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摘要

该方法为研究将来自复杂宿主来源的外源脂肪酸结合到细菌膜中提供了一个框架,特别是金黄色葡萄球菌。为此,介绍了从鸡蛋蛋黄中浓缩脂蛋白颗粒的方案,以及利用质谱法对细菌磷脂进行随后脂肪酸分析的介绍。

摘要

金黄色葡萄球菌和其他革兰氏阳性病原体将环境中的脂肪酸结合到膜磷脂中。在感染期间,大多数外源脂肪酸存在于宿主脂蛋白颗粒中。宿主脂肪酸的储存库以及细菌从脂蛋白颗粒中提取脂肪酸的机制仍存在不确定性。在这项工作中,我们描述了从鸡蛋蛋黄中浓缩低密度脂蛋白(LDL)颗粒的协议,并确定LD是否作为S.aureus的脂肪酸储存库。该方法利用无偏脂质学分析和鸡低密度脂蛋白,是探索低密度脂蛋白与细菌相互作用的有效经济模型。采用高分辨率/精确质谱法和串联质谱法对低密度脂蛋白中外源脂肪酸的S.氨基酸整合进行分析,从而对细菌的脂肪酸成分进行表征膜和无偏的鉴定在接触低密度脂蛋白时在细菌膜脂质中产生的脂肪酸的新组合。这些先进的质谱技术通过揭示并入磷脂中的特定外源脂肪酸,为脂肪酸的加入提供了无与伦比的视角。此处概述的方法适用于其他细菌病原体和复杂脂肪酸的替代来源的研究。

引言

耐甲氧西林(MRSA)是卫生保健相关感染的主要原因,相关的抗生素耐药性是一个相当大的临床挑战1,2,3。因此,制定新的治疗策略是重中之重。革兰氏阳性病原体的一个有前途的治疗策略是抑制脂肪酸合成,这是膜磷脂生产的要求,在S.aureus中,包括磷脂甘油(PG)、裂解-PG和心肌利平4。在细菌中,脂肪酸的产生通过脂肪酸合成II途径(FASII)5发生,这与真核对应物有很大不同,使得FASII成为抗生素开发5,6个有吸引力的靶点。.FASII抑制剂主要针对FabI,这是脂肪酸碳链伸长化所需的一种酶。FabI抑制剂三氯生被广泛用于消费品和医疗用品8,9。几家制药公司正在开发额外的FabI抑制剂,用于治疗10、11、12、13、14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26.然而,许多革兰氏阳性病原体,包括S.aureus,能够清除外源脂肪酸的磷脂合成,绕过FASII抑制27,28,29。因此,FASII抑制剂的临床潜力是辩论的,因为我们对宿主脂肪酸的来源和病原体从宿主27、28中提取脂肪酸的机制的认识存在相当大的差距。为了弥补这些差距,我们开发了一种无偏脂质学分析方法,以监测脂蛋白颗粒中外源脂肪酸与S.aureus膜磷脂的合并情况。

在败血症期间,宿主脂蛋白颗粒是血管内宿主衍生脂肪酸的潜在来源,因为大多数宿主脂肪酸都与颗粒30相关。脂蛋白由亲水外壳组成,由磷脂和蛋白质组成,这些蛋白质包裹着甘油三酯和胆固醇酯的疏水性核心31。四大类脂蛋白 - 奇洛美亚、极低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白 (LDL) - 由宿主生产,并充当脂质运输工具,提供脂肪酸和胆固醇。通过血管的宿主细胞。低密度脂蛋白富含酯化脂肪酸,包括甘油三酯和胆固醇酯31。我们之前已经证明,高度纯化的人类低密度脂蛋白是PG合成的外源脂肪酸的可行来源,从而为FASII抑制剂旁路32提供了机制。纯化人体低密度脂蛋白在技术上可能具有挑战性且耗时,而纯化人类低密度脂蛋白的商业来源在日常使用或进行大规模细菌筛选时成本高昂。为了解决这些限制,我们修改了从鸡蛋蛋黄中浓缩低密度脂蛋白的程序,鸡蛋蛋黄是脂蛋白颗粒33的丰富来源。我们已经成功地使用非目标,高分辨率/准确的质谱和串联质谱监测将人类LDL衍生脂肪酸结合到S.aureus32膜中。与先前报告的方法不同,这种方法可以量化三种主要葡萄球菌磷脂类型的单个脂肪酸异构体。油酸(18:1)是存在于所有宿主脂蛋白颗粒中的不饱和脂肪酸,很容易并入S.aureus磷脂29,30,32。金黄色葡萄球菌不能合成油酸29;因此,磷脂结合的油酸的数量建立在葡萄球菌膜29中存在宿主脂蛋白衍生脂肪酸。这些磷脂物种可以通过这里描述的最先进的质谱法来识别,在脂肪酸来源存在的情况下,为培养的S.aureus的膜组成提供了前所未有的分辨率。感染期间遭遇。

研究方案

注:以下从鸡蛋蛋黄中浓缩低密度脂蛋白颗粒的协议来自穆萨等人2002年33。

1. 制备鸡蛋黄以浓缩低密度脂蛋白颗粒

  1. 用70%乙醇溶液清洗壳,使两个大鸡蛋消毒,并晾干。
  2. 使用 70% 乙醇溶液对鸡蛋分离器进行消毒,并允许空气干燥。将鸡蛋分离器连接到中型烧杯的唇上。
  3. 将每个鸡蛋分别裂入鸡蛋分离器中,让白蛋白流入烧杯。完整的蛋黄将由分离器保留。
  4. 用30 mL的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗两次蛋黄,以去除残留的白蛋白。
  5. 轻轻地将蛋黄放在滤纸上。
  6. 用无菌移液器尖端刺穿玻璃膜,将膜内内容物排入无菌 50 mL 锥形离心管中。丢弃膜和滤纸。

2. 含低密度脂蛋白血浆从鸡蛋蛋黄中分馏

  1. 在pH 7.0时,将大约两卷0.17 M NaCl加入蛋黄,并大力混合。然后在4°C下混合此溶液60分钟。
  2. 在10°C下将蛋黄稀释在10°C下,在10,000 x g下,45分钟。将微粒状分数(颗粒)中的血浆分数(上清)去除至无菌的50 mL锥形管中。
  3. 重复步骤 2.2。

3. 从等离子体中分离低密度脂蛋白颗粒

  1. 在 4°C 下将等离子体馏分与 40% 硫酸铵 (w/v) 混合 60 分钟。
  2. 使用 420 mM NaOH 溶液将等离子馏分的 pH 值调整为 8.7。
  3. 在4°C下将蛋黄稀释在10,000 x g下,持续45分钟。将上半固体黄分,去除到7 kDa孔径透析管中。在管道中留出空间,使其膨胀。
  4. 在4°C的超纯水中过夜,去除硫酸铵。使用搅拌棒轻轻搅拌水。
  5. 将透析溶液转移到无菌的 50 mL 锥形离心管中。
  6. 在4°C下将溶液在10,000 x g下离心,持续45分钟。小心地将上半固体黄分液去除无菌管,并储存在4°C。

4. 评估鸡肉低密度脂蛋白作为脂肪酸的来源

  1. 亚培养S. aureus细胞进入 5 mL 的无脂肪酸 1% 胰子狼汤,并在 37°C 下孵育过夜,摇动(225 rpm)。对于脂肪酸辅助营养剂,补充培养物与脂肪酸的来源。
  2. 稀释过夜培养物至600nm(OD600)的光学密度(OD),为0.1%,1%的胰锥体汤。将50μL的细胞悬浮液放入圆底96孔板的每个孔中。
    注:使用脂肪酸辅助营养剂时,在确定培养物的OD之前,将过夜培养物洗在两卷胰腺汤中,重新悬浮在5 mL的胰蛋白石汤中,以限制脂肪酸的结转。
  3. 对于含有未经处理的对照井,每口加50μL的1%的胰锥体汤。
  4. 在含有实验细胞悬浮液的孔中,加入50μL的1%的胰蛋白石汤,辅以10%蛋黄衍生LDL、2μM三氯生或10%蛋黄衍生LDL和2μM三氯生混合物。
    注:此时,每口井将包含100μL,每口蛋黄衍生LDL和三氯生的最终浓度分别为5%和1μM。
  5. 随着时间的推移测量 OD600,使用 37°C 的微板读卡器,具有连续的线性晃动来监测生长。

5. 用低密度脂蛋白孵育S.金黄色葡萄球菌,用于膜脂质分析。

  1. 将分离的菌落培养成5 mL的无脂肪酸1%胰酮汤,并在37°C下孵育过夜,摇动(225 rpm)。
  2. 稀释过夜培养 1:100 到无菌 250 mL 迷糊瓶中,其中包含 50 mL 的 1% 胰锥体汤。在37°C下孵育至中日志阶段(约4小时),并摇动。
  3. 将25 mL培养被转移到无菌的50 mL离心管中,并颗粒细胞。去除上清液,在750 μL的1%胰蛋白石汤中重新悬浮细胞颗粒。
  4. 将再悬浮的细胞和电池悬浮液的等分300μL结合到无菌的1.5 mL离心管中。
  5. 将低密度脂蛋白添加到所需的最终浓度,并在 37°C 下孵育,摇动(225 rpm)4小时。
  6. 在4°C下将培养物在16,000 x g下离心2分钟,然后用两卷无菌PBS清洗细胞颗粒,然后重复。
  7. 记录每个湿细胞颗粒的重量。将细胞颗粒在干冰或液氮中冷冻,储存在-80°C或直接至第6节。

6.提取金黄色膜脂质

  1. 将冷冻的金黄色细胞颗粒放在干冰上。在每个细胞颗粒上添加 0.5 mm 氧化氧化铝珠,使用大约等于细胞颗粒体积的珠子体积。
    注:作为这种脂质提取方法的替代方法,研究人员可以使用成熟的Bligh和Dyer或Folch方法从细菌细胞34中严格脂质。
  2. 将740μL的75%甲醇(HPLC级)直接加入电池颗粒,至-80°C。
  3. 每1mg细胞加入2μL的50μM二甲酰磷脂酰胆碱(以甲醇制备)作为内部标准。关闭试管,将包含每个样品的 1.5 mL 离心管放入子弹搅拌机组织均质器中的可用端口中。在低速上对质化样品,设置 2-3,3 分钟。
  4. 目视检查样品的均质性。如果细胞团可见,则继续在项目符号混合器中以 2 分钟为增量进行均质化。
  5. 从子弹搅拌机中取出样品,并转移到化学烟气罩。
  6. 在每个样品管中加入270μL的氯仿。大力涡流样品30分钟。
    注意:氯仿是一种可能的致癌物质。
  7. 在台式离心机中将样品离心长达30分钟,至少2000 x g。更快的速度比兼容的离心管一起使用,离心的持续时间可以缩短到10分钟。
  8. 在化学烟气罩中,收集单相上清液并转移到新的试管中,同时小心避免提取管底部的蛋白质颗粒。
  9. 在蛋白质颗粒中加入 740 μL 的 75% 甲醇(HPLC 级)和 270 μL 氯仿,并重新提取上述步骤 6.6-6.8 中所述的每个样品。将第二次提取中的上清液与先前收集的每个样品的上清液相结合。
  10. 在惰性气体(如氮气或氧化铝)流下,或在真空下使用离心机浓缩器(材料表)蒸发萃取溶剂。
  11. 用1.0 mL的10 mM碳酸氢铵溶液清洗干脂提取物三次,并按照步骤6.10重新干燥样品。
  12. 将干脂质提取物重新悬浮在合适的非极性溶剂中,如异丙醇。使用步骤 5.7 中确定的每 1 mg 新细胞重量的 20 μL 重新悬浮样品,或者,如果细胞颗粒的重量未知,则将样品重新悬浮在 200 μL 异丙醇中,然后进入第 7 节。

7. 使用高分辨率/精确质谱分析S. aureus脂质曲线

  1. 在进行全脂质分析之前,从实验组中选择具有代表性的测试样本,并在一系列样品稀释因子中进行分析,以确定总脂质浓度在线性范围内的样品稀释范围质谱仪的探测器响应范围,如前所述35。
  2. 在惰性气体下或真空下干燥等分物,在离心机浓缩器(材料表)中,对每个样品脂质提取物的蒸发等分物进行脂质分析。
  3. 在液相色谱-质谱(LC-MS)级异丙醇:甲醇(2:1,v:v:v)中重新悬浮含有20 mM铵的脂质,使用相当于步骤7.1中确定的最佳样品稀释系数的体积。
  4. 对于非靶向脂质分析,样品可以直接引入高分辨率/精确的质谱平台,而无需通过流动注入或使用色谱或直接注入提取物35,36。将步骤 7.3 中制备的稀释脂质提取物转移到适当的自动进样小瓶或 96 孔板。
  5. 对于基于流量注入的分析,将自动进样小瓶放入 HPLC 系统的温度控制 (15°C) 自动进样器中,该系统具有毛细管/低流量应用,例如配备电子流量的 HPLC(材料表)比例和流量监测系统。
  6. 用LC-MS级异丙醇:甲醇(2:1,v:v:v)填充含有20 mM铵的HPLC溶剂储液罐。
  7. 使用安捷伦化学站软件,对HPLC自动采样器进行编程,以执行5μL样品注入。在"仪器"菜单中,选择"设置喷射器",并在"喷射音量"字段中键入5.0。单位以微升为单位。确保HPLC设置为以1μL/2:1(v:v)异丙醇:甲醇含有20 mM铵甲酸酯的1μL。
  8. 在"化学仪器"菜单中,选择"设置泵...",然后选择微流量模式切换开关。
  9. 在"时间表"字段中,输入:时间 0.00、100% B、流 1.0。通过输入时间 10.0、100% B、流 1.0,在"时间表"中输入并创建第二行。选择"设置泵"菜单底部的"确定"按钮。这些设置将启用 10 次分析运行,流速为每分钟 1.0 μL。
  10. 使用装有低流量 (34 G) 金属针的电喷雾电离源,将 Eluate 从 HPLC 输送线引入质谱仪。
  11. 使用热调谐加仪表控制软件,选择设置菜单并选择加热ESI源。通过将这些值键入对话框的相应字段中,将这些值设置为 4000 V,将护套气体设置为 5(任意单位)。同样,将毛细管温度设置为 150 °C,将 S 镜头设置为 50%。
    注:这些值需要针对每个质谱平台进行优化。
  12. 对于非目标脂质分析,使用高分辨率/精确质量 MS 平台 (材料表) 作为检测器。
  13. 使用热调谐加软件,单击"定义扫描"按钮,并在"分析器"菜单中选择FTMS。将"质量范围"字段设置为"正常",并在"分辨率"字段中选择100,000。确保扫描类型设置为"已完全"。在"扫描范围"菜单下,在第一质量 (m/z)字段中输入200,并在"最后一个质量 (m/z)"字段中输入2000。
  14. 确保利用负极性来检测最丰富的金黄色脂质。
  15. 使用离子映射串联质谱法 (MS/MS) 对感兴趣的光谱区域内的所有脂质离子进行重复样品分析,以确认脂质结构和脂肪酸成分。或者,在第 8 节中分配了初始脂质鉴定后,可进行 MS/MS 分析。

8. 数据库搜索,以确定内源性S.金黄色葡萄球菌和外源性LDL衍生脂质

  1. 使用热Xcalibur软件进一步优化观察到的质量精度。在 Xcalibur 中,在"工具"菜单下,选择"脱机重新校准"。打开"重新校准脱机"窗口后,通过选择"文件"菜单并选择"打开"选项来加载要重新校准的质量频谱文件。
  2. 打开感兴趣的文件,切换视图窗口顶部的"插入行"按钮,以查看 MS 运行的总电子色谱图。通过左键单击总电离度图中观测信号峰值的一个边缘的计算机鼠标,并将鼠标拖动到峰值的最宽部分,从而对获取的 MS 信号进行平均。
  3. 在"扫描筛选器"菜单下,选择与完全扫描 MS 数据对应的筛选器。通过选择"加载参考"按钮并选择参考文件,加载包含至少三个已知S. aures内源脂质的理论单同位素质量的参考文件。选中每个脂质单同位素质量旁边的"使用"框。
  4. 单击查看窗口底部的"搜索"按钮。如前所述,在总电子色谱图中重新对信号峰值的 MS 信号进行平均。
  5. 单击查看窗口底部附近的"转换"按钮。当"转换对话"框打开时,单击"确定"。如果从热科学以外的供应商的质谱平台上收集数据,请省略此步骤。
  6. 使用 Xcalibur 软件,将每个未经处理或 LDL 处理的样本重新校准的准确质量峰值列表导出到 Excel 文件的单独的工作表。选择"质量浏览器"图标。通过选择"文件"菜单并选择"打开..."选项,打开重新校准的感兴趣文件。
  7. 在总电子色谱图中跨宽峰值的平均值,如步骤 8.2 中所述。
  8. 右键单击质量频谱查看窗口中的图钉图标,然后选择"查看|频谱列表.在同一菜单中,选择"显示选项",然后在"显示"菜单中选择"所有峰值"切换框。单击"确定"按钮可关闭查看窗口。
  9. 再次右键单击质量频谱查看窗口中的图钉图标,然后选择"导出" |剪贴板(精确质量).将第一个工作表的导出数据单元格 A1 粘贴到新的 Excel 电子表格中。
  10. 删除导出数据文件中的前 8 行文本,以便 Excel 电子表格的单元格 A1 包含来自质量频谱的第一个质量数据点。对每个重新校准的 MS 文件重复导出,为每个导出的峰值列表使用 Excel 文件中的新工作表。
  11. 使用脂质光谱分析 (LIMSA) 软件37外接 Excel,构建一个数据库,其中包含 Hewelt-Belka 等人描述的已知S. aureus 脂质物种的分子公式,以及 Hewelt-Belka 等人 201438中描述的分子公式。代表脂质物种的公式,这些品种可能假设存在于 LDL 中。
    注:此外,还应注意在数据库中包括潜在的分子配方,以说明其中存在主要LDL脂肪酸的假设细菌脂质,如油油(18:1)和亚油(18:2)脂肪酸32。
  12. 要构造数据库,打开一个空白的 Excel 电子表格。在第一个工作表的单元 A1 中,键入要添加到数据库中的脂质物种的理论/计算单同位素质量,与质谱仪中观察到的离子状态中的脂质物种的质量相对应。在单元格 B1 中,输入脂质物种的名称,如 PG(34:0)。
  13. 在细胞C1中,输入脂质种类的分子公式,对应于质谱仪中观察到的脂质的离子状态。在细胞D1中,输入质谱仪中观察到的脂质物种的电荷。移动到单元格 A2,开始为在可搜索数据库中输入的下一个脂质物种的新条目。
  14. 重复步骤 8.12 和 8.13,直到所有所需的脂质物种都输入数据库。保存数据库文件,并在 Excel 中保持打开状态。
  15. 在 Excel 中,选择"外接程序"菜单。选择LIMSA以启动 LIMSA 软件。从主菜单中,单击"复合库..."按钮。在显示的新窗口中,单击"导入化合物"。这将上载复合数据库供 LIMSA 软件使用。
  16. 根据供应商的说明35,使用 LIMSA 软件 Excel 外接程序对所有 MS 光谱执行基于质量的准确质量脂质识别。从 LIMSA 主菜单中,在频谱类型菜单下选择峰值列表。选择"正模式"或"负"模式以与获取 MS 数据的极性相对应。
  17. 在峰值 fwhm (m/z)窗口中,输入所需的质量搜索窗口以查找峰值。对于高分辨率/准确的质量 MS 数据,建议使用 0.003-0.005 m/z 的质量容差搜索窗口。
  18. 在"灵敏度"窗口中,输入所需的基线截止点(例如,0.01% 相对丰度)。在同位素校正菜单中,选择线性拟合或减法算法,其中任一算法可与峰值列表数据一起使用。
  19. 通过单击"可用化合物"窗口中所需的脂质物种,突出显示包含在数据库搜索中的脂质化合物。单击"添加"按钮将突出显示的脂质物种添加到搜索组中。
  20. 通过单击添加的化合物定义内部标准,然后将"浓度"窗口更改为所选内部标准的相应浓度。
  21. 通过选择每个添加的脂质种类和内部标准,并在类字段中键入类名(如 PG 或脂质),确保要量化的内部标准和所选脂质种类属于同一类名称。
  22. 要保存可搜索的脂质化合物组以供将来使用,请单击"分组"菜单旁边的"保存"按钮。
  23. 确保包含所有导出的 MS 峰值列表的 Excel 文件对对应于第一个S. aureus MS 运行的工作表打开,然后单击 LIMSA 主菜单中的"搜索"按钮。
    注:LIMSA 数据库搜索的输出将包括与步骤 8.12-8.13 中构建的数据库中存在的脂质相匹配的质量光谱特征列表,以及每个匹配要素在规范化到一个或多个选定要素之后的浓度内部标准。
  24. 使用 Xcalibur 软件检查与感兴趣的脂离子对应的 m/z 的准确质量 MS/MS 光谱,以确认每个已识别的脂质分子物种中存在的脂肪酸成分。选择"质量浏览器"图标。通过选择"文件"下拉菜单并选择"打开..."选项,打开感兴趣的 MS/MS 文件。
  25. 通过右键单击质量谱查看窗口中的图钉图标,选择与感兴趣的脂质 m/z 的 MS/MS 分析对应的扫描过滤器,然后从菜单中选择"范围"。在显示的新窗口中,选择"筛选器"菜单以选择扫描。
  26. 如步骤 8.2 中所述,在总电子色谱图中平均信号。使用 MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca) 软件执行适当的统计测试。通过比较未经处理和LDL处理条件的标准化脂质丰度,评估S.aureus脂质成分的统计显著性差异。

结果

图1说明了从鸡蛋蛋黄中浓缩低密度脂蛋白的协议。这个过程首先用盐水稀释整个蛋黄,并将蛋黄固体从含有LDL的可溶性或血浆部分中分离出,称为颗粒(图1)33。血浆馏分的LDL含量通过+30-40 kDaβ-活蛋白的沉淀进一步丰富(图2)33。蛋白质带在140、80、65、60和15 kDa的存在与低密?...

讨论

Aureus将外源脂肪酸加入其膜磷脂27,32,43。使用外源性脂肪酸的磷脂合成绕过了FASII抑制,但也改变了膜27、32、44的生物物理特性。虽然将外源性脂肪酸纳入革兰氏阳性病原体磷脂是有据可查的,但在宿主脂肪酸储存库的身份和三种主要葡萄球菌磷脂类型?...

披露声明

作者没有披露。

致谢

我们感谢哈默实验室的成员对手稿的批判性评价和对这项工作的支持。科罗拉多大学医学院的亚历克斯·霍斯威尔博士亲切地提供了AH1263。密歇根州立大学的克里斯·沃特斯博士实验室提供了试剂。这项工作得到了美国心脏协会16SDG30170026的资助和密歇根州立大学提供的启动基金的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium sulfateFisherBP212R-1≥99.5% pure
Cell culture incubatorThermoMaxQ 6000
CentrafugeThermo75-217-420Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE
Costar assay plateCorning378896 well
Filter paperSchleicher & Schuell597
Large chicken eggN/AN/ACommon store bought egg
Microplate spectrophotometerBioTekEpoch 2
NaClSigmaS9625
S. aureus strain AH1263N/AN/AProvided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubingPierce687007,000 MWCO
TryptoneBecton, Dickison and Company211705
0.5 mm zirconium oxide beadsNext AdvanceZROB05
Bullet BlenderNext AdvanceBBX24B
Methanol (LC-MS grade)FisherA4561
Chloroform (reagent grade)FisherMCX10559
Isopropanol (LC-MS grade)FisherA4611
Dimyristoyl phosphatidylcholineAvanti Polar Lipids850345C-25mg
Ammonium bicarbonateSigma9830≥99.5% pure
Ammonium formateSigma70221-25G-F
Xcalibur softwareThermo ScientificOPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometerThermo Scientifichigh resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLCAgilent
SpeedVac Vacuum ConcentratorsThermo Scientific

参考文献

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