JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توفر هذه الطريقة إطارا لدراسة دمج الأحماض الدهنية الخارجية من المصادر المضيفة المعقدة في الأغشية البكتيرية ، وخاصة المكوراتالعنقودية العضوية . ولتحقيق ذلك، يتم وصف بروتوكولات لإثراء جزيئات البروتين الدهني من صفار بيض الدجاج وتوصيف الأحماض الدهنية اللاحقة للفوسفوليبيدات البكتيرية باستخدام قياس الطيف الكتلي.

Abstract

المكورات العنقودية أوريوس وغيرها من مسببات الأمراض إيجابية الجرام دمج الأحماض الدهنية من البيئة في فوسفوليبيدات الغشاء. خلال العدوى ، توجد غالبية الأحماض الدهنية الخارجية داخل جزيئات البروتين الدهني المضيف. ولا يزال عدم اليقين قائما فيما يتعلق بخزانات الأحماض الدهنية المضيفة والآليات التي تستخرج بها البكتيريا الأحماض الدهنية من جزيئات البروتين الدهني. في هذا العمل، ونحن نصف بروتوكولات لإثراء البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) جزيئات من صفار البيض الدجاج وتحديد ما إذا كانت LDLs بمثابة خزانات الأحماض الدهنية لS. aureus. هذا الأسلوب يستغل تحليل الدهون غير متحيزة وLDLs الدجاج، وهو نموذج فعال واقتصادي لاستكشاف التفاعلات بين LDLs والبكتيريا. يتم إجراء تحليل S. aureus التكامل من الأحماض الدهنية الخارجية من LDLs باستخدام عالية الدقة / قياس الطيف الكتلي الدقيق والقياس الطيفي الكتلي جنبا إلى جنب، مما يتيح توصيف تكوين الأحماض الدهنية للبكتيريا غشاء وتحديد غير متحيزة من تركيبات جديدة من الأحماض الدهنية التي تنشأ في الدهون الغشاء البكتيري عند التعرض لLDLs. تقدم هذه التقنيات المتقدمة لقياس الطيف الكتلي منظورًا لا مثيل له لدمج الأحماض الدهنية الدهنية من خلال الكشف عن الأحماض الدهنية الخارجية المحددة المدمجة في الدهون الفوسفاتية. الطرق المبينة هنا قابلة للتكيف مع دراسة مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى والمصادر البديلة للأحماض الدهنية المعقدة.

Introduction

Methicillin مقاومة S. aureus (MRSA) هو السبب الرئيسي للعدوى المرتبطة بالرعاية الصحية ومقاومة المضادات الحيوية المرتبطة بها هو تحد سريري كبير1،2،3. ولذلك، فإن وضع استراتيجيات علاجية جديدة هو أولوية عالية. استراتيجية العلاج واعدة لمسببات الأمراض إيجابية الجرام هو تثبيط تخليق الأحماض الدهنية، وهو شرط لإنتاج الدهون الفوسفاتية الغشاء الذي، في S. أوريوس،ويشمل فوسفاتيديلغليسيرول (PG)، ليسل-PG، وcardiolipin4. في البكتيريا، يحدث إنتاج الأحماض الدهنية عن طريق التخليق الأحماض الدهنية الثاني المسار (FASII)5، والذي يختلف اختلافا كبيرا عن نظيره eukaryotic، مما يجعل FASII هدفا جذابا لتطوير المضادات الحيوية5،6 . مثبطات FASII تستهدف في المقام الأول FabI، وهوإنزيم مطلوب لاستطالة سلسلة الكربون الأحماض الدهنية 7. يستخدم على نطاق واسع مثبطات فابي التريكلوسان في السلع الاستهلاكية والطبية8،9. ويجري تطوير مثبطات FabI إضافية من قبل العديد من شركات الأدوية لعلاج عدوى S. aureus 10،11،12،13،14 ،15،16،17،18،19،20،21،22،23 ،24،25،26. ومع ذلك، العديد من مسببات الأمراض إيجابية غرام، بما في ذلك S. aureus،قادرة على مسح الأحماض الدهنية الخارجية لتخليق الدهون الفوسفاتية، وتجاوز تثبيط FASII27،28،29. وهكذا، يتم مناقشة الإمكانات السريرية لمثبطات FASII بسبب وجود ثغرات كبيرة في معرفتنا بمصادر الأحماض الدهنية المضيفة والآليات التي تقوم بها مسببات الأمراض باستخراج الأحماض الدهنية من المضيف27،28. لمعالجة هذه الثغرات، قمنا بتطوير طريقة تحليل الدهون غير متحيزة لرصد دمج الأحماض الدهنية الخارجية من جزيئات البروتين الدهني في فوسفوليبيدات الغشاء من S. aureus.

أثناء الإنتان ، تمثل جزيئات البروتين الدهني المضيف مصدرا محتملا للأحماض الدهنية المشتقة من المضيف داخل الأوعية الدموية ، حيث ترتبط غالبية الأحماض الدهنية المضيفة بالجسيمات30. تتكون البروتينات الدهنية من قشرة مائية تتكون من الدهون الفوسفاتية والبروتينات التي تحيط بجوهر الكاره للماء من الدهون الثلاثية واسترات الكوليسترول31. يتم إنتاج أربع فئات رئيسية من البروتينات الدهنية - الهيلوميكرون، والبروتين الدهني منخفض الكثافة، والبروتين الدهني عالي الكثافة، والبروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) - من قبل المضيف وتعمل كمركبات نقل للدهون، وتقديم الأحماض الدهنية والكوليسترول من وإلى الخلايا المضيفة عبر الأوعية الدموية. LDLs وفيرة في الأحماض الدهنية استيريفيد بما في ذلك الدهون الثلاثية واسترات الكوليسترول31. لقد أثبتنا في السابق أن LDLs البشرية عالية النقاء هي مصدر قابل للحياة من الأحماض الدهنية الخارجية لتخليق PG، وبالتالي توفير آلية لمثبطات FASII الالتفافية32. يمكن أن يكون تنقية LDLs البشرية صعبة من الناحية الفنية وتستغرق وقتاً طويلاً في حين أن المصادر التجارية لـ LDLs البشرية النقية مكلفة للغاية للاستخدام على أساس روتيني أو لأداء شاشات بكتيرية واسعة النطاق. لمعالجة هذه القيود، قمنا بتعديل إجراء لإثراء LDLs من صفار البيض الدجاج، وهو مصدر غني من جزيئات البروتين الدهني33. لقد استخدمنا بنجاح غير مستهدفة، عالية الدقة / قياس الطيف الكتلي الدقيق والقياس الطيفي الكتلي جنبا إلى جنب لرصد دمج الأحماض الدهنية المستمدة من LDL الإنسان في غشاء S. aureus32. على عكس الأساليب التي تم الإبلاغ عنها سابقا، يمكن لهذا النهج تحديد أيزومرات الأحماض الدهنية الفردية لكل من أنواع فوسفوليبيد المكورات العنقودية الرئيسية الثلاثة. حمض الأوليك (18:1) هو حمض دهني غير مشبع موجود داخل جميع جزيئات البروتين الدهني المضيف التي يتم دمجها بسهولة في S. aureus phospholipids29،30،32. S. aureus ليست قادرة على توليف حمض الأوليك29; ولذلك، فإن كمية حمض الأوليك المدرجة فوسفوليبيد يثبت وجود الأحماض الدهنية المشتقة من البروتين الدهني المضيف داخل غشاء المكورات العنقودية29. ويمكن تحديد هذه الأنواع الفوسفاتية من خلال أحدث طريقة قياس الطيف الكتلي الموصوفة هنا، وتقدم دقة غير مسبوقة لتكوين غشاء S. aureus المستزرعة في وجود مصدر الأحماض الدهنية فمن المرجح المواجهات أثناء العدوى.

Protocol

ملاحظة: البروتوكول التالي لإثراء جزيئات LDL من صفار بيض الدجاج مشتق من موسى وآخرون 200233.

1. إعداد صفار البيض الدجاج لإثراء جزيئات LDL

  1. قم بتعقيم بيضتي دجاج كبيرتين عن طريق غسل الأصداف بمحلول الإيثانول بنسبة 70% والسماح بتجفيف الهواء.
  2. قم بتعقيم فاصل البيض باستخدام محلول الإيثانول بنسبة 70% والسماح بتجفيف الهواء. يُرفق فاصل البيض على شفة كوب متوسط الحجم.
  3. الكراك كل بيضة على حدة في فاصل البيض والسماح للألبومين لتدفق إلى الكأس. سيتم الاحتفاظ صفار البيض سليمة من قبل فاصل.
  4. اغسل صفار البيض مرتين مع 30 مل من محلول ملحي معقم بالفوسفات (PBS) لإزالة الزلال المتبقي.
  5. وضع صفار البيض بلطف على ورقة التصفية.
  6. ثقب غشاء vitelline مع طرف ماصة معقمة واستنزاف محتويات الغشاء في أنبوب الطرد المركزي مخروطي معقمة 50 مل. تجاهل الغشاء وورقة التصفية.

2. تجزئة البلازما التي تحتوي على LDL من صفار البيض الدجاج

  1. إضافة ما يقرب من مجلدين من 0.17 M NaCl في الحموضة 7.0 إلى صفار البيض وتخلط بقوة. ثم خلط هذا الحل في 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  2. طرد مركزي تخفيف صفار البيض في 10 درجة مئوية في 10،000 × ز لمدة 45 دقيقة.
  3. كرر الخطوة 2.2.

3. عزل جزيئات LDL من البلازما

  1. اخلط جزء البلازما مع كبريتات الأمونيوم 40% (ث/v) عند 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  2. ضبط الحموضة من كسر البلازما مع حل هيدروكسيد الصوديوم 420 MM إلى 8.7.
  3. طرد مركزي تخفيف صفار البيض في 4 درجة مئوية في 10،000 × ز لمدة 45 دقيقة. توفير غرفة في الأنابيب للسماح لها أن تنتفخ.
  4. Dialyze بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في 3 لتر من الماء النقي جدا لإزالة كبريتات الأمونيوم. تحريك الماء بلطف باستخدام شريط تحريك.
  5. نقل حل dialyzed في أنبوب الطرد المركزي مخروطي معقمة 50 مل.
  6. طرد مركزي الحل في 4 درجة مئوية في 10،000 × ز لمدة 45 دقيقة.

4. تقييم LDLs الدجاج كمصدر للأحماض الدهنية

  1. Subculture S. الخلايا الأوريوس في 5 مل من الأحماض الدهنية خالية 1٪ مرق التربتون وحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع هز (225 دورة في الدقيقة). للأوكسوتروفات الأحماض الدهنية, الثقافات الملحق مع مصدر من الأحماض الدهنية.
  2. تخفيف الثقافات بين عشية وضحاها إلى كثافة بصرية (OD) في 600 نانومتر (OD600)من 0.1 في 1٪ مرق التربتون. ماصة 50 درجة مئوية من تعليق الخلية في كل بئر من لوحة مستديرة القاع 96 جيدا.
    ملاحظة: عند العمل مع auxotrophs الأحماض الدهنية، وغسل الثقافات بين عشية وضحاها في مجلدين من مرق التربتون وإعادة تعليق في 5 مل من مرق التربتون للحد من ترحيل الأحماض الدهنية قبل تحديد OD للثقافة.
  3. بالنسبة للآبار التي تحتوي على عناصر تحكم غير معالجة، أضف 50 ميكرولتر من مرق التربتون بنسبة 1% لكل بئر.
  4. إلى الآبار التي تحتوي على تعليق الخلايا التجريبية، إضافة 50 درجة مئوية من مرق التربتون 1٪ تكملها 10٪ صفار البيض المستمدة LDL، 2 μM التريكلوسان، أو خليط من 10٪ صفار البيض المستمدة LDL و 2 μM تريكلوسان.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، كل بئر سوف تحتوي على 100 درجة مئوية والتركيز النهائي من صفار البيض المستمدة LDL وtriclosan لكل بئر سيكون 5٪ و 1 ميكرومتر، على التوالي.
  5. قياس OD600 مع مرور الوقت، وذلك باستخدام قارئ لوحة صغيرة تعيين في 37 درجة مئوية مع المستمر، والهز الخطي لمراقبة النمو.

5. حضانة S. aureus مع LDLs لتحليل الدهون الغشاء.

  1. ثقافة مستعمرة معزولة في 5 مل من الأحماض الدهنية خالية من مرق التربتون 1٪ وحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع هز (225 دورة في الدقيقة).
  2. تمييع الثقافات بين عشية وضحاها 1:100 في قارورة معقمة 250 مل حيرة تحتوي على 50 مل من مرق التربتون 1٪. حضانة إلى مرحلة منتصف السجل (حوالي 4 ح) في 37 درجة مئوية مع الهز.
  3. نقل 25 مل من الثقافة إلى أنبوب الطرد المركزي معقمة 50 مل وبيليه الخلايا. إزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في 750 درجة مئوية من مرق التربتون 1٪.
  4. الجمع بين الخلايا المعلقة وaliquot 300 درجة مئوية من تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل معقمة.
  5. إضافة LDLs إلى التركيز النهائي المطلوب وحضانة في 37 درجة مئوية مع هز (225 دورة في الدقيقة) لمدة 4 ساعة.
  6. طرد مركزي الثقافات في 4 درجة مئوية في 16،000 × ز لمدة 2 دقيقة وغسل الكريات الخلية في مجلدين من PBS معقمة ثم كرر.
  7. تسجيل وزن كل بيليه الخلية الرطبة. قم بتجميد كريات الخلايا على الجليد الجاف أو في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية أو انتقل مباشرة إلى القسم 6.

6. استخراج الدهون غشاء الأوروس S.

  1. وضع الكريات الخلية المجمدة S. aureus على الجليد الجاف. إضافة حبات أكسيد الزركونيوم 0.5 ملم على رأس كل بيليه الخلية، وذلك باستخدام حجم من الخرز يساوي تقريبا حجم بيليه الخلية.
    ملاحظة: كبديل لهذه الطريقة لاستخراج الدهون، يمكن للباحثين استخدام أساليب Bligh وDyer أو Folch راسخة لتشفير الدهون من الخلايا البكتيرية34.
  2. إضافة 740 درجة مئوية من الميثانول 75٪ (HPLC الصف) المبردة إلى -80 درجة مئوية مباشرة إلى الكريات الخلية.
  3. إضافة 2 درجة مئوية من 50 μM ديميريستيل فوسفاتيديلكولين (أعدت في الميثانول) لكل 1 ملغ من الخلايا كمعيار داخلي. أغلق أنبوب الاختبار وضع أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل التي تحتوي على كل عينة في منفذ متاح في المجانسة الأنسجة خلاط رصاصة. تجانس العينات على سرعة منخفضة، ووضع 2-3، لمدة 3 دقائق.
  4. فحص بصريا العينات للتجانس. إذا كانت كتل من الخلايا مرئية، استمر في التجانس في خلاط رصاصة في زيادات 2 دقيقة.
  5. إزالة العينات من خلاط رصاصة ونقلها إلى غطاء الدخان الكيميائية.
  6. إضافة 270 درجة مئوية من الكلوروفورم إلى كل أنبوب عينة. دوامة العينات بقوة لمدة 30 دقيقة.
    تحذير: الكلوروفورم مسرطن محتمل.
  7. الطرد المركزي العينات في جهاز طرد مركزي على سطح الظهر لمدة تصل إلى 30 دقيقة في الحد الأدنى 2000 × ز. ويمكن استخدام سرعات أسرع مع أنابيب الطرد المركزي المتوافقة ويمكن تقصير مدة الطرد المركزي إلى 10 دقائق.
  8. في غطاء الدخان الكيميائي، وجمع supernatant أحادية الطور ونقل إلى أنبوب اختبار جديد، في حين تجنب بعناية بيليه البروتين في الجزء السفلي من أنبوب استخراج.
  9. إضافة 740 درجة مئوية من الميثانول 75٪ (HPLC الصف) و 270 درجة مئوية من الكلوروفورم إلى بيليه البروتين، وإعادة استخراج كل عينة على النحو المبين في الخطوات 6.6-6.8 أعلاه. الجمع بين supernatant من استخراج الثاني مع supernatant التي تم جمعها سابقا لكل عينة.
  10. تبخر المذيبات استخراج تحت تيار من الغاز الخامل مثل النيتروجين أو الأرجون، أوتحت فراغ باستخدام مركز الطرد المركزي (جدول المواد).
  11. غسل مقتطفات الدهون المجففة ثلاث مرات مع 1.0 مل من محلول بيكربونات الأمونيوم 10 مم وإعادة تجفيف العينات كما هو الحال في الخطوة 6.10.
  12. إعادة تعليق مقتطفات الدهون المجففة في مذيب غير القطبية مناسبة مثل إيزوبروبانول. إعادة تعليق العينات باستخدام 20 ميكرولتر لكل 1 ملغ من وزن الخلية الطازجة المحددة في الخطوة 5.7 بدلاً من ذلك، إذا كان وزن الكريات الخلية غير معروف، إعادة تعليق العينات في 200 درجة مئوية من isopropanol والمضي قدماإلى القسم 7.

7. تحليل ملامح الدهون S. aureus باستخدام دقة عالية / قياس الطيف الكتلي الدقيق

  1. قبل إجراء تحليل كامل للدهون، حدد عينات اختبار تمثيلية من المجموعة (المجموعات) التجريبية وحللها على مجموعة من عوامل تخفيف العينات لتحديد نطاقات تخفيف العينات التي تقع فيها تركيزات الدهون الإجمالية ضمن التركيزات الخطية مجموعة من استجابة كاشف لمطياف الكتلة، كما سبق وصفه35.
  2. يتبخر aliquots من كل عينة استخراج الدهون أن تخضع لتحليل الدهون، عن طريق تجفيف aliquots تحتالغاز الخامل أو تحت فراغ في مركز الطرد المركزي (جدول المواد).
  3. إعادة تعليق كل مستخلص للدهون المجففة في قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS) من الإيزوبروبانول: الميثانول (2:1، v:v) الذي يحتوي على 20 مليون متر من فورمات الأمونيوم، وذلك باستخدام كميات تعادل عامل تخفيف العينة الأمثل على النحو المحدد في الخطوة 7-1.
  4. لتحليل الدهون غير المستهدفة، يمكن إدخال العينات مباشرة إلى منصة قياس الطيف الكتلي عالية الدقة / دقيقة دون استخدام الكروماتوغرافيا عن طريق حقن التدفق أو التسريب المباشر للمستخلصات35و36. نقل مقتطفات الدهون المخففة المعدة في الخطوة 7.3 إلى قارورة autosampler المناسبة أو لوحة 96 جيدا.
  5. للتحليل القائم على حقن التدفق، ضع قارورة العينات التلقائية في عينة تلقائية (15 درجة مئوية) يتم التحكم فيها بدرجة الحرارة لنظامHPLC قادر على تطبيقات الشعيرات الدموية/التدفق المنخفض، مثل HPLC (جدول المواد) المجهزبة بتدفق إلكتروني نظام مراقبة التناسب والتدفق.
  6. ملء خزانات المذيبات HPLC مع LC-MS الصف isopropanol: الميثانول (2:1، v:v) التي تحتوي على 20 MM فورميوم الأمونيوم.
  7. باستخدام برنامج Agilent Chemstation، برنامج HPLC autosampler لإجراء حقن عينة 5 ميكرولتر. من القائمة أداة، حدد إعداد حاقن، واكتب 5.0 في حقل حجم حجم الحقن. وتعطى الوحدات كميكرولتر. تأكد من أن HPLC يتم تعيين إلى تدفق isocratic في 1 ميكرولتر في الدقيقة من 2:1 (V:v) isopropanol: الميثانول التي تحتوي على 20 MM فورمات الأمونيوم.
  8. من القائمة أداة Chemstation، حدد إعداد مضخة...
  9. في حقول الجدول الزمني، أدخل: الوقت 0.00، 100٪ B، تدفق 1.0. ضرب أدخل وإنشاء صف ثان في الجدول الزمني عن طريق إدخال الوقت 10.0، 100٪ B، تدفق 1.0. حدد الزر موافق في أسفل قائمة إعداد المضخة. هذه الإعدادات سوف تمكن 10 تشغيل التحليلية بمعدل تدفق 1.0 درجة مئوية في الدقيقة الواحدة.
  10. إدخال eluate من خط نقل HPLC إلى مطياف الكتلة باستخدام مصدر التأين الكهربائي مزودة بإبرة معدنية منخفضة التدفق (34 G).
  11. باستخدام برنامج التحكم في الآلات الحرارية Tune Plus، حدد قائمة الإعداد وحدد مصدر ESI المدفأ. تعيين الجهد التأين إلى 4000 V وغاز غمد إلى 5 (وحدات التعسفي) عن طريق كتابة هذه القيم في المجالات المقابلة من مربع الحوار. وبالمثل، تعيين درجة الحرارة الشعرية إلى 150 درجة مئوية وعدسة S إلى 50٪.
    ملاحظة: هذه القيم تحتاج إلى تحسين لكل منصة قياس الطيف الكتلي.
  12. لتحليل الدهون غير المستهدفة، استخدم منصة عاليةالدقة / دقيقة كتلة MS (جدول المواد) ككاشف.
  13. باستخدام برنامج Thermo Tune Plus، انقر فوق الزر تعريف المسح الضوئي، وفي قائمة محلل حدد FTMS. قم بتعيين حقل النطاق الكتلي إلى عادي وفي الحقل "دقة" حدد 100,000. تأكد من تعيين نوع المسح الضوئي إلى كامل. ضمن القائمة نطاقات المسح الضوئي، أدخل 200 في حقل الكتلة الأولى (م/ض)، وأدخل عام 2000 في الحقل الكتلة الأخيرة (م/ض).
  14. تأكد من استخدام القطبية السلبية للكشف عن الدهون S. aureus الأكثر وفرة.
  15. كرر تحليل العينة باستخدام رسم خرائط أيون جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (MS/MS) تجزئة جميع أيونات الدهون داخل منطقة الطيفية ذات الأهمية من أجل تأكيد هياكل الدهون ومكونات الأحماض الدهنية. وبدلاً من ذلك، قد تخضع أيونات الدهون المختارة ذات الأهمية لتحليل التصلب المتعدد/التصلب المتعدد بعد تحديد العوامل الأولية للدهون في القسم 8.

8. قاعدة بيانات البحث لتحديد S. aureus الذاتية والدهون الخارجية المستمدة من LDL

  1. استخدام برنامج Thermo Xcalibur لزيادة صقل دقة الكتلة الملاحظة. في Xcalibur، ضمن القائمة أدوات، حدد إعادة معايرة دون اتصال. بعد فتح إطار إعادة المعايرة دون اتصال، قم بتحميل ملف الطيف الكتلي لإعادة تقويمه عن طريق تحديد قائمة الملف وتحديد الخيار فتح.
  2. افتح ملف الفائدة، قم بتبديل الزر إدراج صف في أعلى إطار العرض، لعرض مخطط الألوان أيون الكلي لتشغيل MS. متوسط إشارات التصلب المتعدد المكتسبة عن طريق النقر بزر الماوس الأيسر على حافة واحدة من ذروة الإشارة الملاحظة في مجموع اللوني أيون وسحب الماوس عبر الجزء الأوسع من الذروة.
  3. ضمن القائمة تصفية المسح الضوئي، حدد عامل التصفية المطابق لبيانات MS المسح الضوئي الكامل. تحميل ملف مرجعي يحتوي على كتل أحادية الاضوجي النظرية من ثلاثة على الأقل من الدهون الذاتية المعروفة S. aureus عن طريق تحديد الزر تحميل المرجع ... حدد المربع استخدام بجوار كل كتلة أحادية النظائر الدهون.
  4. انقر فوق الزر بحث في أسفل إطار العرض. إعادة متوسط إشارة MS عبر ذروة الإشارة في مجموع الكروماتوغرام أيون كما فعلت سابقا.
  5. انقر فوق الزر تحويل بالقرب من أسفل إطار العرض. عند فتح مربع الحوار تحويل، انقر فوق موافق. حذف هذه الخطوة إذا تم جمع البيانات على منصات قياس الطيف الكتلي من البائعين غير الحرارية العلمية.
  6. باستخدام برنامج Xcalibur، قم بتصدير قوائم الذروة الجماهيرية الدقيقة المعاد معالجتها لكل عينة غير معالجة أو معالجة LDL إلى أوراق عمل منفصلة لملف Excel. حدد رمز متصفح Qual. افتح ملف الفائدة المعاد معايرة عن طريق تحديد القائمة ملف وتحديد الخيار فتح...
  7. متوسط الإشارة عبر الذروة العريضة في مجموع الكروماتوغرام الأيونكما هو موضح في الخطوة 8.2.
  8. انقر بزر الماوس الأيمن فوق رمز thumbtack في نافذة عرض الطيف الشامل وحدد عرض | قائمة الطيف. من نفس القائمة، حدد خيارات العرض ثم مربع تبديل كافة القمم في القائمة عرض. انقر فوق الزر موافق لإغلاق إطار العرض.
  9. انقر بزر الماوس الأيمن فوق رمز thumbtack في نافذة عرض الطيف الكتلي مرة أخرى وحدد تصدير | الحافظة (الكتلة الدقيقة). قم بلصق خلية البيانات المصدرة A1 من ورقة العمل الأولى في جدول بيانات Excel جديد.
  10. حذف الصفوف الثمانية الأولى من النص في ملف البيانات التي تم تصديرها، بحيث تحتوي الخلية A1 من جدول بيانات Excel على نقطة البيانات الجماعية الأولى من الطيف الكتلي. كرر تصدير كل ملف MS المعاد معايرة باستخدام ورقة عمل جديدة في ملف Excel لكل قائمة الذروة التي تم تصديرها.
  11. باستخدام برنامج التحليل الطيفي الشامل للدهون (LIMSA)37 الوظيفة الإضافية لـ Excel، قم بإنشاء قاعدة بيانات تحتوي على صيغ جزيئية لأنواع الدهون المعروفة S. aureus كما هو موضح من قبل Hewelt-Belka et al. الصيغ التي تمثل الأنواع الدهنية التي يمكن أن تكون موجودة افتراضيا في LDL.
    ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك، ينبغي الحرص على إدراج الصيغ الجزيئية المحتملة في قاعدة البيانات للدهون البكتيرية الافتراضية التي أدرجت الأحماض الدهنية LDL الرئيسية، مثل الأوليك (18:1) واللينوليك (18:2) الأحماض الدهنية32.
  12. لإنشاء قاعدة البيانات، افتح جدول بيانات Excel فارغ. في الخلية A1 من ورقة العمل الأولى، اكتب الكتلة التوحيدية النظرية/المحسوبة من أنواع الدهون التي سيتم إضافتها إلى قاعدة البيانات، المقابلة لكتلة أنواع الدهون في الحالة الأيونية التي لوحظت في مطياف الكتلة. في الخلية B1، أدخل اسمًا لأنواع الدهون، مثل PG(34:0).
  13. في الخلية C1، أدخل الصيغة الجزيئية لأنواع الدهون، المقابلة للحالة الأيونية للدهون التي لوحظت في مطياف الكتلة. في الخلية D1، أدخل تهمة الأنواع الدهنية كما لوحظ في مطياف الكتلة. الانتقال إلى الخلية A2 لبدء إدخال جديد لأنواع الدهون التالية التي سيتم إدخالها في قاعدة البيانات القابلة للبحث.
  14. كرر الخطوتين 8.12 و8.13 حتى يتم إدخال كافة أنواع الدهون المطلوبة في قاعدة البيانات. حفظ ملف قاعدة البيانات وتركه مفتوحا في إكسيل.
  15. في Excel، حدد القائمة الوظائف الإضافية في. حدد LIMSA لبدء تشغيل برنامج LIMSA. من القائمة الرئيسية، انقر فوق الزر مكتبة مجمع... في الإطار الجديد الذي يظهر، انقر فوق استيراد المركبات. سيؤدي ذلك إلى تحميل قاعدة البيانات المركبة لاستخدامها من قبل برنامج LIMSA.
  16. إجراء تحديد الدهون على أساس كتلة دقيقة على جميع أطياف MS باستخدام برنامج LIMSA الوظيفة الإضافية لإكسيل وفقا لتعليمات البائع35. من القائمة الرئيسية LIMSA، حدد قائمة الذروة ضمن قائمة نوع الطيف. حدد الوضع الإيجابي أو الوضع السالب لتتوافق مع القطبية التي تم الحصول على بيانات MS.
  17. في نافذة Peak fwhm (m/z)، أدخل إطار البحث الجماعي المطلوب للحصول على نتيجة الذروة. يوصى بإطار بحث عن التسامح الجماعي من 0.003-0.005 م/ض للحصول على بيانات عالية الدقة/دقيقة عن كتلة MS.
  18. في إطار الحساسية، أدخل قطع الأساس المطلوب (على سبيل المثال، 0.01% وفرة نسبية). في قائمة تصحيح النظائر، حدد الملاءمة الخطية أو خوارزميات الطرح، والتي يمكن استخدام هاذا الخوارزمية مع بيانات قائمة الذروة.
  19. تسليط الضوء على مركبات الدهون لإدراجها في البحث قاعدة البيانات عن طريق النقر على الأنواع الدهون المطلوبة داخل نافذة المركبات المتاحة. انقر فوق الزر إضافة لإضافة أنواع الدهون المميزة إلى مجموعة البحث.
  20. تحديد المعايير الداخلية عن طريق النقر على المركبات المضافة، ثم تغيير نافذة التركيز إلى التركيز المقابل للمعيار الداخلي المحدد.
  21. تأكد من أن المعيار الداخلي وأنواع الدهون المختارة التي سيتم تحديدها تنتمي إلى نفس اسم الفئة عن طريق اختيار كل أنواع الدهون المضافة والمعايير الداخلية وكتابة اسم فئة (مثل PG أو Lipid) في حقل الفئة.
  22. لحفظ مجموعة مركبات الدهون القابلة للبحث لاستخدامها في المستقبل، انقر فوق الزر حفظ بجوار قائمة المجموعات.
  23. تأكد من أن ملف Excel الذي يحتوي على كافة قوائم ذروة MS المصدرة مفتوح على الورقة المقابلة لتشغيل MS S. aureus الأول ثم انقر فوق الزر بحث من القائمة الرئيسية LIMSA.
    ملاحظة: سيتضمن ناتج البحث في قاعدة بيانات LIMSA قائمة بالسمات الطيفية الكتلية المتطابقة مع الدهون الموجودة في قاعدة البيانات الموجودة في الخطوات 8-12-8.13، فضلاً عن التركيزات لكل سمة متطابقة بعد التطبيع إلى واحد أو أكثر من السمات المختارة المعايير الداخلية.
  24. استخدام برنامج Xcalibur لفحص كتلة دقيقة MS / MS الأطياف لm / z المقابلة لأيونات الدهون ذات الأهمية من أجل تأكيد مكونات الأحماض الدهنية الموجودة في كل الأنواع الجزيئية الدهون المحددة. حدد رمز متصفح Qual. افتح ملف MS/MS ذو الفائدة عن طريق تحديد القائمة المنسدلة ملف وتحديد الخيار فتح...
  25. حدد مرشح المسح الضوئي المقابل لتحليل MS/MS للدهون m/z ذات الأهمية عن طريق النقر بالماوس الأيمن على رمز thumbtack في نافذة عرض الطيف الكتلي وحدد نطاقات من القائمة. في الإطار الجديد الذي يظهر، حدد القائمة تصفية لتحديد الفحص.
  26. متوسط الإشارة عبر مجموع اللوني أيون كما هو موضح في الخطوة 8.2. استخدم برنامج MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca) لإجراء الاختبارات الإحصائية المناسبة. تقييم الفرق الكبير إحصائيا في تكوين الدهون S. aureus عن طريق مقارنة وفرة الدهون الطبيعية عبر الظروف غير المعالجة وLDL المعالجة.

النتائج

ويتضح بروتوكول إثراء LDL من صفار البيض الدجاج في الشكل 1. تبدأ هذه العملية بتخفيف صفار البيض الكامل مع المالحة وفصل المواد الصلبة صفار البيض المشار إليها كحبيبات منالكسر القابل للذوبان أو البلازما التي تحتوي على LDLs (الشكل 1)33. ي?...

Discussion

S. aureus يدمج الأحماض الدهنية الخارجية في الدهون الفوسفاتية غشاء27،32،43. تركيب فوسفوليبيد باستخدام الأحماض الدهنية الخارجية يتجاوز تثبيط FASII ولكن أيضا يغير الخصائص البيوفيزيائية للغشاء27،32،

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ أي كشف.

Acknowledgements

نشكر أعضاء مختبر هامر على تقييمهم النقدي للمخطوطة ودعمهم لهذا العمل. الدكتور أليكس هورسويل من كلية الطب بجامعة كولورادو يرجى تقديم AH1263. قدم الدكتور كريس ووترز مختبر في جامعة ولاية ميشيغان الكواشف. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية منحة 16SDG30170026 والأموال الناشئة التي تقدمها جامعة ولاية ميشيغان.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium sulfateFisherBP212R-1≥99.5% pure
Cell culture incubatorThermoMaxQ 6000
CentrafugeThermo75-217-420Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE
Costar assay plateCorning378896 well
Filter paperSchleicher & Schuell597
Large chicken eggN/AN/ACommon store bought egg
Microplate spectrophotometerBioTekEpoch 2
NaClSigmaS9625
S. aureus strain AH1263N/AN/AProvided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubingPierce687007,000 MWCO
TryptoneBecton, Dickison and Company211705
0.5 mm zirconium oxide beadsNext AdvanceZROB05
Bullet BlenderNext AdvanceBBX24B
Methanol (LC-MS grade)FisherA4561
Chloroform (reagent grade)FisherMCX10559
Isopropanol (LC-MS grade)FisherA4611
Dimyristoyl phosphatidylcholineAvanti Polar Lipids850345C-25mg
Ammonium bicarbonateSigma9830≥99.5% pure
Ammonium formateSigma70221-25G-F
Xcalibur softwareThermo ScientificOPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometerThermo Scientifichigh resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLCAgilent
SpeedVac Vacuum ConcentratorsThermo Scientific

References

  1. Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
  2. Noskin, G. A., et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Archives of Internal Medicine. 165 (15), 1756-1761 (2005).
  3. Laible, B. R. Antimicrobial resistance: CDC releases report prioritizing current threats. South Dakota medicine. 67 (1), 30-31 (2014).
  4. Zhang, Y. M., Rock, C. O. Membrane lipid homeostasis in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 222-233 (2008).
  5. Zhang, Y. M., White, S. W., Rock, C. O. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 281 (26), 17541-17544 (2006).
  6. Sohlenkamp, C., Geiger, O. Bacterial membrane lipids: diversity in structures and pathways. FEMS Microbiology Reviews. 40 (1), 133-159 (2016).
  7. Schiebel, J., et al. Staphylococcus aureus FabI: inhibition, substrate recognition, and potential implications for in vivo essentiality. Structure. 20 (5), 802-813 (2012).
  8. Heath, R. J., Li, J., Roland, G. E., Rock, C. O. Inhibition of the Staphylococcus aureus NADPH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase by triclosan and hexachlorophene. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4654-4659 (2000).
  9. Heath, R. J., Yu, Y. T., Shapiro, M. A., Olson, E., Rock, C. O. Broad spectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30316-30320 (1998).
  10. Park, H. S., et al. Antistaphylococcal activities of CG400549, a new bacterial enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (3), 568-574 (2007).
  11. Schiebel, J., et al. Rational design of broad spectrum antibacterial activity based on a clinically relevant enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 289 (23), 15987-16005 (2014).
  12. Yum, J. H., et al. In vitro activities of CG400549, a novel FabI inhibitor, against recently isolated clinical staphylococcal strains in Korea. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (7), 2591-2593 (2007).
  13. Kaplan, N., et al. Mode of action, in vitro activity, and in vivo efficacy of AFN-1252, a selective antistaphylococcal FabI inhibitor. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (11), 5865-5874 (2012).
  14. Karlowsky, J. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Hoban, D. J., Zhanel, G. G. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a Staphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (8), 3544-3548 (2009).
  15. Ross, J. E., Flamm, R. K., Jones, R. N. Initial broth microdilution quality control guidelines for Debio 1452, a FabI inhibitor antimicrobial agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (11), 7151-7152 (2015).
  16. Hunt, T., Kaplan, N., Hafkin, B. Safety, tolerability and pharmacokinetics of multiple oral doses of AFN-1252 administered as immediate release (IR) tablets in healthy subjects. Journal of Chemotherapy. 28 (3), 164-171 (2016).
  17. Hafkin, B., Kaplan, N., Hunt, T. L. Safety, tolerability and pharmacokinetics of AFN-1252 administered as immediate release tablets in healthy subjects. Future Microbiology. 10 (11), 1805-1813 (2015).
  18. Flamm, R. K., Rhomberg, P. R., Kaplan, N., Jones, R. N., Farrell, D. J. Activity of Debio1452, a FabI inhibitor with potent activity against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp., including multidrug-resistant strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (5), 2583-2587 (2015).
  19. Yao, J., Maxwell, J. B., Rock, C. O. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in Staphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). Journal of Biological Chemistry. 288 (51), 36261-36271 (2013).
  20. Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Forrest, A., Ngo, D. Activity of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, against Staphylococcus aureus in an in vitro pharmacodynamic model simulating human pharmacokinetics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 32-35 (2013).
  21. Parsons, J. B., et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the enoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (5), 2182-2190 (2013).
  22. Kaplan, N., et al. In vitro activity (MICs and rate of kill) of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, in the presence of serum and in combination with other antibiotics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 18-25 (2013).
  23. Kaplan, N., Garner, C., Hafkin, B. AFN-1252 in vitro absorption studies and pharmacokinetics following microdosing in healthy subjects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (3-4), 440-446 (2013).
  24. Banevicius, M. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Nicolau, D. P. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and efficacy of novel FabI inhibitor AFN-1252 against MSSA and MRSA in the murine thigh infection model. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 26-31 (2013).
  25. Karlowsky, J. A., et al. In vitro activity of API-1252, a novel FabI inhibitor, against clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (4), 1580-1581 (2007).
  26. Yao, J., et al. A Pathogen-Selective Antibiotic Minimizes Disturbance to the Microbiome. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (7), 4264-4273 (2016).
  27. Brinster, S., et al. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram-positive pathogens. Nature. 458 (7234), 83-86 (2009).
  28. Balemans, W., et al. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature. 463 (7279), E3-E4 (2010).
  29. Parsons, J. B., Frank, M. W., Subramanian, C., Saenkham, P., Rock, C. O. Metabolic basis for the differential susceptibility of Gram-positive pathogens to fatty acid synthesis inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15378-15383 (2011).
  30. Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), e0116195 (2015).
  31. Feingold, K. R., Grunfeld, C. Introduction to Lipids and Lipoproteins. Endotext. , (2000).
  32. Delekta, P. C., Shook, J. C., Lydic, T. A., Mulks, M. H., Hammer, N. D. Staphylococcus aureus utilizes host-derived lipoprotein particles as sources of exogenous fatty acids. Journal of Bacteriology. 200 (11), (2018).
  33. Moussa, M., Marinet, V., Trimeche, A., Tainturier, D., Anton, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. 57 (6), 1695-1706 (2002).
  34. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. Bligh and Dyer and Folch Methods for Solid-Liquid-Liquid Extraction of Lipids from Microorganisms. Comprehension of Solvatation Mechanisms and towards Substitution with Alternative Solvents. International journal of molecular sciences. 18 (4), (2017).
  35. Lydic, T. A., Busik, J. V., Reid, G. E. A monophasic extraction strategy for the simultaneous lipidome analysis of polar and nonpolar retina lipids. Journal of Lipid Research. 55 (8), 1797-1809 (2014).
  36. Bowden, J. A., Bangma, J. T., Kucklick, J. R. Development of an automated multi-injection shotgun lipidomics approach using a triple quadrupole mass spectrometer. Lipids. 49 (6), 609-619 (2014).
  37. Haimi, P., Uphoff, A., Hermansson, M., Somerharju, P. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Analytical Chemistry. 78 (24), 8324-8331 (2006).
  38. Hewelt-Belka, W., et al. Comprehensive methodology for Staphylococcus aureus lipidomics by liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1362, 62-74 (2014).
  39. Jolivet, P., Boulard, C., Beaumal, V., Chardot, T., Anton, M. Protein components of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (12), 4424-4429 (2006).
  40. Bylesjö, M., et al. OPLS discriminant analysis: combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification. Journal of Chemometrics. 20 (8-10), 341-351 (2006).
  41. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Progress in Lipid Research. 29 (2), 107-140 (1990).
  42. Cherian, G., Holsonbake, T. B., Goeger, M. P. Fatty acid composition and egg components of specialty eggs. Poultry Science. 81 (1), 30-33 (2002).
  43. Parsons, J. B., Frank, M. W., Rosch, J. W., Rock, C. O. Staphylococcus aureus Fatty Acid Auxotrophs Do Not Proliferate in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (11), 5729-5732 (2013).
  44. Sen, S., et al. Growth-Environment Dependent Modulation of Staphylococcus aureus Branched-Chain to Straight-Chain Fatty Acid Ratio and Incorporation of Unsaturated Fatty Acids. PLoS One. 11 (10), e0165300 (2016).
  45. Wang, M., Huang, Y., Han, X. Accurate mass searching of individual lipid species candidates from high-resolution mass spectra for shotgun lipidomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28 (20), 2201-2210 (2014).
  46. Peti, A. P. F., Locachevic, G. A., Prado, M. K. B., de Moraes, L. A. B., Faccioli, L. H. High-resolution multiple reaction monitoring method for quantification of steroidal hormones in plasma. Journal of Mass Spectrometry. 53 (5), 423-431 (2018).
  47. Neves, M. M., Heneine, L. G. D., Henry, M. Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 66 (3), 769-777 (2014).
  48. Liu, P. V., Hsieh, H. C. Inhibition of Protease Production of Various Bacteria by Ammonium Salts - Its Effect on Toxin Production and Virulence. Journal of Bacteriology. 99 (2), 406 (1969).
  49. Suller, M. T., Russell, A. D. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 46 (1), 11-18 (2000).
  50. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved