تحليل بطبعة مخلب من التسجيلات المحسنة على النقيض من التباين (PrAnCER): نظام تحليل مشية آلي منخفض التكلفة ومفتوح الوصول لتقييم حالات العجز في المحرك

Summary

نحن نصف نظام تحليل مشية جديدة، Paw-Print تحليل التسجيلات المحسنة على النقيض (PrAnCER)، وهو نظام آلي مفتوح الوصول لتحديد كمية خصائص مشية في الفئران التي تستخدم أرضية شبه شفافة جديدة تلقائيا تحديد مقدار المشية. تم التحقق من صحة هذا النظام باستخدام نموذج هالوبيريدول لمرض باركنسون.

Abstract

يستخدم تحليل مشية لتحديد التغيرات في وظيفة المحرك في العديد من نماذج القوارض من المرض. وعلى الرغم من أهمية تقييم المشية ووظيفة المحرك في العديد من مجالات البحث، فإن الخيارات التجارية المتاحة لها عدة قيود مثل ارتفاع التكلفة وعدم وجود شفرة مفتوحة يسهل الوصول إليها. ولمعالجة هذه القضايا، قمنا بتطوير تحليل PrAnCER، وتحليل طباعة Paw-Print للتسجيلات المحسنة على النقيض من التباين، من أجل التحديد الكمي التلقائي للمشية. يتم إنتاج التسجيلات المحسنة على النقيض باستخدام أرضية شفافة تحجب الأجسام غير المتلامسة مع السطح، مما يؤدي إلى عزل بصمات مخلب الفأر بشكل فعال أثناء سيره. باستخدام أشرطة الفيديو هذه، لدينا برنامج بسيط يقيس بشكل موثوق مجموعة متنوعة من المعلمات المشي spatiotemporal. لإثبات أن PrAnCER يمكن الكشف بدقة عن التغيرات في وظيفة المحرك، وظفنا نموذج haloperidol لمرض باركنسون (PD). اختبرنا الفئران بجرعتين من الهالوبيريدول: جرعة عالية (0.30 ملغم/كغم) وجرعة منخفضة (0.15 ملغم/كغم). Haloperidol زيادة كبيرة مدة الموقف والخلفية مخلب منطقة الاتصال في حالة جرعة منخفضة, كما قد يكون من المتوقع في نموذج PD. في حالة الجرعة العالية, وجدنا زيادة مماثلة في منطقة الاتصال ولكن أيضا زيادة غير متوقعة في طول خطوة. مع مزيد من البحوث، وجدنا أن هذا طول خطوة زيادة يتسق مع ظاهرة تستعد الهروب لوحظ عادة في جرعات أعلى من haloperidol. وهكذا، تمكنت PrAnCER من الكشف عن كل من التغيرات المتوقعة وغير المتوقعة في أنماط مشية القوارض. بالإضافة إلى ذلك، أكدنا أن PrAnCER متسقة ودقيقة عند مقارنتها مع التهديف اليدوي لمعلمات مشية.

Introduction

وتستخدم القوارض عادة كنماذج لدراسة مجموعة واسعة من الأمراض والإصابات بما في ذلك التهاب المفاصل¹, مرض باركنسون (PD)^2,3, الاضطرابات العصبية العضلية^4,5, استسقاء الرأس⁶ ، وإصابة الحبل الشوكي⁷. في هذه الحالات، يمكن قياس أعراض مثل الألم والتوازن والوظيفة الحركية من خلال دراسة أنماط مشية الحيوانات. يتم تحديد هذه الأنماط كمياً باستخدام مجموعة من معلمات مشية الفناء الصدغية التي تلخص موقع وتوقيت مطبوعات الكف، فضلاً عن منطقة ملامسة الكفة على الأرض.

على الرغم من وجود العديد من الخيارات لتحليل المشية، فإن الأنظمة الحالية لها العديد من العيوب. في اختبار الحبر والورق التقليدي، يتم تغطية الكفوف الحيوان بالحبر قبل أن يمشي عبر ورقة من الورق الأبيض (الشكل1A). ويمكن بعد ذلك قياس مطبوعات الكف الناتجة لطول الخطوة وعرض الموقف، ولكن لا يمكن تقييم معلمات مشية مؤقتة رئيسية مثل السرعة أو مدة الخطوة. الأنظمة الحديثة القائمة على الفيديو هي أكثر موثوقية، ولكن تحليل الفيديو يتطلب شاقة الإطار على حدة تسجيل ما لم يتم استخدام نظام آلي مناسب⁸. وهناك العديد من نظم تسجيل النقاط الآلية التجارية المتاحة حاليا، ولكن هذه النظم يمكن أن تكون باهظة التكلفة. بالإضافة إلى ذلك، تعتمد هذه الأنظمة على أرضيات واضحة أو في بعض الحالات، أجهزة المشي، وكلاهما يغير الحركة الطبيعية. وقد ثبت أن أجهزة المشي تخفي العجز الحركي في بعض نماذج المرض⁹، في حين أن الأرضيات الواضحة (الشكل 1B) تسبب الفئران لقضاء المزيد من الوقت على محيط حقل مفتوح ، مما يشير إلى زيادة القلق¹⁰. من الناحية المثالية، فإن جهاز تحليل مشية لا تعتمد على أي منهما، مما ينتج أنماط الحركة الأكثر طبيعية مع أقل الإجهاد على الحيوان.

تستخدم الخيارات المتاحة المفتوحة المصدر والتجارية مجموعة متنوعة من الطرق للتغلب على صعوبة عزل بصمة عن جسم الحيوان على الرغم من ظروف الإضاءة المتغيرة ولون الحيوان وأشكال الطباعة. بعض تعزيز التباين من الاتصال الكفوف باستخدام الأسطحالتي تطلق الضوء استجابة للضغط 7،^11،12،ولكن هذه مكلفة وصعبة من الناحية الفنية لبناء. وتستخدم نظم أخرى زوايا عرض متعددة تسمح بمراقبة التنسيق بين الجسم كله^8و13. في حين أن هذه الخيارات توفر مزايا لقياس المعلمات الحركية الإضافية وراء مشية، فهي معقدة دون داع لتحليل مشية بسيطة. وعلاوة على ذلك، كل هذه التقنيات تعتمد على الأرضيات واضحة، مما يغير السلوك الطبيعي.

ويستند PrAnCER على ما نسميه التسجيلات المحسنة التباين، والتي تستخدم مزيج من الإضاءة وأرضية شبه شفافة لتعزيز الكشف عن المطبوعات. عند النظر إليها من أدناه، وهذا يخلق صورة عالية التباين (مخلب الطباعة) في حين حجب وجهة نظر الكائنات غير على اتصال مع السطح (جسم الحيوان) (الشكل1D). عند النظر إليها من فوق، تبدو الكلمة غير شفافة. البروز الناتج من الكفوف في طريقتنا يسمح تحديد دقيق لمجموعة متنوعة من الخصائص مشية والحركية من قبل نظامنا الآلي وضعت حديثا. في هذه الدراسة، ونحن نوصف الجهاز، لدينا بروتوكول تحليل مشية، ونظامنا التهديف الآلي، PrAnCER. يتم تجميع جهازنا بسهولة ويمكن استخدام PrAnCER لتقييم العجز الحركي في مجموعة واسعة من نماذج الأمراض والإصابات.

لإثبات أن PrAnCER يمكن استخدامها للكشف عن أنماط مشية غير طبيعية، استخدمنا نموذج haloperidol من PD، نموذج بسيط للتحريض عابرة من التغييرات الحركية^14. هالوبيريدول هو مضاد مستقبلات الدوبامين يستخدم على نطاق واسع كمضاد للذهان¹. وهو يؤثر على أنظمة المحرك عن طريق تغيير إشارات الدوبامين في السترياتوم, عنصر مهم من مسار المحرك في العقد القاعدية¹⁴. حتى جرعة واحدة من haloperidol يقلل بسرعة مستويات الدوبامين خارج الخلية في السترياتوم, مما تسبب في التغوط السيارات مثل باركنسون¹⁵. الآثار السلوكية هي صلابة العضلات، akinesia، وcatalepsy، والتي تعرف على أنها عدم القدرة على العودة إلى وضع طبيعي بعد وضعها في موقف غير عادي^11،16. جرعات حادة من haloperidol تسبب العجز الحركي يمكن التعرف عليها في اختبار روتارود من وظيفة المحرك¹⁷. وقد سببلنا أن العاهات الحركية الحركية التي يتم التوصل إليها بوساطة هالوبيريدول ستكون واضحة أيضاً في عدد من الخصائص التي يمكن الوصول إليها لتحليل المشية الآلي.

على الرغم من أن الاستجابات لهلوبيريدول تختلف على نطاق واسع عبر الدراسات، تظهر آثار الهالوبيريدول المحفزة بجرعات تبلغ 0.5 ملغم/كغم وأعلى، في حين أن انخفاض الاستجابة وضعف المحرك يمكن اكتشافه بجرعات أقل (0.1 - 0.3 ملغم/كغم)^{16، 17.}في محاولة لتجنب الآثار المحفزة من haloperidol، قررنا اختبار جرعتين من haloperidol: جرعة عالية (0.30 ملغ / كغ) وجرعة منخفضة (0.15 ملغ / كغ). كما هو مبين في الجدول 1، درست التجربة 1 آثار الهالوبيريدول جرعة عالية ، في حين أن التجربة 2 اختبار آثار الهالوبيريدول جرعة منخفضة. استخدمنا تصميمًا داخل الموضوع تم فيه اختبار كل فأر في ظروف الجرعة العالية والجرعة المنخفضة والتحكم (المالحة). تم موازنة ترتيب الحالة عبر الفئران. وتوقعنا أن الإدارة الحادة من haloperidol من شأنه أن يسبب العاهات مشية مماثلة لتلك الموجودةفي نماذج أخرى من PD مثل انخفاض السرعة، وانخفاض طول خطوة، وأطول مدة موقف 3،^{14،18 ،19}. لاحظنا التغيرات السلوكية بما في ذلك akinesia بعد إدارة هالوبيريدول في كلتا الجرعات. في حالة الجرعة المنخفضة، كانت الفئران قد زادت بشكل ملحوظ مدة الموقف ومنطقة الاتصال مخلب الخلفية، كما هو متوقع. هذه التغييرات مشية قابلة للمقارنة مع الخطوات البطيئة، خلط المشتركة بين مرضى PD^2،20. في حالة جرعة عالية، ومع ذلك، رأينا زيادة في طول خطوة، فضلا عن زيادة في منطقة الاتصال مخلب. وعلى الرغم من أن الزيادة في طول الخطوة لم تكن متوقعة، فقد أشار استعراض آخر للمؤلفات إلى أنه من المرجح أن يكون جزءاً من استجابة هروب من الهالوبيريدول. نخلص إلى أن PrAnCER هو في الواقع قادرة على الكشف عن التغيرات مثل باركنسون في مشية القوارض بما يتفق مع استخدام neuroleptics.

Protocol

وكانت جميع الإجراءات متفقة مع المبادئ التوجيهية للجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للأمم المتحدة.

1. جهاز تحليل مشية

1. إعداد المشية تحليل الممشى يتكون من ممر زجاج شبكي واضح المغلقة (36 "L × 3" W × 4.5 "H) وضعت على أرضية زجاج شبكي واضح (الشكل2A). جعل الكلمة زجاج شبكي شبه شفافة من خلال تغطيتها مع قطعة من 16 LB الألياف القطنية صياغة القطيفة قطع إلى نفس العرض مثل الممشى.
   ملاحظة: هناك طرق أخرى لجعل الكلمة شبه شفافة.
2. وضع كاميرا مع معدل الإطار من 30 لقطة على الأقل في الثانية (إطارا في الثانية) مباشرة تحت الممر لالتقاط منتصف المسار (الشكل2B).
3. تأمين شريط من 12 V أضواء LED مع 18 المصابيح / القدم ما يقرب من 2 بوصة بعيدا عن و 1 بوصة فوق أرضية الممر لإلقاء الضوء على المسار.

2. إعداد الحيوانات

1. السماح للالحيوانات للتكيف مع حيوية لمدة أسبوع على الأقل قبل التعامل معها. التعامل مع الفئران لمدة 5 أيام على الأقل قبل بدء التجربة. استخدمت هذه الدراسة 8 ذكور الفئران إيفانز طويلة ما يقرب من 3 أشهر من العمر.
2. اعتاد الحيوانات إلى غرفة الاختبار ومشية الممشى مع أضواء الغرفة إيقاف
   1. وضع قفص الفئران المنزل على مستوى السطح في نهاية ممر مشية لتكون بمثابة مربع الهدف. لاحظ أنه إذا كان القفص المنزلي عميقًا، فقد تستفيد الفئران التي تعاني من ضعف في السن أو اللوجاز بالمحرك من منحدر أو خطوة لتوفير سهولة الوصول إلى القفص المنزلي.
   2. السماح للفأر على المشي من يد المجرب أسفل طول الممشى للوصول إلى قفص المنزل.
   3. الفئران سوف تتوقف في كثير من الأحيان في نهاية الممشى للنظر حولها قبل القفز إلى أسفل إلى القفص المنزلي. إذا كان الفئران يستغرق وقتا أطول من 1 دقيقة للخروج من الممشى، وتشجيعه على دخول قفص المنزل مع دفعة لطيف.
   4. إذا استدار الجرذ، استخدم قطعة صغيرة من زجاج شبكي لمنع نهاية "البداية" من الممشى. كرر لما مجموعه 3 أشواط.
3. عادة لمدة يومين على الأقل أو حتى الفئران مريحة عبور الممشى بوتيرة ثابتة دون تجميد.

3. Gait إجراء الاختبار

1. ضبط الإعدادات على برنامج كاميرا ويب لتحقيق أوضح صورة لمطبوعات مخلب. إيقاف أضواء الغرفة لجميع اختبار مشية.
2. قم بتسجيل كل تشغيل بشكل منفصل وتسمية بشكل مناسب للاستخدام مع برنامج التحليل التلقائي.
3. تأكد من عدم وجود بقع أو حطام على القطيفة. بدء تسجيل بضع ثوان قبل أن يدخل الفئران الممشى والتوقف بمجرد خروج الفئران من الممشى ويدخل قفصه المنزلي.
4. استمر حتى يتم إكمال ثلاثة أشواط مقبولة أو 10 دقائق قد انقضت.
5. مسح أسفل الممر مع الإيثانول بين كل فأر واستبدال القطيفة حسب الحاجة.
   ملاحظة: يتم تعريف محاكمة مقبولة كتجربة حيث يمشي الحيوان باستمرار ودون توقف للخطوات 4 الأولى من المدى. إذا كان هذا من الصعب تحقيقه، قم بتعديل المعايير لتشمل التجارب التي توجد فيها 4 خطوات متتالية في أي نقطة في المدى التي تحدث دون توقف أو تسارع مفاجئ.

4- التحليل الآلي لـ PrAnCER

1. ضع جميع مقاطع الفيديو لتحليلها في مجلد.
2. إطلاق PrAnCER عن طريق تشغيل السيناريو بيثون PrAnCER. ستقوم PrAnCER بتحليل مقاطع الفيديو استنادًا إلى الخطوات الموضحة في الشكل 3 والشكل 4.
3. في القائمة المنبثقة، حدد المجلد المحدد عن طريق الضغط على الزر اختيار مجلد. حدد خيارات مخصصة للتحليل إذا رغبت في ذلك. يمكن العثور على أوصاف تفصيلية لكل معلمة بالنقر فوق علامة الاستفهام المجاورة لها. انقر فوق متابعة عند الانتهاء.
4. حدد منطقة اهتمام (ROI) على صورة الممشى الذي يظهر. للقيام بذلك، انقر بزر الماوس الأيمن لتعريف الحافة العليا والنقر بزر الماوس الأيمن لتعريف الحافة السفلية. إذا كان المربع الذي يظهر صحيحاً، اضغط N للمتابعة. إذا لم يكن الأمر كذلك، اضغط Z للتراجع. بمجرد الضغط على N، سيتم تشغيل البرنامج تلقائيًا.
5. بعد اكتمال PrAnCER، قم بإنهاء البرنامج عن طريق الضغط على Enter في المحطة الطرفية.
6. لمراجعة إخراج النتائج يدوياً بواسطة PrAnCER، قم بتشغيل البرنامج النصي بيثون GaitEditorGUI وحدد ملف .mp4 المناسب لكل فيديو. إذا لزم الأمر، قم بتصحيح أي ة تم التعرف عليها بشكل خاطئ أو دمجها.
7. لاستخراج معلمات مشية المكانية والزمنية، قم بتشغيل برنامج بيثون النصي ParameterAnalyzer. اختر عدد المطبوعات الخلفية لتحليلها ومجلد مقاطع الفيديو لتحليلها، ثم انقر على متابعة. سيؤدي ذلك إلى إخراج ملف .csv لكل فيديو يحتوي على عدد من معلمات المشي الشائعة، والتي يتم وصفها في الجدول 2 والموضحة في الشكل 5.
   ملاحظة: تتوفر البرامج النصية الكاملة، بالإضافة إلى إرشادات قراءة البيانات وتحليلها، في GitHub (www.github.com/hayleybounds) الخاص بالمؤلف. نفذنا هذه الخوارزمية باستخدام الحرة، مفتوحة المصدر مكتبة بيثون OpenCV²¹. وشملت أيضا على GitHub هي تعليمات لبناء لدينا المشية تحليل الممشى.

النتائج

إجراء هالوبيريدول

لقد طورنا هذا النظام لتحليل مشية لمقارنة معلمات مشية في الفئران السيطرة على تلك الموجودة في الفئران التجريبية المتوقع أن تظهر مجموعة متنوعة من اللوكموتور، مشية، وضعف التوازن. استخدمنا تصميم داخل الموضوع الذي تم اختبار كل الفئران في محلول ملحي، هالوبيريدول جرعة عالية وجرعة منخفضة ظروف هالوبيريدول. وفصلت الجرذان إلى مجموعتين (ألف وباء) للسماح بموازنة الفئران؛ وموازنة اختبار مشية لبعض الوقت من اليوم وترتيب الشرط. تم فصل كل اختبار من قبل 48 h. تم التخدير طفيفة الفئران مع الايسوفلوران قبل تلقي الحقن داخل الصفاق (IP) من المالحة أو haloperidol. تم اختبار Gait 1 ساعة بعد الحقن، وعند هذه النقطة ينبغي أن يكون haloperidol في مستويات الذروة^15،16،17.

النتائج السلوكية

لاحظنا تغيرات سلوك بارزة في الحيوانات تعامل مع haloperidol. وفي حالة الجرعة العالية، كانت خمسة من الفئران الثمانية تعاني من فترات من الجمود في بداية الممشى، حيث كانت لا تستجيب للمجرّب الذي لمسها ومقاومة للتحريم. في بعض الحالات، استمرت هذه الحالة لعدة دقائق حتى تمت إزالة الفئران من الممشى. وفي حالات أخرى، يتحرك الجرذ غير المتنقل فجأة بسرعة أو "مقيداً" عبر الممشى ثم يعود إلى الحالة غير المتحركة بالقرب من النهاية. في حالة الجرعة المنخفضة، كان 3 من الفئران الثمانية فترات مماثلة من الجمود. في هذه الجرعة, كان هناك مثال واحد فقط من السلوك المحيطة. لم يلاحظ أي حدود عندما تم التعامل مع الحيوانات مع المالحة.

قمنا بتحليل آثار haloperidol على معلمات المشيالتالية: قاعدة الدعم، وطول خطوة، وسرعة خطوة، ومدة الموقف، ونسبة الموقف إلى التأرجح، والحد الأقصى لمنطقة الاتصال، والمسافة بين الأطراف. لأن العديد من المعلمات مشية للأطراف الأمامية والخلفية متطابقة والهالوبيريدول عموما له آثار موحدة على جميع الأطراف، ونحن حساب المعلمات للأطراف الخلفية فقط ولم تفصل البيانات للأطراف اليسرى واليمنى. لكل فأر، قمنا بحساب متوسط كل معلمة مشية من جميع الأشواط القابلة للاستخدام من كل يوم اختبار. تم حساب كافة المعلمات (بخلاف تباين السرعة) كمتوسط للخطوات الأربعة الأولى القابلة للاستخدام للتشغيل. لتقييم ما إذا كان كل جرعة من haloperidol أثرت بشكل كبير مشية, استخدمنا عينة المقترنة t-اختبار. وفي التجربة 1، حدثت زيادة كبيرة في طول الخطوة (الشكل6ألف؛t(7) = -2.962، p = 0.021) ومنطقة الاتصال القصوى (الشكل6ألف؛ t(7) = -2.51، p = 0.04) في الحيوانات المعالجة بالجرعة العالية هالوبيريدول. ولم تكن قاعدة الدعم والسرعة ومدة الموقف ونسبة الموقف إلى التأرجح كبيرة. وفي التجربة 2، أظهرت الحيوانات التي أعطيت جرعة منخفضة من الهالوبيريدول زيادة كبيرة في مدة الموقف (الشكل6B؛t(7) = -2.444، p = 0.044) ومنطقة الاتصال القصوى (الشكل6B؛t(7) = -3.085، p = 0.018) مقارنة بحالة المالحة. لم تكن هناك معلمات مشية أخرى كبيرة. بالإضافة إلى ذلك، كان هناك فرق كبير بين الجرعة العالية وظروف الهالوبيريدول الجرعة المنخفضة في قاعدة الدعم (الشكل6C؛t(7) = 2.651، p = 0.033)، ومنطقة الاتصال القصوى (الشكل6C؛t(7) = 4.635، p = 0.002) والمسافة بين الأطراف ( الشكل 6جيم؛ t(7) = 3.098، ص = 0.017).

دقة موقعك والأخطاء في النظام الآلي

لتقييم دقة PrAnCER، قارنا تحليلها الآلي بالتهديف اليدوي لـ 21 فيديو تم اختيارها عشوائياً من مجموعة منفصلة من 6 فئران مراقبة. ولأغراض تسجيل النقاط اليدوية، تم تحويل مقاطع الفيديو إلى سلسلة من الصور، التي استخدمت بعد ذلك لوضع علامات على مواقع المطبوعات يدوياً. من أجل الكفاءة، ركزنا تحليلنا على البيانات المكانية المقاسة من المطبوعات الخلفية فقط. لقد استخرجنا طول الخطوات المتوسطة وBOS لكل فيديو وقارنناه بالقيم الآلية. وفي حين أن متوسط طول الخطوة لم يكن مختلفاً اختلافاً كبيراً بين الدرجات اليدوية وتحليل PrAnCER (الشكل7B؛t(20) = -0.01، p = 0.99)، كانت قاعدة الدعم كبيرة (الشكل7ألف؛ t(20) = -2.21، p = 0.038). على الرغم من أن التهديف الآلي واليدوي كان يرتبط بشكل جيد بشكل عام، إلا أن النظام الآلي أبلغ عن وجود BOS أكبر بنسبة 5% في المتوسط. قد يكون هذا الاختلاف بسبب التباينات في تحديد centroid بدلاً من أخطاء الكشف. أما بالنسبة للتقدير اليدوي، فقد تم وضع علامة على موقع الطباعة وهو يرسم شكل بيضاوي حول قاعدة كل طبعة خلفية، حيث سيكون من الصعب تكرار طريقة PrAnCER في مركز التقدير الشامل يدويًا. وكان الاتجاه الواضح لPrAnCER أن يبالغ في تقدير BOS، ربما لأن بعض الحيوانات قد تلعب أصابع قدميها بطريقة غير متناظرة، مما تسبب في PrAnCER لمراقبة centroids أكثر تطرفا من التهديف اليدوي. كما لاحظت نظم أخرى زيادات كبيرة في نظام مراقبة الجودة بين التهديف اليدوي والآلي على الرغم من مقاييس طول الخطوة المتسقة¹⁷. وبالنظر إلى الاختلافات الصغيرة التي لوحظت والاتساق مع النظم الأخرى، نخلص إلى أن PrAnCER هو مقياس موثوق به من معلمات مشية.

من المهم ملاحظة أن جميع تحليلات الدقة حدثت بعد إجراء التصحيح اليدوي للناتج الآلي باستخدام واجهة المستخدم الرسومية لـ PrAnCER. كما هو الحال في النظم التجارية القائمة، هذه الخطوة ضرورية لتصحيح الأخطاء في التهديف وللقضاء على الأشواط التي لا تفي بالمعايير²². نحن ضبطها PrAnCER لخطأ على جانب من الإيجابيات كاذبة، وهذه هي أسهل لتصحيح ما بعد مخصص. لم نلاحظ أبدا PrAnCER تفشل في الكشف عن طباعة حقيقية خلال التصحيح اليدوي لأكثر من 500 أشرطة الفيديو. غير أنه لوحظت أنواع أخرى من الأخطاء. وتنقسم هذه الفئات إلى 3 فئات: الكشف الكاذب (الكشف عن عدم الطباعة كطباعة)، وتصنيفات خاطئة (طباعة تسمية خاطئة كمقدمة/خلفية أو يسار/يمين)، وتركيبات خاطئة (تم دمج طبعتين بشكل غير صحيح). يتم تصحيح هذه الأخطاء بسهولة في واجهة المستخدم الرسومية المصاحبة، وعادة ما تحدث في نسبة مئوية صغيرة فقط من مقاطع الفيديو التي تم تصويرها في الظروف العادية. وحتى مع مثل هذه التصحيحات، يقلل PrAnCER بشكل ملحوظ من كمية العمل اليدوي الذي ينطوي عليه تحليل المشية. ونحن نقدر أن لكل فيديو يستغرق ما يقرب من 3 دقائق لتشغيل PrAnCER وتصحيح أي أخطاء الإخراج (إذا لزم الأمر)، في حين أن الأمر سيستغرق ما يقرب من 10 دقيقة لتسجيل يدويا وتحليل نفس الفيديو.

الشكل 1 مقارنة طرق تحليل مشية. (أ) ينتج عن طريقة الحبر والورق التقليدية مطبوعات غير دقيقة لشكل الكف والموقع. (ب) تسجيل الفيديو مع أرضية شفافة يعطي وجهة نظر مفصلة من مطبوعات مخلب ولكن يحتوي على العديد من الميزات البارزة من جسم الفئران التي تعقد التهديف الآلي. (C) ورقة خفيفة الوزن على أرضية واضحة يخلق صورة صاخبة ويفقد التفاصيل. (د) استخدام القطيفة لإنشاء أرضية شفافة تنتج مطبوعات مفصلة للغاية مع القضاء بصريا على الجسم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2 رسم تخطيطي لجهاز ممر مشية وتسجيل الفيديو. (أ) يسير الجرذ عبر ممر واضح مع أرضية شفافة إلى مربع هدف القفص المنزلي أثناء تسجيله من الأسفل. في هذه الحالة، يغطي القطيفة أرضية شفافة لجعلها شفافة. يتم إضاءة الممشى بواسطة شرائط LED موضوعة على طولها على مستوى بين أقدام الحيوان وجسمه. (ب) لقطة شاشة من تسجيل فيديو يبين آثار الطابق الشفاف. اثنين من الكفوف واضحة للعيان، ولكن جسم الفئران هو أساسا غير قابل للكشف. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3 عملية الكشف عن إطار واحد من طباعة مخلب. (أ) الصورة الأصلية خالية من الضوضاء ثم تخضع للطرح الخلفية (B). (C) يتم تطبيق خوارزمية الكشف عن الحافة ويتم تحويل النتائج إلى سلسلة من إحداثيات X وY تسمى الملامح (D). (هـ) يتم تجميع الملامح حسب القرب، ويُأخذ الهيكل المحدب (الصندوق المحيط) للمجموعة لإنتاج محيط واحد يشمل الطباعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4 تحويل التكشف الفردي إلى طباعة سرية. (أ) يتم التعرف أولاً على مطبوعات Paw في مجموعة من الإطارات. (ب) تُعطى عمليات الكشف الفردية للكائنات رقماً يعرّفها على أنها مطبوعة، وهو ما يمثل موضعاً واحداً لمخلب واحد (C). (د) وأخيراً، تصنف على أنها يسارية أو يمينية استناداً إلى موقعها بالنسبة إلى خط الوسط لمسار الحيوان، والجبهة أو الخلفية استناداً إلى موقعها بالنسبة لبصمات الكفة السابقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5 رسم توضيحي لمعلمات مشية تم تحليلها. (أ) إخراج مثال يبين تعريف بصمات الكفو وموقعها. تظهر الحواف الأصلية المكتشفة باللون الأسود. وتظهر الكفوف المكتشفة النهائية والمساحة التقريبية في الألوان التي تشير إلى تصنيف مخلب. في هذا الشكل، أصفر: الجبهة اليسرى، الأخضر: اليسار الخلفي، سماوي: الجبهة اليمنى، والأرجواني: الخلفية اليمنى. ومع ذلك، يمكن تغيير الألوان في البرنامج النصي Python استناداً إلى تفضيلات المستخدم. (ب) مؤامرة توضح معيارين زمنيين رئيسيين: مقدار الوقت الذي يكون فيه كل مخلب على اتصال بالأرض (مرحلة الموقف) وفي الهواء (مرحلة التأرجح). تشير الكتل الملونة إلى مرحلة الموقف وتشير المساحات البيضاء إلى مرحلة التأرجح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6 آثار هالوبيريدول على مشية. (أ) نتائج التجربة 1: الهالوبيريدول الجرعة العالية (هال_H)زيادة كبيرة في طول الخطوة وأقصى منطقة اتصال مقارنة بحالة المالحة (سال). (ب) أسفرت التجربة 2 عن أعراض باركنسون أكثر نموذجية؛ جرعة منخفضة haloperidol(هال L) زيادة كبيرة مدة الموقف والحد الأقصى لمنطقة الاتصال. (C) عند مقارنة الظروف المعالجة بالهالوبيريدول من كلتا التجربتين، زادت الهالوبيريدول الجرعة العالية من قاعدة الدعم، ومنطقة الاتصال القصوى والمسافة بين الأطراف مقارنة بحالة الجرعة المنخفضة. البيانات هي وسائل ± SEM، ن = 8. كانت الاختلافات بين العينات المقترنة t-test كما يلي: # p < 0.05, ## p < 0.01. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7 دقة التحليل الآلي. (أ) يختلف النظام الآلي اختلافا كبيرا عن التهديف اليدوي عند قياس نظام إدارة الأصول، وإن كان ذلك قد يرجع إلى الاختلافات في اختيار السنترويد اليدوي بدلا من أخطاء الكشف. (ب) لا يختلف النظام الآلي اختلافا كبيرا عن التهديف اليدوي لطول الخطوات. وتتفق نتائج الدقة هذه مع نتائج النظم الأخرى المتاحة. البيانات هي وسائل ± SEM، ن = 21. وكانت الاختلافات بين العينات المقترنة t-test كما يلي: # p < 0.05. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8 مقارنة المعلمات الزمنية. أنماط مشية زمنية لحيواني يُعالج بمحلول ملحي (A) وجرعة منخفضة من الهالوبيريدول (B). (ج) توضيح للاستجابة للهروب من فأر يُعطى جرعة عالية من الهالوبيريدول. كما هو الحال في الشكل 5، تشير الكتل الملونة عندما كان مخلب على اتصال مع الأرض (مرحلة الموقف) والمساحات البيضاء تشير إلى متى كان مخلب في الهواء (مرحلة سوينغ). المختصرات: FL, أماميّة يسار; HL ، واليسار الخلفي ، و FR، الجبهة اليمنى؛ الموارد البشرية، اليمنى الخلفية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

	التجربة 1				التجربة 2
	الاختبار 1	الاختبار 2	الاختبار 3	الاختبار 4	الاختبار 5	الاختبار 6	الاختبار 7	الاختبار 8
المجموعة ألف	HalH	سال	HalH	سال	سال	HalL	سال	HalL
المجموعة باء	سال	HalH	سال	HalH	HalL	سال	HalL	سال

الجدول 1 التصميم التجريبي. يوضح هذا الجدول التصميم التجريبي المستخدم في هذه الدراسة. استخدمنا تصميم داخل الموضوع حيث تم اختبار كل فأر في الهالوبيريدول جرعة عالية (هال_H)،جرعة منخفضة haloperidol (هال_L)والظروف المالحة (سال). قسمت جرذان كان داخل اثنان مجموعة; وموازنة الاختبار لبعض الوقت من اليوم وترتيب الشرط.

المعلمه	تعريف
طول خطوة	المسافة بين الاتصالات المتعاقبة من مخلب نفسه
طول الخطوة	المسافة بين الاتصالات المتعاقبة من الجبهة المعاكسة أو الكفوف الخلفية على طول محور اتجاه الحركة
قاعدة الدعم (BOS)	المسافة بين الجبهة المعاكسة المتعاقبة أو الكفوف الخلفية عمودي على محور اتجاه الحركة
الحد الأقصى لمنطقة الاتصال	الحد الأقصى للمساحة المكتشفة للطباعة الخلفية
مسافة الأطراف البينية	المسافة بين الجبهة ipsilateral والكفوف الخلفية
مدة الموقف	وكان طول الوقت مخلب في اتصال مع الأرض
مدة التأرجح	لم يكن طول الوقت مخلب على أرض الواقع
نسبة الموقف إلى التأرجح (SSR)	مدة الموقف/مدة التأرجح
سرعة منفصلة	طول خطوة / (مدة الموقف + مدة البديل) لمخلب
متوسط السرعة	متوسط السرعات المنفصلة في الفترة المستخدمة في التحليل
سرعة التغير	النسبة المئوية للتغيير في السرعات المنفصلة أثناء التشغيل
تشغيل السرعة	الوقت لعبور النفق / طول النفق

الجدول 2 وصف معلمات مشية. يصف هذا الجدول معلمات المشي الأكثر استخداماً; تلك المستخدمة في هذه الدراسة يشار إليها بالخط العريض.

Discussion

في هذه الدراسة، اختبرنا PrAnCER، وهو نظام تحليل مشية آلي جديد يستخدم مقاطع فيديو معززة على النقيض من التباين تم إنتاجها باستخدام أرضية شفافة لحجب جسم الحيوان ولإنتاج مطبوعات مخلب محددة بوضوح للكشف الآلي البسيط. PrAnCER يحدد بدقة بصمات مخلب وحساسة للتغيرات في وظيفة المحرك. استخدمنا PrAnCER لتقييم التعديلات مشية في نموذج هالوبيريدول الحاد من PD. على الرغم من أن haloperidol لم تحفز العجز الحركي المتوقع من نموذج PD قوية، كنا مع ذلك قادرة على إثبات أن PrAnCER يمكن الكشف بدقة عن التغيرات في أنماط مشية. وأخيراً، قمنا بتحديد دقة PrAnCER وأثبتنا أن قياسها لبارامترات المشي الرئيسية مماثل لقياس التهديف اليدوي.

في كل من الظروف المعالجة haloperidol، لاحظنا ارتفاع معدل حدوث سلوك التجميد (akinesia) تليها استجابة الهروب من تشغيل أو المحيطة إلى الأمام. في حين لوحظ akinesia في جرعة مماثلة (0.25 ملغ / كغ) في العديد من الدراسات^16,23, هذا السلوك المحيطة لا يتسق مع أعراض باركنسون نموذجية^{3,14,19, 24}. ومن المثير للاهتمام, وجدنا أن جرعة عالية العلاج haloperidol أدى إلى زيادة كبيرة في طول خطوة. وكان هذا الاستنتاج في البداية من المستغرب لأن نماذج هالوبيريدول أخرى من PD أظهرت انخفاضا في طول خطوة^3،19. ومع ذلك، فإنها منطقية في ضوء نمط السلوك "تستعد الهروب" التي وصفها دي ريك وآخرون (1980)، الذي أفاد أن الفئران تشغيل للهروب بعد فترات حركية، وأن مشيات عالية السرعة مثل تشغيل وحدود ترتبط مع زيادة خطوة طول^4،25 (الشكل8C). كما أدى العلاج بالجرعة العالية إلى زيادة كبيرة في منطقة الاتصال القصوى للالكفوف الخلفية. جرعة منخفضة العلاج haloperidol أدى إلى تعديلات مشية PD أكثر تميزا بما في ذلك زيادة كبيرة في مدة الموقف والحد الأقصى لمنطقة الاتصال (الشكل8A-B). قد تكون هذه النتائج انعكاسا لصلابة العضلات المرتبطة akinesia الناجمة عن هالوبيريدول.

على الرغم من السلوك غير عادية تستعد الهروب، كنا قادرين على إثبات أن PrAnCER يمكن في الواقع الكشف عن التعديلات في مشية. أظهرنا أنه في ظروف الإضاءة الصحيحة، يمكن أن تنتج أرضية شفافة صورة متناقضة للغاية ومفصلة من الكفوف. في هذه الدراسة، جعلنا أرضية شفافة شفافة من خلال تغطيتها مع القطيفة. ويمكن تحقيق نفس التأثير بوضع غطاء شفاف آخر، مثل ميلار، على أرضية شفافة. بدلا من ذلك، يمكن أن تكون الكلمة نفسها شفافة باستخدام، على سبيل المثال، زجاج شبكي متجمد. الكلمة شفافة وممر زجاج شبكي بسيط غير مكلفة ويمكن بناؤها في فترة ما بعد الظهر. لدينا نظام تحليل القائم على حافة الكشف هو مرونة لكثير من الاختلافات في الجهاز ويوفر عتبات قابل للتعديل لتكييف النظام مع مختلف الإعدادات، ونماذج المرض، أو الحيوانات الصغيرة مثل الفئران.

تم تغيير بعض تحليلات معلمة مشية من الصيغ التقليدية بسبب جوانب من الممشى. على سبيل المثال، يختلف أسلوبنا في حساب السرعة عن دراسات مشية أخرى. الكلمة شفافة جنبا إلى جنب مع إضاءة LED يحجب وجهة نظر الجسم، لذلك ليس من الممكن لتتبع موقف الجسم لحساب السرعة كما هو الحال عادة. لهذه الدراسة، تم حساب السرعة عن طريق تقسيم المسافة المقطوعة بين اثنين من الاتصالات من نفس مخلب في الوقت من الاتصال الأول إلى الاتصال الثاني. وبطبيعة الحال، يمكن استخدام صيغ أخرى. على سبيل المثال، إذا كانت هناك حاجة إلى قياس إجمالي للسرعة، يمكن تقسيم المسافة من متوسط مواقع الصدارة في بداية ونهاية التشغيل بمدة التشغيل.

يؤكد تحليلنا أنه على الرغم من عدم تطابقه مع التهديف اليدوي، فإن نظامنا الآلي يؤدي بدقة عالية وينشئ مقاييس موثوقة للمشية. تم تحسين الجهاز الموصوف هنا لتحليل بسيط ومنخفض التكلفة لوظيفة المحرك. ومع ذلك، يمكن إجراء عدة تعديلات من شأنها أن توسع من فائدة PrAnCER. أحد القيود على نظامنا هو أن الكلمة شبه شفافة، في حين يسمح الكشف مخلب ممتازة، يحجب محور جسم الحيوانات. على الرغم من أننا لم نجد أنه من الضروري، يمكن معالجة هذا عن طريق إضافة كاميرا علوية إلى النظام. وثمة تحسن آخر هو استخدام كاميرا فيديو ذات معدل إطارات أعلى. في حين كنا قادرين على الحصول على تقديرات متسقة من المعلمات الزمنية، يتم اختراق دقة هذه التدابير بمعدلات الإطار أقل من 100 إطارا في الثانية⁸. وإضافة كاميرا فيديو عالية السرعة لا يتطلب أي تغيير في برمجيات التحليل مع زيادة دقة ودقة التدابير الزمنية. بالإضافة إلى ذلك، العديد من أنظمة مشية أخرى استخدام مرآة لتسجيل وجهات النظر الجانبية والبطينية للفأر^2،8،13. إضافة هذه الميزة إلى جهازنا من شأنه أن يسمح بالقياس الكمي أكثر دقة للسرعة ومراقبة أفضل للسلوك أثناء التشغيل.

في هذه الدراسة، أظهرنا أن استخدام أرضية شبه شفافة يعزل بشكل فعال بصمات مخلب عن طريق منع رؤية الكائنات غير على اتصال مع أرضية الممشى. قمنا بتطوير نظام تسجيل تلقائي يستفيد من طباعة الكفو عالية التباين هذه لتحديد الكفوف بدقة. أظهرنا أن هذا النظام، PrAnCER، معلمات مشية كمية مع دقة مماثلة للنظم التجارية. قررنا أن إعطاء جرعة عالية من haloperidol زيادة طول خطوة وأقصى منطقة اتصال بالمقارنة مع المالحة. في حين أن هذا التغيير هو عكس ما كنا نتوقع، مزيد من الاستعراض للأدب الموجود يشير إلى أنه من المرجح أن يكون جزءا من سلوك الهروب لوحظ ردا على الإدارة الحادة من haloperidol. أدى العلاج الهالوبيريدول جرعة منخفضة في أعراض PD أكثر نموذجية مثل زيادة مدة الموقف والحد الأقصى لمنطقة الاتصال. نخلص إلى أنه في حين أن إدارة هالوبيريدول الجرعة العالية الحادة هي نموذج ضعيف لدراسة ضعف مشية المرتبطة PD، أظهرت دراستنا مع ذلك قدرة PrAnCER على الكشف بدقة عن التغيرات في وظيفة المحرك. في المستقبل، نأمل في مزيد من التحقق من صحة PrAnCER من خلال دراسة التغيرات الحركية في نماذج المرض الأخرى.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gait Walkway Apparatus
1/4" clear plexiglass	RISD 3D Store, Providence, RI		Approximate Price: $50 1 piece cut to 3 1/2" W x 36" L; 2 pieces cut to 4 1/2" W x 36" L Note: We made our walkway 36" long based off of an exisiting plexiglass table we had in house, it could easily be made longer if desired.
1/4" clear plexiglass	RISD 3D Store, Providence, RI		Approximate Price: $10 4 pieces, cut to 1" W by 4" L These will be used to keep the tunnel in place
10 series 80/20 framing pieces, 1" x 1" T-Slotted Profile	80/20 Inc.	1010-S	Approximate Price: $16 2 pieces cut to 36" L
12V Flexible LED Strip Lights, 16.4ft/5m LED Light Strips, Daylight White	Amazon		Approximate Price: $10
Bostik Blu-Tack Adhesive	Amazon		Approximate Price: $8
Clearprint 1000H drafting vellum, 16 LB cotton fiber	Dick Blick Art Supplies	11101-1046	Approximate Price: $50 Cut to 4" W x 36" L Note: This particular vellum comes as a roll; we kept it on the roll and cut it to 4" W. Mylar or frosted plexiglass could also be used in place of the vellum, but the camera software detection settings would need to be adjusted.
Logitech HD Pro Webcam C920, 1080p	Amazon		Approximate Price: $50
Mobile Laptop Computer Desk Cart Height-Adjustable	Amazon		Approximate Price: $40 Small table to place the animals' home cage on at the end of the walkway.
Plastic ramp	Pets Warehouse		Approximate Price: $6 Optional: Ramp to assist the animals descend into home cage
RetiCAM Tabletop Tripod with 3-Way Pan/Tilt Head	Amazon		Approximate Price: $30
SCIGRIP #16 solvent cement for acrylic - clear, medium bodied	Amazon		Approximate Price: $8
Plexiglass table			Approximate Price: $
15 series 80/20 framing pieces, 1.5" x 1.5" T-Slotted Profile	80/20 Inc.	1515	Approximate Price: $110 6 pieces cut to 36" L, 2 pieces cut to 12" With both ends tapped with standard 5/16-18 threads Framing for the plexiglass table top and table legs
15 series 3 Way - Light Squared Corner Connector	80/20 Inc.	14177	Approximate Price: $24 4 connectors To connect the table top and legs
1/4" clear plexiglass sheet	RISD 3D Store, Providence, RI		Approximate Price: $50 Cut at 15" W x 39" L
5/16-18 x 1" Button Head Socket Cap Screw	80/20 Inc.	3118	Approximate Price: $5 Quantity = 12
Deluxe Leveling Feet, 5/16-18 x 2"	80/20 Inc.	2194	Approximate Price: $50 Quantity = 4 For table legs
“T” Handle Ball End Hex Wrench, 3/16"	80/20 Inc.	6000	Approximate Price: $5