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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí describimos una inmunocaptura indirecta de sándwich ELISA para determinar el contenido de glicoproteína inmunogénica en las vacunas contra la rabia. Esta prueba utiliza un anticuerpo monoclonal neutralizante (mAb-D1) que reconoce los recortadores de glicoproteína. Es una alternativa a la prueba in vivo de NIH para seguir la consistencia de la potencia de la vacuna durante la producción.

Resumen

La creciente preocupación mundial por el bienestar animal está alentando a los fabricantes y a los Laboratorios Nacionales de Control (OMCL) a seguir la estrategia 3R s para la sustitución, reducción y refinamiento de las pruebas en animales de laboratorio. Se recomienda el desarrollo de enfoques in vitro a nivel de la OMS y europa como alternativas a la prueba de NIH para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia. En la superficie de la partícula del virus de la rabia (RABV), los recortadores de glicoproteína constituyen el principal inmunogen para inducir anticuerpos neutralizantes virales (VNAbs). Se ha desarrollado una prueba ELISA, en la que los anticuerpos monoclonales neutralizantes (mAb-D1) reconocen la forma trimérica de la glicoproteína, para determinar el contenido de la glicoproteína trimérica plegada nativa junto con la producción de los lotes de vacunas. Esta prueba de potencia in vitro demostró una buena concordancia con la prueba de NIH y se ha encontrado adecuada en ensayos colaborativos por fabricantes de vacunas RABV y CLUFs. Evitar el uso animal es un objetivo alcanzable en un futuro próximo.

El método presentado se basa en una inmunocaptura de sándwich ELISA indirecta utilizando el mAb-D1 que reconoce los sitios antigénicos III (aa 330 a 338) de la glicoproteína RABV trimérica, es decir, el antígeno RABV inmunogénico. mAb-D1 se utiliza tanto para el recubrimiento como para la detección de recortadores de glicoproteína presentes en el lote de vacunas. Dado que el epítopo es reconocido debido a sus propiedades conformacionales, la glicoproteína potencialmente desnaturalizada (menos inmunogénica) no puede ser capturada y detectada por el mAb-D1. La vacuna a probar se incuba en una placa sensificada con el mAb-D1. Las glicoproteínas RABV recortadas enlazadas se identifican añadiendo el mAb-D1 de nuevo, etiquetado con peroxidasa y luego revelado en presencia de sustrato y cromógeno. La comparación de la absorbancia medida para la vacuna probada y la vacuna de referencia permite la determinación del contenido de glicoproteína inmunogénica.

Introducción

Desde hace más de 50 años, la prueba1 de NIH se utiliza como método estándar de oro para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia antes de la liberación por lotes. Esta prueba consiste en una inmunización intraperitoneal de grupos de ratones con la vacuna que se va a probar seguida de un desafío intracerebral (IC) 14 días después con la cepa del virus Challenge (CVS) del virus de la rabia (RABV). La potencia se evalúa a partir de la proporción de ratones que sobreviven al desafío IC. Aunque la OMS2 y la Farmacopea Europea3 todavía requieren la prueba de NIH para evaluar la potencia de la vacuna, esta prueba sufre varios obstáculos: los resultados son muy variables4; RABV infeccioso se utiliza durante el desafío y esto requiere tanto la habilidad técnica como estrictas medidas de bioseguridad; se utilizan un gran número de animales, y la gravedad del desafío plantea serias preocupaciones éticas5. Se ha desarrollado una variación menos grave de esta prueba: dos semanas después de la inmunización intraperitoneal, los ratones no son desafiados por IC, sino que se desangran y se analizan para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes RABV específicos (VNAbs) en su suero mediante una prueba de neutralización in vitro. Sin embargo, esta prueba todavía requiere sacrificar un gran número de ratones de laboratorio, aunque ya está en uso para las vacunas veterinarias6,7 y se ha considerado para vacunas humanas8.

A partir de ahora, tanto las recomendacionesInternacionales 9 como las10 Europeas alientan a los fabricantes y a los Laboratorios Nacionales de Control (Laboratorios Oficiales de Control de Medicina - Omcl) a implementar la estrategia de reemplazo, reducción y refinamiento de pruebas en animales de laboratorio, denominada estrategia 3R. La Directiva Europea 2010/63/UE (en vigor desde 2013/01/01) relativa a la protección y el bienestar de los animales también ha reforzado las limitaciones para los fabricantes de vacunas y los laboratorios que participan en el control de calidad de las vacunas contra la rabia, así como en la investigación de la rabia11. Como resultado, el desarrollo, la validación y el uso de enfoques in vitro alternativos se han convertido en una prioridad. Estos no sólo son éticamente sólidos, sino que también pueden reducir los costos de pruebas por lotes y acortar el tiempo para los resultados a horas en lugar de semanas3.

En la superficie de la partícula RABV, la glicoproteína adopta una forma trimrica12,13,14,15,16. En la vacuna antirrábica, esta forma trimérica nativa constituye el principal vNAbs inductor de inmunogenes17, mientras que las glicoproteínas monoméricas, solubles o desnaturalizadas son poco inmunogénicas18,19. Por lo tanto, la preservación de los recortadores de la glicoproteína a lo largo del proceso de producción de la vacuna es un buen indicador para la preservación de un potencial inmunogénico óptimo. Varios métodos inmunoquímicos, como la prueba de unión de anticuerpos20,21, la prueba22 de inmunodifusión radial única y la prueba ELISA23,24,25,26,27 son recomendados por la serie2 de informes técnicos de la OMS y la monografía europea3 para cuantificar el contenido de antígeno según las vacunas contra la rabia. Estos son utilizados por los fabricantes para monitorear la consistencia de la producción de vacunas y por la OMCL para evaluar la formulación consistente de lotes de vacunas humanas28,, incluso si la prueba de NIH todavía se considera para la potencia.

Sin embargo, todos estos métodos inmunoquímicos no son equivalentes. La prueba DeSC requiere un pretratamiento que pueda alterar los trimers anclados por membrana y dar lugar a una forma soluble o desnaturalizada de la glicoproteína22,,29. Por lo tanto, la SRD no es muy eficiente para discriminar entre glicoproteínas inmunogénicas y no inmunogénicas, lo que resulta en una evaluación imperfecta de la inmunogenicidad de un lote de vacunas. Por el contrario, la prueba ELISA es más sensible22, conserva la estructura nativa de la glicoproteína, y es más apropiada para determinar el contenido de los trimers plegados de forma nativa de glicoproteína. La prueba ELISA puede utilizar anticuerpos antiglicoproteínamono monoclonales de conejo o monoclonales de ratón purificados o concentrados con sulfato de amonio. Los estudios han demostrado una buena concordancia entre la prueba de NIH y el contenido de antígeno evaluado por ELISA en vacunas y han concluido que los métodos ELISA son adecuados para la prueba de potencia in vitro. Esto aboga por que las pruebas ELISA puedan al menos complementar o incluso reemplazar la prueba4,26,27,30,31,32,33., Hoy en día, la Farmacopea Europea recomienda el uso de ensayos serológicos o inmunoquímicos validados como alternativas a la prueba3de los NIH. La evasión completa del uso animal para la potencia de la vacuna se ha convertido en una perspectiva realista.

El método que se presenta a continuación se basa en una inmunocaptura de sándwich ELISA indirecta utilizando un clon de anticuerpos monoclonales de ratón (mAb-D1) que reconoce los sitios antigénicos III (aa 330 a 338) de la glicoproteína rabórica15,,34. Este método fue desarrollado inicialmente en el Institut Pasteur26,30 luego optimizado y validado por el laboratorio Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM), es decir, el laboratorio francés OMCL4,,33. El mAb-D1 se utiliza tanto para sensibilizar la placa como para detectar posteriormente el antígeno capturado. Esto permite la cuantificación específica de los recortadores de glicoproteína, es decir, el antígeno RABV inmunogénico. El mAb-D1 utilizado para la detección está etiquetado con peroxidasa, que se revela en presencia del sustrato y el cromógeno. La comparación de la absorbancia medida para la vacuna probada y la vacuna de referencia permite la determinación del contenido de glicoproteína inmunogénica. Es de destacar que el mismo tipo de ensayo se puede aplicar para diferentes mAbs que reconocen diferentes sitios antigénicos de la glicoproteína RABV35. El método para obtener y purificar o concentrarse con globulinas policlonales de conejo policlonal de sulfato de amonio G (IgG) o monoclonales han sido ampliamente descritos anteriormente36 junto con el método para conjugar anticuerpos con peroxidasa37..

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Protocolo

1. Precauciones de seguridad

NOTA: Este método es aplicable tanto a rabV vivo como a la vacuna inactivada.

  1. Utilice buenos procedimientos de práctica de laboratorio y seguridad.
  2. Use el equipo de protección personal (PPE) adecuado, incluyendo abrigo desechable, guantes, máscara, gafas, etc.
  3. Cuando el virus vivo esté valorado, utilice un armario de seguridad biológica de clase II.
    1. Considere cualquier material en contacto con las muestras (reactivos, soluciones de lavado, etc.) como material infeccioso.
    2. Tratar el material contaminado sumergiendo en la solución de lejía (2,5% de hipoclorito de sodio) durante 30 minutos para la descontaminación.
  4. Manipule los productos químicos de acuerdo con las Buenas Prácticas de Laboratorio.

2. Preparación

  1. Utilice reactivos de grado analítico siempre que sea posible.
  2. Preparar soluciones frescas del tampón de recubrimiento/buffer de carbonato, tampón de pasivación, diluyente y tampón de citrato(Tabla 1),filtrar a través de filtros de 0,45 o 0,22 m y almacenar a 4 oC durante un día antes del uso para preservar su pureza analítica.
  3. Permita que los reactivos alcancen la temperatura ambiente (+18 oC a +25 oC) 30 minutos antes del uso y homogeneizar mediante una mezcla suave antes del uso.

3. Sensibilización de microplacas

NOTA: Utilice 96 placas de inmunoensayo de adsorción de pozos que estén optimizadas para unir grandes cantidades de inmunoglobulinas (por ejemplo, véase Tabla de materiales).

  1. A cada pocto, añadir 200 l del anticuerpo monoclonal (mAb-D1) diluido en el tampón de carbonato.
    NOTA: Se ha determinado experimentalmente una concentración óptima de aproximadamente 1 g/ml que corresponde a una dilución aproximada de 1/2000 del mAb-D1 purificado. Esta concentración recomendada está indicada para cada lote mAb-D1 y debe verificarse periódicamente con el control positivo.
  2. Cubra la placa con una película adhesiva e incubar la microplaca durante 3 h a 37 oC en una atmósfera humidificada.
  3. Aspirar cuidadosamente y transferir el contenido del pozo a un recipiente que contenga 2,5% de solución de hipoclorito de sodio.
  4. Invierta la microplaca y déjela secar en un papel adsorbente a temperatura ambiente durante 5 min.

4. Pasivación de microplacas

  1. A cada pocto, agregue 300 s de la zona de influencia de pasivación.
  2. Cubrir la placa con una película adhesiva e incubar durante 30 min a 37 oC.
  3. Aspirar cuidadosamente y transferir el contenido del pozo a un recipiente que contenga 2,5% de solución de hipoclorito de sodio.
  4. Invierta la microplaca y déjela secar en un papel adsorbente a temperatura ambiente durante 1 min.
    NOTA: La microplaca se puede utilizar o almacenar inmediatamente sellada a -20 oC durante un máximo de 3 meses hasta su uso.

5. Ensayo ELISA

NOTA: Para establecer la curva de control de la vacuna de referencia, no se requiere el paso 5.3; para valorar la vacuna probada todos los Pasos 5.1 a 5.6 son necesarios.

  1. Lavado de la microplaca sensituada
    1. A cada pocto, añada 300 s de la tampón de lavado.
    2. Aspirar cuidadosamente y transferir el contenido del pozo a un recipiente que contenga 2,5% de solución de hipoclorito de sodio.
    3. Repita los pasos 5.1.1 y 5.1.2 cinco veces más para lavar extensamente la placa sensituada.
    4. Invierta la microplaca y déjela secar en un papel adsorbente a temperatura ambiente durante 1 min.
  2. Diluciones de la vacuna de referencia para la curva de control
    1. Reconstituir la vacuna de referencia (antígeno de validación Lote 09) en 1 ml de agua destilada correspondiente a una concentración de 10 g/ml de glicoproteína del virus de la rabia.
    2. Preparar una dilución de diez veces la vacuna de referencia reconstituida en el diluyente para alcanzar 1 g/ml de glicoproteína del virus de la rabia.
    3. Preparar 6 diluciones en serie dobles de esta vacuna de referencia en el diluyente, tal como se indica en la Tabla 1.
    4. Distribuir 200 l del diluyente por duplicado (pozos 1H/2H) para servir como control en blanco.
    5. Distribuir 200 ml por pozo de cada dilución de vacuna de referencia por duplicado (pozos G1/G2 a A1/A2).
  3. Diluciones de la vacuna probada para su valoración
    1. Preparar una dilución de diez veces la vacuna probada en el diluyente.
    2. Preparar 7 diluciones seriales dobles de la vacuna probada en diluyente como se indica en la Tabla 2.
    3. Distribuir 200 ml por pozo de cada dilución de vacuna probada por duplicado (pozos H3/H4 a A3/A4).
  4. Incubación/Lavado de la placa ELISA
    1. Cubra la microplaca con una película adhesiva e incubar durante 1 h a 37 oC.
    2. Retire la película, aspire cuidadosamente y transfiera el contenido de cada pozo a un recipiente que contenga un 2,5% de solución de hipoclorito de sodio.
    3. A cada pozo añadir 300 s de tampón de lavado.
    4. Aspirar cuidadosamente y transferir el contenido de cada pozo a un recipiente que contenga 2,5% de solución de hipoclorito de sodio.
    5. Repita los pasos 5.4.3 y 5.4.4 cinco veces para eliminar el antígeno no unido y conservar los recortadores de proteína G unidos al anticuerpo recubierto (mAb D1).
    6. Invierta la microplaca y déjela secar en un papel adsorbente a temperatura ambiente durante 1 min.
  5. Encuadernación de la peroxidasa conjugada mAb-D1
    1. Distribuir 200 ml por pozo de la dilución recomendada (1/2000) de mAb-D1 etiquetado con peroxidasa en diluyente (concentración aproximada de 1 g/ml). Se indica una concentración recomendada para cada lote mAb-D1 y debe verificarse periódicamente con el control positivo.
    2. Cubra la microplaca con una película adhesiva e incubar durante 1 h a 37 oC.
    3. Retire la película, aspire cuidadosamente y transfiera el contenido de cada pozo a un recipiente que contenga un 2,5% de solución de hipoclorito de sodio.
    4. Añadir a cada pocá, 300 s de la tampón de lavado.
    5. Aspirar cuidadosamente y transferir el contenido de cada pozo a un recipiente que contenga 2,5% de solución de hipoclorito de sodio.
    6. Repita los pasos 5.5.4 y 5.5.5 cinco veces para eliminar el anticuerpo etiquetado con peroxidasa no unido (mAb D1).
    7. Invierta la microplaca y déjela secar en un papel adsorbente a temperatura ambiente durante 1 min.
  6. Revelación usando un sustrato-cromógeno
    1. Distribuir 200 ml por pozo de solución de sustrato-cromógeno.
    2. Selle la microplaca con una película e incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min. Un color amarillo-naranja desarrolla la intensidad de la cual es proporcional a la cantidad de anticuerpo etiquetado peroxidasa (mAb D1).
    3. Detenga la reacción añadiendo 50 sl de solución de parada por pozo.
    4. Limpie cuidadosamente la parte inferior de la microplaca y colóquela en un espectrofotómetro para determinar la densidad óptica (OD) a 492 nm de todos los pozos usados: control negativo (en blanco), vacuna de referencia y vacuna probada.
    5. Recopilar datos OD como formato de archivo .xls o .xlsx para su análisis.
  7. Dibujar la curva de la vacuna de referencia, el contenido de glicoproteína trimérica, en función de la densidad óptica (492 nm)
    1. Calcular la DoD media a 492 nm para cada duplicado en las diferentes diluciones de la vacuna de referencia (pozos G1/G2 a A1/A2 en la Tabla 2)
    2. Restar la Do media del espacio en blanco (pozos, H1/H2 en el Cuadro 2) de cada Do media calculada.
    3. Trazar los valores oD resultantes en el eje vertical (escala lineal) y la concentración correspondiente en los trimers de glicoproteína (ng/mL) en el eje horizontal (escala logarítmica).
    4. Dibuje la curva de referencia uniendo puntos (Figura 1).

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Resultados

En el siguiente ejemplo se utiliza la vacuna de referencia Lote 09, que consiste en partículas purificadas del virus de la rabia inactivadas (cepa de vacuna PV). El contenido de los recortadores de glicoproteína (10 g/ml) en esto se ha establecido después de la determinación de la cantidad total de proteínas virales (prueba BCA) y la evaluación del porcentaje de la glicoproteína por electroforesis de gel de sDS-poliacrilamida. Alternativamente, se puede utilizar una vacuna de refer...

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Discusión

El epítopo reconocido por el mAb-D1 se encuentra en el sitio antigénico III de la glicoproteína RABV, que no sólo es inmunodominante para la inducción de VNAbs, sino que también participa en neurovirulencia, patogenicidad40,,41 y reconocimiento de receptores42. Hay otro sitio antigénico importante a lo largo de la glicoproteína, sitio II43, contra el cual se han aislado varios MAbs como mAb-WI-1112

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

La Dra. Sylvie Morgeaux y la Dra. Jean-Michel Chapsal deben ser reconocidas por su participación clave para establecer el ensayo ELISA sobre lotes de vacunas y para organizar talleres internacionales y estudios colaborativos. Agradecemos a Sabrina Kali por la lectura crítica del manuscrito. El Dr. Pierre Perrin fue responsable del aislamiento y caracterización de mAb-D1. Este trabajo ha sido apoyado principalmente por la financiación del Instituto Pasteur.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Class II Biological Safety CabinetThermoFisher Scientific10445753if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORPThermoFisher Scientific439454good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume HoodThermoFisher Scientific12576606for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		Dutscher55303good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets)ThermoFisher Scientific15036
Microplate  single mode reader SunriseTECAN
Microplate shaker-incubatorDutscher441504
Microplate washer WellwashThermoFisher Scientific5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channelsThermoFisher Scientific4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL)ThermoFisher Scientific4700880

Referencias

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