JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نصف المناعة شطيرة ELISA غير مباشرة لتحديد محتويات البروتين الجليكوبروتين المناعي في لقاحات داء الكلب. يستخدم هذا الاختبار جسم مضاد أحادي النسيلة (mAb-D1) يتعرف على مرجّات البروتين الجليكوبروتيني. وهو بديل لاختبار المعاهد القومية للصحة في الجسم الحي لمتابعة اتساق فاعلية اللقاح أثناء الإنتاج.

Abstract

يشجع الاهتمام العالمي المتزايد برفاهية الحيوان المصنعين ومختبرات المراقبة الوطنية على اتباع استراتيجية 3Rs لاستبدال الاختبارات الحيوانية المختبرية والحد منها وصقلها. ويوصى بتطوير نُهج المختبر على مستوى منظمة الصحة العالمية وأوروبا كبدائل لاختبار المعاهد القومية للصحة لتقييم فعالية لقاح داء الكلب. على سطح فيروس داء الكلب (RABV) الجسيمات، التشذيب من بروتين الجليكوبروتين تشكل المناعي الرئيسي للحث على الأجسام المضادة تحييد الفيروسية (VNAbs). تم تطوير اختبار ELISA ، حيث يتعرف تحييد الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAb-D1) على الشكل التقليمي للبروتين الجليكوبروتيني ، لتحديد محتويات بروتين التشذيب الأصلي المطوى إلى جانب إنتاج دفعات اللقاح. أظهر هذا الاختبار في قوة المختبر توافقجيد مع اختبار المعاهد القومية للصحة وتم العثور على مناسبة في التجارب التعاونية من قبل مصنعي لقاحات RABV وOMCLs. إن تجنب استخدام الحيوانات هدف يمكن تحقيقه في المستقبل القريب.

ويستند الأسلوب المعروض على المناعة شطيرة ELISA غير مباشرة باستخدام mAb-D1 الذي يتعرف على المواقع المضادة للجينات الثالث (aa 330 إلى 338) من بروتين الغليكوبروتين RABV التشذيب، أي مستضد RABV المناعي. يستخدم mAb-D1 لكل من الطلاء والكشف عن مغيري البروتين الجليكوبروتين الموجود في دفعة اللقاح. نظرًا لأن البيتوب معترف به بسبب خصائصه المطابقة ، فإن بروتين الجليكوبروتين المشوه المحتمل (أقل مناعة) لا يمكن التقاطه واكتشافه بواسطة mAb-D1. يتم احتضان اللقاح الذي سيتم اختباره في لوحة حساسة مع mAb-D1. يتم تحديد البروتينات الزرجة المنضمة RABV بإضافة mAb-D1 مرة أخرى ، وتسمى بيروكسيديز ثم يتم الكشف عنها في وجود الركيزة والكروموجين. وتتيح مقارنة الامتصاص المقيس للقاح المختبر واللقاح المرجعي تحديد محتوى البروتين الجليكوبروتيني المناعي.

Introduction

منذ أكثر من 50 عاما، يتم استخدام اختبار المعاهد القومية للصحة1 كوسيلة معيار الذهب لتقييم قوة لقاح داء الكلب قبل الإفراج عن دفعة. يتكون هذا الاختبار من تحصين داخل perperitoneal لمجموعات من الفئران مع اللقاح ليتم اختبارها تليها تحدي داخل الدماغ (IC) بعد 14 يوما مع معيار فيروس التحدي (CVS) سلالة من فيروس داء الكلب (RABV). يتم تقييم الفعالية من نسبة الفئران الناجية من تحدي IC. على الرغم من أن منظمة الصحة العالمية2 والدوائية الأوروبية3 لا تزال تتطلب اختبار المعاهد القومية للصحة لتقييم قوة اللقاح، ويعاني هذا الاختبار عدة عقبات: النتائج متغيرة للغاية4; ويستخدم RABV المعدية خلال التحدي وهذا يتطلب كل من المهارة التقنية وتدابير السلامة البيولوجية الصارمة؛ وتستخدم أعداد كبيرة من الحيوانات، وشدة التحدي يثير مخاوف أخلاقية خطيرة5. وقد تم تطوير اختلاف أقل حدة من هذا الاختبار: بعد أسبوعين من التحصين داخل الجبقية، لا تتحدى الفئران من قبل IC ولكن نزف واختبارها لوجود أجسام مضادة محددة تحييد RABV (VNAbs) في مصلها باستخدام اختبار تحييد المختبر. ومع ذلك، لا يزال هذا الاختبار يتطلب التضحية بعدد كبير من فئران المختبر على الرغم من أنه يستخدم بالفعل لللقاحات البيطرية6،,7 وقد تم النظر في اللقاحات البشرية8..

وحتى الآن، تشجع التوصيات الدوليةالـ 9 والأوروبيةالعشرة المصنعين ومختبرات المراقبة الوطنية (مختبرات مراقبة الطب الرسمية - OMCLs) على تنفيذ استبدال الاختبارات الحيوانية المختبرية والحد منها وصقلها، التي يشار إليها باسم استراتيجية 3Rs. كما عزز التوجيه الأوروبي 2010/63/EU (الساري منذ 2013/01/01) المتعلق بحماية الحيوانات ورفاهيتها القيود المفروضة على مصنعي اللقاحات والمختبرات المشاركة في مراقبة جودة لقاحات داء الكلب وكذلك في بحوث داء الكلب11. ونتيجة لذلك، أصبح الآن وضع النهج البديلة في المختبر والتحقق من صحتها واستخدامها أولوية. هذه ليست فقط سليمة أخلاقيا ولكن يمكن أيضا خفض تكاليف اختبار دفعة وتقصير الوقت للنتائج إلى ساعات بدلا من أسابيع3.

على سطح الجسيمات RABV، وبروتين الجليكوبروتين يعتمد شكل التشذيب12،13،14،15،16. في لقاح داء الكلب، يشكل هذا الشكل الأصلي التشذيب المناعة الرئيسية التي تحفز VNAbs17 في حين أن البروتينات الجليكوبروتينية الأحادية أو القابلة للذوبان أو المشوهة هي ضعيفة المناعة18،19. وبالتالي، فإن الحفاظ على مغيري البروتين الجليكوبروتين يُمثل عملية إنتاج اللقاح مؤشراً جيداً للحفاظ على الإمكانات المناعية المثلى. العديد من الطرق المناعية الكيميائية، مثل اختبار الأجسام المضادة ملزمة20،,21،والأشعة المناعية شعاعية واحدة (SRD) اختبار22 واختبار ELISA23،,24،,25،,26، 27,27 هي الموصى بها من قبل سلسلة التقرير التقني لمنظمة الصحة العالمية2 والدراسة الأوروبية3 لقياس محتوى المستضد في لقاحات داء الكلب. وتستخدم هذه من قبل الشركات المصنعة لرصد اتساق إنتاج اللقاحات وOMCL لتقييم التركيب ة متسقة من دفعات من اللقاحات البشرية28، حتى لو كان اختبار المعاهد القومية للصحة لا يزال يعتبر لقوة.

ومع ذلك ، فإن كل هذه الأساليب المناعية الكيميائية ليست متساوية. يتطلب اختبار SRD معالجة مسبقة قد تغير التشذيب المرتكز على الغشاء وينتج عنه شكل قابل للذوبان أو مشوه من بروتين الجليكوبروتين22،29. وبالتالي، فإن SRD ليست فعالة كثيرا في التمييز بين البروتينات الجليكوبروتينية المناعية وغير المناعية مما أدى إلى تقييم ناقص للمناعة من الكثير من اللقاح. وعلى النقيض من ذلك، فإن اختبار ELISA هو أكثر حساسية22،ويحافظ على الهيكل الأصلي للبروتين الجليكوبروتين، وأكثر ملاءمة لتحديد محتوى التشذيب مطوية أصلا من البروتين الجليكوبروتين. يمكن لاختبار ELISA استخدام إما الأجسام المضادة المضادة للبروتين أحادي النسيلة أو أحادية النسيلة أو أحادية النسيلة أو أحادية النسيلة أو الأجسام المضادة للبروتين الجليكوبروتين المنقاة أو المركزة مع كبريتات الأمونيوم. وقد أظهرت الدراسات التوافق الجيد بين اختبار المعاهد القومية للصحة ومحتوى المستضد الذي تقيمه ELISA في اللقاحات وخلصت إلى أن أساليب ELISA مناسبة لاختبار الفعالية المختبرية. هذا يدعو إلى أن اختبارات ELISA قد تكمل على الأقل أو حتى تحل محل اختبار المعاهد القومية للصحة4،26،27،30،31،32،33., اليوم، توصي الأدوية الأوروبية باستخدام المواد الكيميائية المصلية أو المناعية المعتمدة كبدائل لاختبار المعاهد القومية للصحة3. وقد أصبح التجنب الكامل للاستخدام الحيواني لفعالية اللقاح منظوراً واقعياً.

ويستند الأسلوب المعروض أدناه على غير مباشر ELISA شطيرة المناعة باستخدام الماوس أحادي الكلون استنساخ الأجسام المضادة (mAb-D1) الذي يتعرف على المواقع المضادة للطبيعة الثالث (aa 330 إلى 338) من التشذيب RABV الجليكوبروتين15،34. تم تطوير هذه الطريقة في البداية في مختبر معهد باستور26،30 ثم تم تحسينها والتحقق من صحتها من قبل الوكالة الوطنية للعلوم والديمقراطية ومختبر produits de santé (ANSM) ، أي OMCL الفرنسية4،33. ويستخدم mAb-D1 على حد سواء لتوعية لوحة وبعد ذلك للكشف عن مستضد القبض. وهذا يسمح بالقياس الكمي المحدد لتقليم البروتين الجليكوبروتيني، أي مستضد RABV المناعي. ويسمى mAb-D1 المستخدمة للكشف مع البيروكسيداز، والتي يتم الكشف عنها في وجود الركيزة والكروموجين. وتتيح مقارنة الامتصاص المقيس للقاح المختبر واللقاح المرجعي تحديد محتوى البروتين الجليكوبروتيني المناعي. ومن الجدير بالذكر أن نفس النوع من الفحص يمكن تطبيقها على mAbs مختلفة الاعتراف المواقع المضادة للطبيعة المختلفة من بروتين الغليكوبروتين RABV35. طريقة الحصول على وتنقية أو التركيز مع كبريتات الأمونيوم المضادة للجليكوبروتين الجلوبيولين المناعي الأرانب G (IgG) أو جلوبيولين الماوس أحادي النسيقد وقد وصفت على نطاق واسع سابقا36 جنبا إلى جنب مع طريقة لاقتران الأجسام المضادة مع البيروكسية37.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1- الاحتياطات الأمنية

ملاحظة: تنطبق هذه الطريقة على كل من RABV الحية واللقاح المعطلة.

  1. استخدام ممارسات المختبرات الجيدة وإجراءات السلامة.
  2. ارتداء معدات الحماية الشخصية الكافية (PPE) بما في ذلك معطف المتاح، والقفازات، وقناع، والنظارات، الخ.
  3. عندما يتم مُرتَك الفيروس الحي، استخدم خزانة أمان بيولوجي من الفئة الثانية.
    1. النظر في أي مواد على اتصال مع العينات (الكواشف، ومحلول الغسيل، وما إلى ذلك) كمادة معدية.
    2. علاج المواد الملوثة عن طريق غمر في محلول التبييض (2,5% من هيبوكلوريت الصوديوم) لمدة 30 دقيقة لإزالة التلوث.
  4. التعامل مع المواد الكيميائية وفقا للممارسة المختبرية الجيدة.

2- التحضير

  1. استخدام الكواشف الصف التحليلي ة حيثما كان ذلك ممكنا.
  2. إعداد حلول جديدة من المخزن المؤقت الطلاء / كربونات، عازل التخميل، المخفف والحواجز التدرجات(الجدول 1)،تصفية من خلال مرشحات 0.45 أو 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجة مئوية ليوم واحد قبل الاستخدام للحفاظ على نقاوتها التحليلية.
  3. السماح للكواشف بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة (+18 درجة مئوية إلى +25 درجة مئوية) قبل 30 دقيقة من الاستخدام والتجانس عن طريق الخلط اللطيف قبل الاستخدام.

3- التوعية بالصفائح الدقيقة

ملاحظة: استخدم 96 لوحة مناعية امتصاص جيد تم تحسينها لربط كميات عالية من الغلوبولين المناعي (على سبيل المثال، انظر جدول المواد).

  1. إلى كل بئر، إضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAb-D1) المخفف في المخزن المؤقت كربونات.
    ملاحظة: تم تحديد تركيز أمثل من حوالي 1 ميكروغرام/مل تجريبياً ويتوافق مع تخفيف تقريبي 1/2000 من mAb-D1 المنقى. يشار إلى هذا التركيز الموصى به لكل دفعة mAb-D1 ويجب التحقق منها بشكل دوري مع التحكم الإيجابي.
  2. تغطية لوحة مع فيلم لاصق واحتضان microplate لمدة 3 ساعة في 37 درجة مئوية في جو رطب.
  3. يستنشق بعناية ونقل محتوى البئر إلى مستلم يحتوي على 2,5% محلول هيبوكلوريت الصوديوم.
  4. عكس اللوحة الدقيقة واتركه يجف على ورقة ممتزة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقيقة.

4. ميكروبلايت التخميل

  1. إلى كل بئر، إضافة 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت التخميل.
  2. تغطية لوحة مع فيلم لاصق واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
  3. يستنشق بعناية ونقل محتوى البئر إلى مستلم يحتوي على 2,5% محلول هيبوكلوريت الصوديوم.
  4. عكس اللوحة الدقيقة واتركه يجف على ورقة ممتزة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.
    ملاحظة: يمكن استخدام اللوحة الدقيقة على الفور أو تخزينها مختومة في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر حتى الاستخدام.

5. ELISA القول

ملاحظة: لإنشاء منحنى التحكم في اللقاح المرجعي، الخطوة 5.3 غير مطلوبة؛ لتحصين اللقاح المختبر جميع الخطوات 5.1 إلى 5.6 ضرورية.

  1. غسل الصفيحة الدقيقة الحساسة
    1. إلى كل بئر، إضافة 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت الغسيل.
    2. يستنشق بعناية ونقل محتوى البئر إلى مستلم يحتوي على 2,5% محلول هيبوكلوريت الصوديوم.
    3. كرر الخطوات 5.1.1 و 5.1.2 خمس مرات أخرى لغسل لوحة التوعية على نطاق واسع.
    4. عكس اللوحة الدقيقة واتركه يجف على ورقة ممتزة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.
  2. تخفيف اللقاح المرجعي لمنحنى التحكم
    1. إعادة تشكيل اللقاح المرجعي (مستضد التحقق من الصحة لوط 09) في 1 مل من الماء المقطر المقابلة لتركيز 10 ميكروغرام /مل من بروتين بروتين فيروس داء الكلب.
    2. إعداد تخفيف عشرة أضعاف من اللقاح المرجعي المعاد تشكيلها في المخفف للوصول إلى 1 ميكروغرام / مل من بروتين فيروس داء الكلب.
    3. إعداد 6 مخففات متسلسلة ذات شقين لهذا اللقاح المرجعي في المخفف كما هو مبين في الجدول 1.
    4. توزيع 200 ميكرولتر من المخفف في مكررة (آبار 1H/2H) لتكون بمثابة عنصر تحكم فارغ.
    5. توزيع 200 ميكرولتر لكل بئر من كل تخفيف لقاح مرجعي في مكررة (الآبار G1/G2 إلى A1/A2).
  3. تخفيف اللقاح المختبر لمعايرته
    1. إعداد تخفيف عشرة أضعاف من اللقاح الذي تم اختباره في المخفف.
    2. إعداد 7 تخفيفات متسلسلة ذات شقين من اللقاح المختبر في المخفف كما هو مبين في الجدول 2.
    3. توزيع 200 ميكرولتر لكل بئر من كل تخفيف لقاح تم اختباره في مكررة (الآبار H3/H4 إلى A3/A4).
  4. حضانة / غسل لوحة ELISA
    1. تغطية microplate مع فيلم لاصق واحتضان لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
    2. إزالة الفيلم، نستنشق بعناية ونقل محتوى كل جيدا إلى المتلقي التي تحتوي على 2،5٪ محلول هيبوكلوريت الصوديوم.
    3. إلى كل إضافة جيدا 300 ميكرولتر من الغسيل المخزن المؤقت.
    4. يستنشق بعناية ونقل محتوى كل جيدا إلى المتلقي التي تحتوي على 2،5٪ محلول هيبوكلوريت الصوديوم.
    5. كرر الخطوتين 5.4.3 و 5.4.4 خمس مرات لإزالة المستضد غير المنضم والحفاظ على مرذب البروتين G المنضم إلى الأجسام المضادة المغلفة (mAb D1).
    6. عكس اللوحة الدقيقة واتركه يجف على ورقة ممتزة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.
  5. ملزمة من البيروكسيداز مب-D1
    1. توزيع 200 ميكرولتر لكل بئر من التخفيف الموصى به (1/2000) من mAb-D1 المسمى بيروكسيديز في الدلوين (تركيز تقريبي 1μg/mL). يشار إلى التركيز الموصى به لكل دفعة mAb-D1 ويجب التحقق منه بشكل دوري مع التحكم الإيجابي.
    2. تغطية microplate مع فيلم لاصق واحتضان لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
    3. إزالة الفيلم، نستنشق بعناية ونقل محتوى كل جيدا إلى المتلقي التي تحتوي على 2،5٪ محلول هيبوكلوريت الصوديوم.
    4. إضافة إلى كل بئر، 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت الغسيل.
    5. يستنشق بعناية ونقل محتوى كل جيدا إلى المتلقي التي تحتوي على 2،5٪ محلول هيبوكلوريت الصوديوم.
    6. كرر الخطوتين 5.5.4 و 5.5.5 خمس مرات لإزالة الأجسام المضادة المسماة بيروكسيديز غير المنضمة (mAb D1).
    7. عكس اللوحة الدقيقة واتركه يجف على ورقة ممتزة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.
  6. الوحي باستخدام الركيزة الكروموجين
    1. توزيع 200 ميكرولتر لكل بئر من محلول الركيزة الكروموجين.
    2. ختم لوحة صغيرة مع فيلم واحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. اللون الأصفر والبرتقالي يطور كثافة التي تتناسب مع كمية الأجسام المضادة التي تحمل علامة بيروكسيديز ملزمة (mAb D1).
    3. وقف التفاعل عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من وقف الحل في البئر.
    4. مسح دقيق الجزء السفلي من microplate ووضعه في مطياف لتحديد الكثافة البصرية (OD) في 492 نانومتر من جميع الآبار المستخدمة: التحكم السلبي (فارغة)، لقاح مرجعي ولقاح اختبارها.
    5. جمع بيانات OD كتنسيق ملف .xlss أو .xlsx للتحليل.
  7. رسم منحنى اللقاح المرجعي، محتوى بروتين الجليكوبروتين الزتيري، كدالة للكثافة البصرية (492 نانومتر)
    1. حساب متوسط OD عند 492 نانومتر لكل مكررة عند التخفيفات المختلفة لللقاح المرجعي (الآبار G1/G2 إلى A1/A2 في الجدول 2)
    2. طرح متوسط OD من فارغة (الآبار، H1/H2 في الجدول 2)من كل OD المتوسط محسوبة.
    3. رسم قيم OD الناتجة على المحور الرأسي (مقياس خطي) والتركيز المقابل في مغيرات البروتين الجليكوبروتين (نانوغرام/مل) على المحور الأفقي (مقياس لوغاريتمي).
    4. رسم المنحنى المرجعي عن طريق ربط النقاط(الشكل 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في المثال التالي يتم استخدام اللقاح المرجعي Lot 09 ، الذي يتكون من جزيئات فيروس داء الكلب المنشط النقي (سلالة اللقاح الكهروضوئي). وقد تم تحديد محتوى التشذيب الجليكوبروتين (10 ميكروغرام/مل) في هذا بعد تحديد الكمية الإجمالية للبروتينات الفيروسية (اختبار BCA) وتقييم النسبة المئو?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يقع epitope المعترف بها من قبل mAb-D1 في الموقع المضاد للكائنات المضادة للبروتين الجليكوبروتين RABV الذي ليس فقط المناعي المهيمنة لتحريض VNAbs ولكن أيضا تشارك في الضراوة العصبية، والإمراضية40،,41 والتعرف على مستقبلات42. هناك موقع آخر مضاد للوراثيا على طول ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يجب الاعتراف بالدكتورة سيلفي مورجيو والدكتور جان ميشيل شابسال لمشاركتهما الرئيسية في إنشاء مقياس ELISA على دفعات اللقاحات وتنظيم ورش عمل دولية ودراسات تعاونية. نشكر صابرينا كالي على القراءة النقدية للمخطوطة. وكان الدكتور بيير بيرين مسؤولا ً عن عزل وتوصيف mAb-D1. وقد تم دعم هذا العمل بشكل رئيسي من قبل معهد تمويل باستور.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Class II Biological Safety CabinetThermoFisher Scientific10445753if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORPThermoFisher Scientific439454good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume HoodThermoFisher Scientific12576606for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		Dutscher55303good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets)ThermoFisher Scientific15036
Microplate  single mode reader SunriseTECAN
Microplate shaker-incubatorDutscher441504
Microplate washer WellwashThermoFisher Scientific5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channelsThermoFisher Scientific4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL)ThermoFisher Scientific4700880

References

  1. Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 3rd Edition, WHO Geneva. 279-286 (1973).
  2. Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, WHO Geneva. 83-132 (2007).
  3. Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures. European Pharmacopoeia. , (2008).
  4. Gibert, R., Alberti, M., Poirier, B., Jallet, C., Tordo, N., Morgeaux, S. A relevant in vitro ELISA test in alternative to the in vivo NIH test for human rabies vaccine batch release. Vaccine. 31, 6022-6029 (2013).
  5. Stokes, W., et al. Report on the international workshop on alternative methods for human and veterinary rabies vaccine testing: state of the science and planning the way forward. Biologicals. 40 (5), 369-381 (2012).
  6. Krämer, B., Bruckner, L., Daas, A., Milne, C. Collaborative study for validation of a serological potency assay for rabies vaccine (inactivated) for veterinary use. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2, 37-55 (2010).
  7. Krämer, B., Kamphuis, E., Hanschmann, K. M., Milne, C., Daas, A., Duchow, K. A multi-dose serological assay suitable to quantify the potency of inactivated rabies vaccines for veterinary use. Biologicals. 41, 400-406 (2013).
  8. Fitzgerald, E. A., Gallagher, M., Hunter, W. S., Seligmann, E. B. Jr Use of the antibody assay in immunized mice for the determination of rabies vaccine potency. Developments in Biological Standardization. 40, 183-186 (1978).
  9. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. WHO activities towards the three Rs in the development and control of biological products. Replacement, reduction and refinement of animal experiments in the development and control of biological products. , Karger. 31-39 (1996).
  10. Behr-Gross, M. E., Spieser, J. M. Contributions of the European OMCL Network and Biological Standardisation Programme to animal Welfare. ALTEX-Alternatives to Animal Experimentation. 23, 21-28 (2006).
  11. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of European Union. L276, 33-79 (2010).
  12. Whitt, M. A., Buonocore, L., Prehaud, C., Rose, J. K. Membrane fusion activity, oligomerization and assembly of the rabies virus glycoprotein. Virology. 185 (2), 681-688 (1991).
  13. Gaudin, Y., Ruigrok, R. W., Tuffereau, C., Knossow, M., Flamand, A. Rabies virus glycoprotein is a trimer. Virology. 187, 627-632 (1992).
  14. Roche, S., Gaudin, Y. Characterization of the equilibrium between the native and fusion-inactive conformation of rabies virus glycoprotein indicates that the fusion complex is made of several trimers. Virology. 297 (1), 128-135 (2002).
  15. Desmézières, E., Maillard, A. P., Gaudin, Y., Tordo, N., Perrin, P. Differential stability and fusion activity of Lyssavirus glycoprotein trimers. Virus Research. 91 (2), 181-187 (2003).
  16. Koraka, P., et al. A recombinant rabies vaccine expressing the trimeric form of the glycoprotein confers enhanced immunogenicity and protection in outbred mice. Vaccine. 32 (36), 4644-4650 (2014).
  17. Wiktor, T., Gyorgy, E., Schlumberger, D., Sokol, F., Koprowski, H. Antigenic properties of rabies virus components. Journal of Immunology. 110, 269-276 (1973).
  18. Gamoh, K., Senda, M., Itoh, O., Muramatsu, M., Hirayama, N., Koike, R., et al. Use of ELISA for in vitro potency test of rabies vaccines for animal use. Biologicals. 24, 95-101 (1996).
  19. Dietzschold, B., Wiktor, T., Wunner, W., Varrichio, A. Chemical and immunological analysis of the rabies soluble glycoprotein. Virology. 124, 330-337 (1983).
  20. Fitzgerald, E., Green, O., Seligmann, E. Rabies vaccine potency testing: a comparison between the antibody-binding test and the NIH test. Symposia Series in Immunobiological Standard. 21, 300-307 (1974).
  21. Barth, R., Groβ-Albenhausen, E., Jaeger, O., Milcke, L. The antibody-binding test, a useful method for quantitative determination of inactivated rabies virus antigen. Journal of Biological Standardization. 9, 81-89 (1981).
  22. Ferguson, M., Schild, G. A single-radial-immunodiffusion technique for the assay of rabies glycoprotein antigen: application for the potency tests of vaccines against rabies. Journal of General Virology. 59, 197-201 (1982).
  23. Atanasiu, P., Perrin, P., Delagneau, J. F. Use of an enzyme immunoassay with protein A for rabies antigen and antibody determination. Developments in Biological Standardization. 46, 207-215 (1980).
  24. van der Marel, P., van Wezel, A. Quantitative determination of rabies antigen by ELISA. Developments in Biological Standardization. 50, 267-275 (1981).
  25. Adamovicz, P., Aguillon, F., David, A., Le Fur, R., Mazert, M. C., Perrin, P., et al. The use of various immunochemical, biochemical and biological methods for the analysis of rabies virus production in tissue cultures. Developments in Biological Standardization. 55, 191-197 (1984).
  26. Lafon, M., Perrin, P., Versmisse, P., Sureau, P. Use of monoclonal antibody for quantification of rabies vaccine glycoprotein by enzyme immunoassay. Journal of Biological Standardization. 13, 295-301 (1985).
  27. Thraenhart, O., Ramakrishnan, K. Standardization of an enzyme immunoassay for the in vitro potency assay of inactivated tissue culture rabies vaccines: determination of the rabies virus glycoprotein with polyclonal antisera. Journal of Biological Standardization. 17, 291-309 (1989).
  28. Council of Europe. Official Authority Batch release of Rabies vaccines Guideline. , PA/PH/OMCL (11) 173 DEF (2019).
  29. Ferguson, M., Seagroatt, V., Schild, G. A collaborative study on the use of single radial immunodiffusion for the assay of rabies virus glycoprotein. Developments in Biological Standards. 12, 283-294 (1984).
  30. Perrin, P., Morgeaux, S., Sureau, P. In vitro rabies vaccine potency appraisal by ELISA: advantages of the immunocapture method with a neutralizing anti-glycoprotein monoclonal antibody. Biologicals. 18, 321-330 (1990).
  31. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., Osterhaus, A. D. Rabies vaccine potency control: comparison of ELISA systems for antigenicity testing. Journal of Virological Methods. 58, 111-119 (1996).
  32. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., van Herwijnen, J., Osterhaus, A. D. Development and evaluation of alternative testing methods for the in vivo NIH potency test used for the quality control of inactivated rabies vaccines. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. , Karger. 137-145 (1996).
  33. Fournier-Caruana, J., et al. Inactivated rabies vaccine control and release: use of an ELISA method. Biologicals. 31, 9-16 (2003).
  34. Sissoëff, L., Mousli, M., England, P., Tuffereau, C. Stable trimerization of recombinant rabies virus glycoprotein ectodomain is required for interaction with the p75NTR receptor. Journal of General Virology. 86, 2543-2552 (2005).
  35. Morgeaux, S., et al. Replacement of in vivo human rabies vaccine potency testing by in vitro glycoprotein quantification using ELISA - Results of an international collaborative study. Vaccine. 35 (6), 966-971 (2017).
  36. Lafon, M. Techniques for the production, screening and characterisation of monoclonal antibodies. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 133-144 (1996).
  37. Perrin, P. Techniques for the preparation of rabies confugates. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 433-444 (1996).
  38. Barth, R., Diderrich, G., Weinmann, E. NIH test, a problematic method for testing potency of inactivated rabies vaccine. Vaccine. 6, 369-377 (1988).
  39. Jallet, C., et al. Chimeric lyssavirus glycoproteins with increased immunological potential. Journal of Virology. 73, 225-233 (1999).
  40. Dietzschold, B., et al. Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 80, 70-74 (1983).
  41. Seif, L., Coulon, P., Rollin, P., Flamand, A. Rabies virulence: effect on pathogenicity and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antigenic site III of the glycoprotein. Journal of Virology. 53, 926-934 (1985).
  42. Lafon, M. Rabies virus receptors. Journal of Neurovirology. 11, 82-87 (2005).
  43. Benmansour, A., Leblois, H., Coulon, P., Tuffereau, C., Gaudin, Y., Flamand, Y., Lafay, A. Antigenicity of the rabies virus glycoprotein. Journal of Virology. 65, 4198-4203 (1991).
  44. Rabies Vaccine Workshop Summary. , http://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/meetings/rabiesvaccwksp-2011/rabiesvaccinewkspsumm-30nov11.pdf (2011).
  45. De Mattia, F., et al. The Vaccines Consistency Approach Project: an EPAA initiative. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2015, 30-56 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159 ELISA mAb D1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved