubes etc for sealing
Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x	Invitrogen	15140130	Antibiotic for culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4	Thermo Fisher	10010023	salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water
RNAlater	Thermo Fisher	AM7021	RNA stabilizing solution
RNAse away	Genetech	83931-250mL	breaks down enzymes that lead to RNA degradation
Silica gel	Fisher Scientific	7631-86-9	dessicant agent
TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad	1450102	Automated cell counter
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013	Cell stain used to assess cell viability
trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4049	For dissociation of cells during splitting