استخدام مجموعة مستضد الأنفلونزا الدقيقة لقياس اتساع الأجسام المضادة للمصل عبر الأنواع الفرعية للفيروس

Saahir Khan; Aarti Jain; Omid Taghavian; Rie Nakajima; Algis Jasinskas; Medalyn Supnet; Jiin Felgner; Jenny Davies; Rafael  Ramiro de Assis; Sharon Jan; Joshua Obiero; Erwin Strahsburger; Egest  J. Pone; Li Liang; D.  Huw Davies; Philip  L. Felgner

doi:10.3791/59973

Summary

نقدم بروتوكولًا لاستخدام مجموعة بروتين دقيقة تم إنشاؤها بواسطة طباعة مستضدات الأنفلونزا على الشرائح المغلفة بالنيتروسيلولوز لسبر المصل في نفس الوقت لعدة أنواع من الأجسام المضادة ضد أكثر من 250 مستضدًا من سلالات الفيروسات المختلفة، وبالتالي السماح بقياس اتساع الأجسام المضادة المصل عبر الأنواع الفرعية للفيروس.

Abstract

ولا يزال فيروس الأنفلونزا سبباً هاماً للوفيات في جميع أنحاء العالم بسبب الفعالية المحدودة لللقاحات المتاحة حالياً. ويتمثل أحد التحديات الرئيسية التي يواجهها تطوير لقاحات الأنفلونزا العالمية في التنوع الشديد في المضادات الصناعية الناجم عن الانجراف المضاد للجينات. ويتطلب التغلب على هذا التحدي أدوات بحثية جديدة لقياس اتساع الأجسام المضادة للمصل الموجهة ضد العديد من سلالات الفيروسات عبر أنواع فرعية مختلفة مضادة للجينات. نقدم هنا بروتوكولًا لتحليل اتساع الأجسام المضادة للمصل ضد سلالات فيروس الأنفلونزا المتنوعة باستخدام مجموعة بروتين دقيقة من مستضدات الأنفلونزا.

يتم بناء هذه الصفيف مستضد الأنفلونزا عن طريق طباعة الهيماغلوتينين النقي والمستضدات neuraminidase على غشاء المغلفة النيتروسيلولوزيباستخدام طابعة microarray. يتم احتضان السيرا البشرية على المصفوفة الدقيقة لربط الأجسام المضادة ضد مستضدات الأنفلونزا. يتم استخدام الأجسام المضادة الثانوية الكم نقطة مترافق للكشف في وقت واحد IgG وIgA الأجسام المضادة ملزمة لكل مستضد على المصفوفة الدقيقة. يتم قياس الربط الكمية للجسم المضاد كشدة الفلورة باستخدام صورة محمولة. وتظهر النتائج التمثيلية لتبين قابلية التحلل في قياس الأجسام المضادة للأنفلونزا ذات النوع الفرعي وعبر التفاعلية في السيرا البشرية.

بالمقارنة مع الأساليب التقليدية مثل ELISA، توفر الصفيف الدقيق مستضد الأنفلونزا نهج ًا متعدد الإنتاجية عالي الإنتاجية قادرًا على اختبار مئات السيرا لأنواع متساويات الأجسام المضادة المتعددة ضد مئات المستضدات في إطار زمني قصير، وبالتالي فقد التطبيقات في المراقبة المصلية وتطوير اللقاحات. ويتمثل القيد في عدم القدرة على التمييز بين الأجسام المضادة الملزمة وتحييد الأجسام المضادة.

Introduction

فيروس الأنفلونزا هو المسؤول عن فقدان 20 مليون سنة حياة سنويا ً بسبب الوفاة أو الإعاقة، بما في ذلك 1% من جميع الوفيات في جميع أنحاء العالم كل عام، مع آثار غير متناسبة على المسنين والسكان في المناطق المدارية والعالم النامي^1، ^2،³. وبالإضافة إلى عبء الأمراض الناجمة عن الأوبئة الموسمية، فإن ظهور سلالات جديدة من الأنفلونزا عن طريق إعادة التشكيل الجيني إما بشكل طبيعي في المضيفين المشتركين أو بشكل مصطنع للإرهاب البيولوجي يمكن أن يؤدي إلى أوبئة في جميع أنحاء العالم مع انتشار سريع وفتكا ً عالياً ⁴ ^, ^{5. في}حين أن العديد من لقاحات الأنفلونزا متوفرة حالياً، فإن فعاليتها محدودة بخصوصية النوع الفرعي^6،مما يخلق الحاجة إلى تطوير لقاحات الأنفلونزا العالمية التي تمنح مناعة طويلة الأمد ضد فيروس متعدد سلالات⁷.

ويتمثل أحد التحديات الرئيسية التي يواجهها تطوير لقاحات الأنفلونزا العالمية في التنوع الشديد في المضادات بين السلالات. إن خصوصية اللقاحات الحالية المضادة للجينات إلى جانب التباين المضاد للجينات في الفيروسات المتداولة تخلق عدم تطابق بين سلالات اللقاحات وسلالات الدوران. وهذا يمنح ميزة تطورية تفضل المزيد من الانجراف الوراثي بعيدا عن سلالات اللقاح خلال الوباء، والحد من فعالية اللقاح في كثير من الأحيان إلى أقل من 50٪⁸^،⁹. مصدر إضافي لعدم التطابق المضاد للجينات هو الطفرات الفيروسية التكيفية للبيض التي يتم توليدها أثناء تصنيع اللقاح، والتي تؤدي إلى الأجسام المضادة التي تربط بشكل سيء بالفيروسات المتداولة¹⁰و11 .

وسيتطلب التغلب على هذا التحدي المتمثل في التنوع العالي في مجال المضادات الجينات أدوات بحثية جديدة لتوصيف اتساع الاستجابات المناعية الموجودة من قبل والناجمة عنها عبر المتغيرات المضادة للجينات ذات الصلة سريرياً في عينات المصل والغشاء المخاطي. تقتصر الأساليب المتاحة حاليًا، بما في ذلك تثبيط الهيماغلوتين (HAI)، والتحييد الجزئي (MN)، وELISA التقليدي، على الكشف عن الأجسام المضادة ضد سلالة فيروس واحدة في كل مرة، وبالتالي فإن استخدامها للكشف عن أنواع متساوي الأجسام المضادة المتعددة ضد سلالات فيروس متعددة بسرعة يستنفد عينة السريرية المتاحة والموارد المختبرية. وعلاوة على ذلك، تتطلب هذه الوحدة والحركة ثقافة فيروس حية لا تتوفر إلا في مختبرات متخصصة.

microarrays البروتين، التي يحتمل أن تتكون من ما يصل إلى الآلاف من المستضدات المطبوعة على الشرائح المغلفة النيتروسيلولوز كما هو مبين في الشكل1، يمكن ملء هذه الحاجة¹². ويمكن إنتاج هذه المصفوفات الدقيقة وبحثت بطريقة عالية الإنتاجية مع استهلاك كميات صغيرة من العينات السريرية لتحديد مستويات isotype/subtype الجسم المضادة الكمية ضد كل مستضد الفردية على مجموعة. وقد تم تطبيق هذا النهج لاكتشاف مستضد لتطوير التشخيص واللقاحات ضد مسببات الأمراض المعدية متعددة¹³. وحتى الآن، أنتجنا مُرائف البروتين الدقيقة لأكثر من 35 ممرضة بما في ذلك أكثر من 60,000 من مجموع البروتينات المعبر عنها واستخدمناها للتحقيق في أكثر من 30,000 سيرا بشرية من الأفراد المصابين والسيطرة. وقد جعلت منصة التصوير المحمولة التي تم تطويرها مؤخرًا لشرائح المصفوفة الدقيقة هذه المنهجية أكثر سهولة للمستخدم النهائي¹⁴.

بناء على أعمال واسعة النطاق السابقة من قبل العديد من المساهمين في مجال¹⁵^،¹⁶^،¹⁷^،¹⁸^،¹⁹، تم مؤخرا تطوير ميكروراي بروتين الأنفلونزا التي تحتوي على أكثر من 250 الهيماغلوتينين النقي (HA) المتغيرات المضادة للجينات مع تمثيل جميع الأنواع الفرعية 18¹²^،²⁰. وباستخدام هذه المنهجية، ثبت أن عدوى الأنفلونزا الطبيعية تولد أجساماً مضادة من نوع IgG وIgA ذات تفاعل واسع النطاق ضد الأنواع الفرعية المرتبطة بعلم الوراثة من نوع HA، في حين أن التطعيم ضد الأنفلونزا العضلية لم يولد سوى نوع فرعي محدد من نوع IgG. الأجسام المضادة²¹. ومع ذلك، فقد تبين أن إضافة عاقد ينشط مستقبلات شبيهة بالرسوم للقاحات الأنفلونزا لتوسيع استجابة الأجسام المضادة IgG التي تم الحصول عليها عبر الأنواع الفرعية HA في الدراسات الحيوانية²².

وتستخدم هذه المجموعة الدقيقة حاليا ً للتحقيق في السيرا التي تم جمعها من دراسة أترابية مستقبلية لطلاب الجامعات الذين تم متابعتهم بسبب عدوى الأنفلونزا. هنا، يتم الإبلاغ عن منهجية الصفيف مستضد الأنفلونزا مع إظهار إمكانية استنساخ الأنواع الفرعية وعبر رد الفعل في مجموعة فرعية من العينات من هذه الدراسة.

Protocol

ويتم التعامل مع جميع السيرا البشرية والتخلص منها وفقا للبروتوكولات المؤسسية المعتمدة للسلامة البيولوجية باستخدام المعدات الشخصية الواقية. وتلقى جميع موظفي المختبرات المشاركين في هذا البروتوكول تدريبا في مجال السلامة الأحيائية وأخلاقيات البحوث.

1- إنتاج المستضدات الدقيقة للأنفلونزا

تصميم والحصول على مجموعة مستضد للصفيف
1. الحصول على مستضدات البروتين المعبر عنها وتنقيتها كمسحوق lyophilized.
طباعة مستضدات على شرائح الصفيف الصغير
1. إعادة تشكيل كل مستضد للوفيلية إلى تركيز 0.1 ملغ/مل في محلول الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) مع 0.001٪ توين-20 (T-PBS). نقل 10 ميكرولتر من كل مستضد المعاد تشكيله إلى الآبار الفردية من لوحة مسطحة القاع 384 جيدا غير المعالجة.
2. طباعة مستضدات باستخدام طابعة microarray (الطابعة microarray المستخدمة في هذه الدراسة لم تعد متاحة تجاريا، انظر المناقشة)مع دبابيس اكتشاف microarray منخفضة الحجم التي يستنشق مستضد في قناة العينة وإيداع عن طريق مباشرة الاتصال والعمل الشعرية على 16 وسادة النيتروسيلولوز المغلفة الشرائح الزجاجية.
  1. برنامج برنامج الطباعة (على سبيل المثال، Gridder) مع تكوين لوحة المصدر ومعلمات الطباعة.
    1. استخدم القائمة المنسدلة لتحديد اسم نوع اللوحة التي سيتم استخدامها مع أسلوب الطباعة هذا. لهذه الدراسة، استخدم لوحة مسطحة القاع 384-well غير المعالجة.
    2. حدد مربع النص بجوار عدد اللوحات واكتب عدد لوحات العينات التي سيتم استخدامها في بروتوكول الطباعة هذا. لهذه الدراسة، استخدم 1 لوحة.
    3. حدد تكوين دبوس لاستخدامه مع هذا الأسلوب. لهذه الدراسة، استخدم تكوين 8 دبوس.
    4. تأكد من أن إزاحات الأصل هي المسافات (في الاتجاهات X وY) بين أصل الشريحة (الذي يتم معايرة في القسم الإداري) والموقع حيث ستبدأ دبابيس الطباعة في الطباعة على الشرائح.
    5. باستخدام علامة التبويب "تصميم الصفيف"، قم بتعريف حجم صفائف وشكلها (تباعد النقاط وعدد النقاط لكل صفيف فرعي). لهذه الدراسة، طباعة 324 البقع (180 ميكرومتر قطرها مع تباعد 300 درجة مئوية) على الشرائح 16 لوحة في شكل 18x18 باستخدام 8 دبابيس.
    6. حدد المعلمات لكيفية التقاط دبابيس الطباعة والاستغناء عن العينات. لهذه الدراسة، كل دبوس يستنشق 250 نمل من محلول مستضد ويطبع 1 نمل على كل من 40 البقع (ما مجموعه 20 الشرائح لجميع دبابيس 8)
    7. تكوين بروتوكول تنظيف دبوس وبروتوكول النشاف. لهذه الدراسة، يتم غمس كل دبوس مستضد، في ddH معقمة₂O في حاوية غسل سونيكاتد، ومن ثم يستنشق مستضد المقبل.
    8. تعريف التسلسل الذي تتم طباعة كتل العينة على الشرائح. سيقوم برنامج الصفيف بإنشاء ملف فهرس شبكة مشروح (.gal) لوصف ترتيب المستضدات داخل كل صفيف.
      ملاحظة: يتم استخدام الصف العلوي للfiducials (مع الفلورة في جميع الأطوال الموجية المستخدمة في التصوير، على سبيل المثال، مزيج من Qdot 585 نانومتر streptavidin المتقارنة وQdot 800 نانومتر streptavidin المتقارنة في هذه الدراسة) لتوجيه الشبكات أثناء التصوير. لأشواط الطباعة الطويلة، يمكن إعادة تعليق المستضدات في لوحة المصدر بشكل دوري عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ثم الطرد المركزي، أو لوحة مصدر جديدة يمكن إعدادها واستخدامها.
3. ضع الشرائح الصغيرة غير المسبارة في صندوق مقاوم للضوء وابقفي خزانة مجفف ة في درجة حرارة الغرفة للتخزين على المدى الطويل.
  ملاحظة: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتاً إلى أجل غير مسمى عند هذه النقطة.
إجراء فحص لمراقبة الجودة (يتطلب علامات بولي هيستيدين)
1. قم بإرفاق الشريحة بغرف التدقيق وإعادة الهيدرات مع المخزن المؤقت للحظر كما هو موضح في الخطوة 2.1.1-2.1.2 والموضحة في الشكل 2.
2. تمييع الماوس أحادي ة النسيلة بولي له الأجسام المضادة 1:100 في المخزن المؤقت حظر 1x تمت تصفيتها.
  ملاحظة: إذا كانت مستضدات البروتين غير المنقي (على سبيل المثال، معبراً عنها في النسخ في المختبر ونظام الترجمة) تستخدم مباشرة لطباعة المصفوفات الدقيقة، أضف مكونات نظام تعبير البروتين (على سبيل المثال، E. coli lysate) بنسبة 1:10 مع نسبة 1:10 مع حجب العازلة المستخدمة لتخفيف المصل من أجل منع أي الأجسام المضادة الموجهة ضد هذه المكونات.
3. إضافة 100 درجة مئوية من الجسم المضاد للبولي المخفف له إلى كل غرفة الشريحة التي تحتوي على لوحة صفيف بعد الطموح والحضانة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية على شاكر. اغسل 3x باستخدام المخزن المؤقت T-TBS كما هو موضح في الخطوة 2.2.1. تخفيف البيوتين المترافق الماعز المضادة للماوس IgG الأجسام المضادة الثانوية 1:200 في حظر العازلة، إضافة 100 درجة مئوية لكل بئر بعد الطموح، وحضانة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر. اغسل 3x باستخدام المخزن المؤقت T-TBS.
4. تخفيف Qdot 585 نانومتر streptavidin المتقارن ة إلى 4 nM في حظر العازلة، إضافة 100 درجة مئوية لكل بئر بعد الطموح، وحضانة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر. اغسل 3x باستخدام المخزن المؤقت T-TBS، ثم مرة واحدة باستخدام المخزن المؤقت TBS (بدون توين).
5. فك الشرائح وتحديدها كما هو موضح في الخطوات 2.2.5 - 3.1.2.
  ملاحظة: يجب أن تحتوي مستضدات البروتين له₁₀ علامات لاستخدام هذا البروتوكول مراقبة الجودة. بدلاً من ذلك، إذا تم تضمين علامة مختلفة، يمكن إجراء فحص مراقبة الجودة مع الأجسام المضادة أو ligand لتلك العلامة.

2. التحقيق سيرا للأجسام المضادة للأنفلونزا باستخدام المصفوفات الدقيقة

حضانة سيرا على المصفوفات الدقيقة لربط الأجسام المضادة
1. قم بإرفاق شرائح الصفيف الصغير بالغرف باستخدام القصاصات ووضعها في إطارات كما هو موضح في الشكل 3.
  ملاحظة: تجنب دائمًا لمس لوحة الصفيف الدقيقة باليدين والأدوات. تأكد من أن الشرائح موجهة مع الجانب وسادة حتى والشق الصغير في الزاوية اليمنى العليا.
2. إعادة ترطيب الشرائح microarray مع 100 درجة مئوية لكل بئر من المخزن المؤقت حجب 1X المصفاة، ومخفف المصل 1:100 في 100 ميكرولتر من العازلة حظر (يمكن استخدام لوحات 96 جيدا غير المعالجة أو 2 أنابيب مل). قم باحتضان كل من الشرائح الدقيقة المعاد ترطيبها في الإطارات المغطاة والسيرا المخففة بشكل منفصل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الهزاز المداري عند 100-250 دورة في الدقيقة. تنفيذ جميع خطوات الحضانة اللاحقة بالمثل على شاكر.
  ملاحظة: ينبغي أن تُقتبس سيرا وتُجمَّد عند -80 درجة مئوية للتخزين الطويل الأجل لتقليل دورات التجميد والذوبان إلى أدنى حد، وينبغي أن تُمزج وتُفصل بالطرد المركزي لإزالة الجسيمات قبل استخدامها. مراقبة غرف الشريحة بعناية أثناء وبعد هذه الخطوة للكشف عن أي تسرب يتطلب إعادة تجميع غرف الشريحة.
3. باستخدام نصائح ماصة متصلة خط فراغ مع قارورة جمع الثانوية، يستنشق بعناية حجب العازلة من زاوية كل غرفة دون لمس منصات. تنفيذ كافة خطوات الطموح اللاحقة بشكل مماثل. إضافة سيرا المخففة إلى منصات بسرعة بعد الطموح من أجل عدم السماح منصات لتجف.
4. ضع الإطارات المغطاة في صواني داخل حاوية ثانوية محاطة بمناشف ورقية رطبة ومختومة لمنع التبخر. حضانة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية على هزاز هزاز (بدلا من ذلك، يمكن حضانة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر المداري في 100-250 دورة في الدقيقة).
الأجسام المضادة المصل ملزمة التسمية مع الكم نقطة المترافق الأجسام المضادة الثانوية
1. يستنشق سيرا من الغرف بعناية كما هو موضح أعلاه، إضافة 100 ميكرولتر لكل بئر من المنطقة العازلة T-TBS (20 mM Tris-HCl، 150 mM NaCl، 0.05٪ توين-20 في DdH₂O المعدلة إلى درجة الحموضة 7.5 وتصفيتها، يمكن الحصول عليها تجاريا)، وحضانة لمدة 5 دقائق على شاكر المداري في شاكر المدارية 100-250 دورة في الدقيقة. كرر هذه الخطوة غسل ما مجموعه 3X (يتم تنفيذ جميع خطوات الغسيل اللاحقة بالمثل).
2. إعداد خليط من الأجسام المضادة الثانوية المخففة إلى 1 ميكرومتر في سد العازلة ومزيج تماما عن طريق الأنابيب قبل وأثناء الاستخدام للحفاظ على التجانس.
  ملاحظة: للحفاظ على قابلية تكرار الاختبار، يجب استخدام نفس الدفعة من كل جسم مضاد ثانوي لجميع تجارب التحقيق التي من المقرر إجراء مقارنة كمية للبيانات عبر التجارب. قد يحتاج التركيز المحدد للجسم المضاد الثانوي إلى أن يكون متنوعًا وفقًا للتقارب؛ اتبع بروتوكولات الشركة المصنعة كلما كانت متاحة.
3. يستنشق العازلة من الغرف بعد الغسيل النهائي، إضافة 100 درجة مئوية لكل بئر من خليط الأجسام المضادة الثانوية، وحضانة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر.
4. قم باستنشق خليط الأجسام المضادة الثانوي يغسل 3x مع المخزن المؤقت T-TBS، ثم يغسل مرة واحدة مع المخزن المؤقت TBS (بدون توين).
5. الشرائح microarray dissemble من الغرف بعناية لتجنب لمس منصات، شطف بلطف مع ddH₂O تصفيتها، وتجف عن طريق وضع في أنابيب 50 مل والطرد المركزي في 500 × غرام لمدة 10 دقائق.
6. ضع الشرائح الدقيقة المسبارية في صندوق مقاوم للضوء وابق في خزانة مجفف في درجة حرارة الغرفة للتخزين على المدى الطويل.
  ملاحظة: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتاً لمدة تصل إلى أسبوع واحد عند هذه النقطة.

3. كمية الأجسام المضادة ملزمة للمستضدات داخل microarray

تصور الشرائح microarray وكمية كثافة الفلورة بقعة لقياس ربط الأجسام المضادة
1. الحصول على صور من الشرائح microarray باستخدام الصور المحمولة مع البرامج المضمنة.
  1. في علامة التبويب تكوين الصور، حدد تكوين الشريحة المناسب. لهذه الدراسة، استخدم شرائح 16 لوحة.
  2. في علامة التبويب التحكم في الصورة، حدد قناة الفلورسنت المناسبة، وقم بضبط الكسب ووقت التعرض ووقت الاكتساب استنادًا إلى تفاعل السيرا للحصول على الصور المثلى. لهذه الدراسة، كانت قنوات الفلورسنت لIgA وIgG 585 نانومتر و 800 نانومتر على التوالي، وكانت إعدادات التصوير كسب 50، وقت التعرض من 500 مللي ثانية، ووقت الاقتناء من 1 ثانية.
  3. انقر على التقاط لبدء عملية الحصول على الصورة.
    ملاحظة: يمكن إعادة تصوير الشرائح Microarray في إعدادات متعددة دون تدهور الإشارة طالما يتم تخزينها مظلمة وجافة. يمكن استخدام أنظمة التصوير الأخرى إذا كانت متوافقة مع الشرائح.
2. الكشف عن بقع الصفيف باستخدام الشبكات الموجهة على أساس علامات fiducial وقياس كثافة بقعة كمتوسط لكثافة بكسل ناقص الخلفية تقاس حول البقع. تنفيذ خوارزمية القياس الكمي هذه في دفعة باستخدام برنامج الصور المضمنة التي تستخدم ملف .gal التي تم إنشاؤها في الخطوة 1.2.2 لتوصيل كثافات موضعية بالمستضدات الفردية على كل صفيف ميكروي.
  1. في لوحة معلومات الملف، قم بتحميل الملف .gal عن طريق التحديد من المجلد الخاص به على الكمبيوتر، وحدد المجلد حيث يتم حفظ ملفات إخراج التحليل في المقطع خيارات التحليل.
  2. في علامة التبويب التحكم في الصورة، افتح إحدى الصور التي تم الحصول عليها ليتم تحديدها كمياً وحدد الزر تلقائي في الزاوية العلوية اليمنى.
  3. في المقطع تحليل الصفيف في الزاوية اليمنى السفلى، قم بإنشاء قالب fiducial كما هو موضح من قبل البرنامج.
  4. انقر على تحليل الدفعات، وحدد المجلد الذي يحتوي على الصور المراد قياسها كمياً، وحدد القالب fiducial الذي تم إنشاؤه في الخطوة السابقة. يقوم البرنامج بتحليل كل صورة وتحديد كثافة البقعة.
    ملاحظة: ستقوم هذه الخطوة بإنشاء ملف .csv يحتوي على كثافات موضعية قياس الأجسام المضادة داخل كل عينة المصل التي تربط كل مستضد فردي على المصفوفة الدقيقة التي يمكن التلاعب بها فيما بعد في معالجة جدول البيانات أو برامج التحليل.
3. تحليل البيانات الخام لمقارنة ربط الأجسام المضادة عبر المستضدات وعبر عينات المصل. لهذه الدراسة، تم مقارنة الأجسام المضادة IgA وIgG تقاس على 585 نانومتر و 800 نانومتر كثافة بقعة الفلورسنت عبر جميع المستضدات بين 2 أشواط مستقلة من التجربة باستخدام شرائح مختلفة في أيام مختلفة، وتم إجراء تحليل الارتباط إلى قياس قياس استنساخ.
  ملاحظة: بالنسبة للبروتينات غير المنقية المطبوعة كخليط تعبير، يجب أن يبدأ تحليل البيانات بطرح خلفية لا تتحكم في الحمض النووي.

النتائج

وكدليل على البروتوكول، تم تحديد خط الأساس من 16 فرداً ضمن دراسة أترابية مستقبلية لطلاب الجامعات تبعتهم الإصابة بعدوى الأنفلونزا على الميكروري مستضد الأنفلونزا. ولإثبات إمكانية تكرار هذه العينات، تم فحصها مرتين، على شرائح مختلفة وأيام مختلفة.

لهذه الدراسة، تم الحصول على مستضدات الأنفلونزا النقية التي تحتوي على علاماته العشرة من البائع التجاري (انظر جدولالمواد) والمتعاونين. وتشمل هذه المستضدات 251 مستضدات HA الإجمالية، مع 63 مجالات الرأس كروي (HA1) و 186 البروتينات كاملة الطول (HA0)، بما في ذلك 96 البروتينات HA0 أحادية اللون و 90 البروتينات HA0 الانتهازية التي تحتوي على تقليم تنصهر ("فولون") المجال²³. يتم تضمين قائمة كاملة من المستضدات والضوابط المستخدمة في هذه الدراسة كملف تكميلي. لهذه الدراسة، كانت الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة الماعز المضادة للإنسان IgG المترافقة مع نقطة الكم التي تنبعث في 800 نانومتر (GAH-IgG-Q800) والماعز المضادة للإنسان IgA المترافقة إلى نقطة الكم تنبعث في 585 نانومتر (GAH-IgA-Q585) للكشف عن متعددة من الأجسام المضادة IgG وIgA كما في الشكل 3. تمت مقارنة IgG وIgA الأجسام المضادة ملزمة لأنواع فرعية مختلفة والأشكال الجزيئية من مستضدات HA الأنفلونزا لسيرا التي تم الحصول عليها من المجموعة السريرية المذكورة أعلاه.

تظهر خريطة الحرارة الناتجة في الشكل 4 مع تمثيل رسومي في الشكل 5. في هذه الأرقام، يتم تسمية الأنواع الفرعية ذات الصلة سريرياً فقط مع تمثيل عال على الصفيف لتوفير مساحة، مع "+" التي تشير إلى جميع الأنواع الفرعية المتبقية من عدد أعلى، والأنواع الفرعية الصغيرة أو الأقل تمثيلاً بشكل جيد المدرجة حسب الطلب (على سبيل المثال، H2 بين H1 وH3). يتم تضمين قائمة كاملة من السلالات والأنواع الفرعية على الصفيف كملف تكميلي. وتبين هذه البيانات أن الأجسام المضادة للمجموعة الرئيسية من HA هي نوع فرعي محدد مع كمية عالية من الأجسام المضادة المتوقعة للسلالات السائدة سريريا (H1N1، H3N2، و B) وانخفاض كمية الأجسام المضادة إلى سلالات أخرى. ومع ذلك، الأجسام المضادة إلى HA كله، والذي يتضمن مجال ساق، هي أكثر عبر رد الفعل عبر الأنواع الفرعية، ويبدو أن هذا التأثير زيادة عندما يتم trimerized HA كله. هذه النتيجة ليست غير متوقعة، لأن HA كله يشمل المنطقة الجذعية، والتي يتم حفظها بشكل كبير عبر الأنواع الفرعية. ولذلك، فإن الأجسام المضادة لجزيئات HA الكاملة من الأنواع الفرعية غير السريرية (على سبيل المثال، H5 وH7) تمثل على الأرجح الأجسام المضادة للجذع التي تم الحصول عليها في الأصل ضد الأنواع الفرعية السريرية (مثل H1 وH3) التي تتفاعل عبر المناطق الجذعية من الأنواع الفرعية الأخرى HA على الصفيف. توضح هذه النقطة أهمية إدراج كل من الرأس HA وHA جزيء كامل على مجموعة للتمييز بين الأجسام المضادة إلى الرأس والمناطق الجذعية التي تظهر ملامح التفاعل المختلفة.

يُظهر الاختبار قابلية جيدة للاستنساخ عبر مسارات التدقيق. تشغيل الثاني لا تظهر الأجسام المضادة IgG أقل قليلا عبر جميع السلالات، على الرغم من أن النمط بين سلالات متسقة. ومن المرجح أن يرجع هذا الانخفاض الطفيف الشامل إلى تباين الدفعة إلى الدفعة في الأجسام المضادة الثانوية، التي تم تغييرها بين أشواط لIgG ولكن ليس لIgA. وهكذا، وكما لوحظ في البروتوكول، يوصى باستخدام نفس الدفعة من كل جسم مضاد ثانوي لأي تجارب من المقرر أن تجري بشأنها مقارنة كمية. إذا كانت دفعات مختلفة من الأجسام المضادة ضرورية بسبب عدد كبير من العينات التي سيتم اختبارها، نوصي بما في ذلك عينات مشتركة بين أشواط التجريبية مع دفعات الأجسام المضادة المختلفة للسماح للمقارنة الكمية مع التصحيح.

figure-results-3609
الشكل 1: مخطط من الصفيف البروتيني. كل شريحة تحتوي على منصات متعددة مع كل مجموعة واحدة، والتي تتكون من مئات من المستضدات المطبوعة على بقع مرتبة في شبكة، مع كل بقعة تحتوي على مستضد واحد ممتز على الطوبوغرافيا ثلاثية الأبعاد من سطح النيتروسيلولوز الذي الأجسام المضادة من المصل ملزمة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4190
الشكل 2: مخطط بروتوكول الطباعة الدقيقة لمستضد الأنفلونزا وسبره. من اليسار إلى اليمين، تتم طباعة الصفيف الصغير باستخدام الشرائح المغلفة بالنيتروسيلولوز، والتي تستخدم للتحقيق في السيرا للأجسام المضادة IgG وIgA باستخدام الأجسام المضادة الثانوية الكم نقطة مترافق، مع الشرائح المصورة باستخدام الصور المحمولة، وتحليل النتائج إلى توليد خريطة الحرارة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4835
الشكل 3: إجراء إرفاق غرفة التحقيق بشريحة المصفوفة الدقيقة. من A إلى F، يتم وضع غرفة التحقيق أعلى الشريحة في الاتجاه الصحيح، وتعلق على الشريحة باستخدام مقاطع أفقية على الجانبين، ووضعها في علبة التحقيق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5371
الشكل 4: النتائج التمثيلية للصفيف الدقيق لمضدال الأنفلونزا. تمثل الخرائط الحرارية استجابات الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد، حيث يمثل كل صف مستضدًا واحدًا مرتبًا حسب الجزيء، والنوع الفرعي، والإجهاد، وكل عمود يمثل تشغيل ًا للتحقق من عينة واحدة، مرتبة حسب نوع isotype للجسم المضاد وتشغيله (A، أبيض = 0، أسود = 20000، أحمر = 40000 كثافة الفلورة). يتم ترتيب الأنواع الفرعية مستضد بما في ذلك جميع subtypes الهيماغلوتينين من 1 إلى 18 وجميع الأنواع الفرعية neuraminidase من 1 إلى 10 عموديا ووصفت على اليسار. مقارنة لشدة الفلورة بين شوطين يدل على إمكانية استنساخ تحليل جيد عن طريق الانحدار الخطي لIgA (B) وIgG (C ). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6330
الشكل 5: اتساع نطاق الأجسام المضادة للمصل المقاسة على المصفوفة الدقيقة لمضدة الأنفلونزا. يتم تجميعالمصل IgA (A) وIgG (B) من قبل HA وNA الأشكال الجزيئية والأنواع الفرعية لإثبات خصوصية عالية من الأجسام المضادة مجموعة رئيس HA للأنواع الفرعية السريرية وعالية عبر التفاعل من HA كله والانتهازية الأجسام المضادة HA كله مع إدراج منطقة ساق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي: قائمة المستضدات على الصفيف مستضد الأنفلونزا. يظهر المحتوى لجميع البقع 324 على الصفيف، بما في ذلك الفراغات، fiducials، والضوابط (الإنسان IgG وIgA وIgG المضادة للإنسان وIgA في 0.1 ملغ / مل و 0.3 ملغ / مل)، والمستضدات مع معلومات عن المصدر، والشكل الجزيئي، ونوع فرعي، والإجهاد. وفيما يلي المختصرات: بالنسبة للمصدر، Sino = Sino Biological Inc., FKL = Florian Krammer Laboratory; للشكل الجزيئي، HA1 = رئيس HA، HA0 = HA كله، HA2 = ساق HA، NP = نيوكليوبروتين. بالنسبة للمستضدات التي يتم الحصول عليها من شركة Sino Biological Inc.، تظهر أرقام الكتالوج؛ للمستضدات التي تم الحصول عليها من مختبر كراممر، يتم سرد المعدّات المستضدات. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

بروتوكول الصفيف من الأنفلونزا الموضح هنا قابل للتكيف مع أي مشروع يتطلب تحليل استجابات الأجسام المضادة للعديد من المستضدات. يمكن استخدام منصة microarray مع أي مجموعة مرغوب ة من مستضدات البروتين التي يتم التعبير عنها في أي نظام يمكن أن يحقق 0.1 ملغ /مل أو عائد أعلى مع أو بدون تنقية كما سبق وصفه¹². إذا كانت مستضدات البروتين غير المنقي (على سبيل المثال، معبراً عنها في النسخ في المختبر ونظام الترجمة) تستخدم مباشرة لطباعة المصفوفات الدقيقة، ينبغي إضافة مكونات نظام تعبير البروتين (على سبيل المثال، E. coli lysate) إلى حاجز حظر يستخدم للتخزين المؤقت المستخدم في تخفيف سيرا والأجسام المضادة لمراقبة الجودة من أجل منع أي الأجسام المضادة الموجهة ضد هذه المكونات. تتوفر تكوينات الشرائح مع عدد أقل من منصات أكبر على كل شريحة لاستيعاب عدد أكبر من المستضدات لكل صفيف. لهذه الدراسة، استخدمنا GeneMachines OmniGrid 100 طابعة microarray التي تستخدم دبابيس التي تتصل مباشرة سطح النيتروسيلولوسي لإيداع البقع على مجموعة. في حين أن هذه الطابعة microarray لم تعد متوفرة تجارياً، يمكن استخدام طابعات الصفيف الصغير الأخرى المتوفرة تجارياً في هذا البروتوكول ولكن قد تتطلب دبابيس مخصصة (إما جهة اتصال أو غير اتصال) وبرامج ويجب أن يكون لها دقة موضعية كافية والتوافق مع الشرائح والصور. اعتمادا على تفاعل سيرا، يمكن استخدام التخفيفات من 1:50 إلى 1:400. يمكن استخدام المخزن المؤقت الخالي من المصل كتحكم سلبي، في حين يمكن استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة المعروفة بربطها بالمستضد كتحكم إيجابي.

يجب أن يكون المستخدمون على علم ببعض مشكلات استكشاف الأخطاء وإصلاحها. الغرض من التحقق من جودة مراقبة باستخدام الأجسام المضادة لعلامته هو التحقق من وجود أي مستضدات التي لم تكن الطباعة ناجحة. أي البقع التي تعطي باستمرار إشارة منخفضة في التحقق من جودة صفائف متعددة من المرجح أن تمثل مستضد غير كافية المطبوعة. وتشمل الأسباب المحتملة التجميع أو هطول الأمطار أو مستضد في لوحة المصدر أو ضعف الاتصال بين دبوس الطباعة وشريحة microarray بسبب سمك متغير من لوحة nitrocellulose. في هذه المرحلة، نحن لا نقوم بتطبيع الفحص على أساس النتائج الكمية لفحص الجودة، نظراً لأن الربط المكتشف للأجسام المضادة له يمكن أن يتأثر بتوافر هذه العلامة، التي تعتمد على التوافق ثلاثي الأبعاد محددة لكل مستضد.

توفر المصفوفة الدقيقة لمستضد الأنفلونزا العديد من المزايا على الطرق التقليدية مثل ELISA وهي مكملة للتجارب الوظيفية مثل HAI وMN. ال [16-بوّد] بروتين [ميكرور] [ا] عينة [بروفير] تكنولوجيا مع قدرة أن يقيس أجسام مضادّة من يتعدّد [إيستيب] في وقت واحد ضدّ تقريبا 300 مستضدات من 1 [فل] من مصل. يمكن زيادة عدد المستضدات إلى الآلاف عن طريق تقليل عدد الوسادات لكل شريحة. كما أن الفحص المتعدد يوفر وقت الموظفين والموارد الاستهلاكية، نظراً إلى أنه يمكن فحص مئات السيرا بحثاً عن الأجسام المضادة في يومين، وجميع المواد الأخرى غير الشرائح والكواشف قابلة للاغتسال حتى لا تولد كميات كبيرة من النفايات البلاستيكية.

في حين أن الطابعات microarray قد لا يتم توزيعها على نطاق واسع، يمكن طباعة شرائح المصفوفة الدقيقة في موقع مركزي ومن ثم نقلها إلى المستخدم النهائي للتحقق. والمعدات الوحيدة اللازمة للتحقق هي الصور المنخفضة التكلفة والمحمولة. والهدف من نشر هذا البروتوكول هو زيادة انتشار استخدام هذه التقنية.

وتتمثل القيود الرئيسية للمصفوفة الدقيقة لمضد الأنفلونزا في عدم القدرة على توصيف وظيفة وحركية الأجسام المضادة المكتشفة. تقوم المصفوفة الدقيقة بالكشف عن مجموعة متعددة الكلونات من الأجسام المضادة الملزمة لكل مستضد. قد تكون هذه الأجسام المضادة أو لا تعمل في تحييد الفيروس في الاختبارات HAI وMN. ومع ذلك، تتطلب اختبارات HAI وMN ثقافة فيروس حية مع ما يرتبط بذلك من حاجة إلى مرافق متخصصة مع خزانات عالية المستوى للسلامة البيولوجية لاختبار الأجسام المضادة ضد الأنواع الفرعية من الأنفلونزا الطيور، في حين أن الصفيف الدقيق للبروتين لا ينطوي على فيروس حي المكونات بحيث يمكن استخدامها في أي مختبر أساسي. فيما يتعلق بحركية الربط، يتم تخفيف واحد من المصل الذي تم فحصه بصفيف يحتوي على تركيز واحد لكل مستضد ينتج نقطة بيانات واحدة، والتي تمثل مركبًا من الكمية والتقارب الذي تم تلخيصه على جميع الأجسام المضادة التي ترتبط بالمستضد . لحل كامل الحركية ملزمة الأجسام المضادة مستضد، مطلوب تركيزات مستضد متعددة و / أو تخفيف تسلسلي من سيرا.

وعلى الرغم من هذه القيود، فإن الصفيف الدقيق لمستضد الأنفلونزا هو أداة مفيدة لتوصيف اتساع الأجسام المضادة للأنفلونزا عبر المناظر الطبيعية المضادة للجينات التي يمكن أن تكمل الاختبارات الوظيفية التي هي أكثر محدودية من حيث الإنتاجية والتوافر.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ أي كشف.

Acknowledgements

ويود المؤلفون أن ينوه بالبروفيسور دون ميلتون (معهد الصحة العامة التطبيقية، جامعة ماريلاند، كوليدج بارك، الولايات المتحدة الأمريكية) لجمعه السيرا البشرية بموجب بروتوكول IRB لجامعة ماريلاند #313842 بتمويل من DARPA N66001-18-2-4015 P00001. كما يود المؤلفون أن ينوه بالبروفيسور فلوريان كرامر (كلية إيكان للطب، جبل سيناء، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية) لتوفير مستضدات من نوع HA وNA ممولة من قبل ODNI IARPA DJF-15-1200-K-0001725. S. خان بدعم جزئي من المركز الوطني لموارد البحوث والمركز الوطني للنهوض بعلوم الترجمة، المعاهد الوطنية للصحة، من خلال منحة KL2 TR001416. والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعهد الوطني للصحة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16-pad nitrocellulose-coated glass slides	Grace Bio Labs	305016
1x GVS FAST blocking buffer	Fischer Scientific	10485356
ArrayCam portable imager	Grace Bio Labs	400S	Other imaging devices can be used to visualize slides if capable of achieving the resolution of the microarray spots and the excitation and emission wavelengths of the quantum dots.
Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG antibody	Thermo Fischer	31800
HiBase 384-well plate	Greiner Bio-One	T-3037-11
Microarray pins	ArrayIt	GMP2	Each different microarray printer may require its own custom microarray pins.
Mouse monoclonal poly-His antibody	Sigma-Aldrich	H1029
OmniGrid 100 microarray printer	GeneMachines		The version of the microarray printer used in this work is no longer commercially available, but the updated similar equipment is the OmniGrid Accent microarray printer from Digilab (Hopkinton, MA), and the same protocol can be carried out with most commercially available microarray printers.
ProPlate slide chambers	Grace Bio Labs	246890
ProPlate slide clips	Grace Bio Labs	204838
ProPlate slide frames	Grace Bio Labs	246879
Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA antibody	Grace Bio Labs	110620
Quantum dot 585 nm streptavidin conjugate	Thermo Fischer	Q10111MP
Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG antibody	Grace Bio Labs	110610

References

Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2010).
Renegar, K. B., Crouse, D., Floyd, R. A., Krueger, J. Progression of influenza viral infection through the murine respiratory tract: the protective role of sleep deprivation. Sleep. 23 (7), 859-863 (2000).
Li, L., et al. Heterogeneity in Estimates of the Impact of Influenza on Population Mortality: A Systematic Review. American Journal of Epidemiology. 187 (2), 378-388 (2018).
Fauci, A. S. Seasonal and pandemic influenza preparedness: science and countermeasures. Journal of Infectious Diseases. 194 Suppl 2, S73-S76 (2006).
Duggal, A., Pinto, R., Rubenfeld, G., Fowler, R. A. Global Variability in Reported Mortality for Critical Illness during the 2009-10 Influenza A(H1N1) Pandemic: A Systematic Review and Meta-Regression to Guide Reporting of Outcomes during Disease Outbreaks. PLoS One. 11 (5), 2009-2010 (2016).
Demicheli, V., Jefferson, T., Ferroni, E., Rivetti, A., Di Pietrantonj, C. Vaccines for preventing influenza in healthy adults. Cochrane Database Systematic Reviews. 2, CD001269(2018).
Erbelding, E. J., et al. A Universal Influenza Vaccine: The Strategic Plan for the National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Journal of Infectious Diseases. , (2018).
Xie, H., et al. H3N2 Mismatch of 2014-15 Northern Hemisphere Influenza Vaccines and Head-to-head Comparison between Human and Ferret Antisera derived Antigenic Maps. Scientific Reports. 5, 15279(2015).
Tricco, A. C., et al. Comparing influenza vaccine efficacy against mismatched and matched strains: a systematic review and meta-analysis. BMC Medicine. 11, 153(2013).
Katz, J. M., Webster, R. G. Efficacy of inactivated influenza A virus (H3N2) vaccines grown in mammalian cells or embryonated eggs. Journal of Infectious Disease. 160 (2), 191-198 (1989).
Zost, S. J., et al. Contemporary H3N2 influenza viruses have a glycosylation site that alters binding of antibodies elicited by egg-adapted vaccine strains. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (47), 12578-12583 (2017).
Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (3), 547-552 (2005).
Liang, L., Felgner, P. L. A systems biology approach for diagnostic and vaccine antigen discovery in tropical infectious diseases. Current Opinion in Infectious Diseases. 28 (5), 438-445 (2015).
Jain, A., et al. Evaluation of quantum dot immunofluorescence and a digital CMOS imaging system as an alternative to conventional organic fluorescence dyes and laser scanning for quantifying protein microarrays. Proteomics. 16 (8), 1271-1279 (2016).
Desbien, A. L., et al. Development of a high density hemagglutinin protein microarray to determine the breadth of influenza antibody responses. Biotechniques. 54 (6), 345-348 (2013).
Mace, C. R., et al. Label-free, arrayed sensing of immune response to influenza antigens. Talanta. 83 (3), 1000-1005 (2011).
Koopmans, M., et al. Profiling of humoral immune responses to influenza viruses by using protein microarray. Clinical and Microbiology Infections. 18 (8), 797-807 (2012).
Bucukovski, J., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Miller, B. L. A Multiplex Label-Free Approach to Avian Influenza Surveillance and Serology. PLoS One. 10 (8), e0134484(2015).
Meade, P., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Krammer, F. Development of an influenza virus protein microarray to measure the humoral response to influenza virus infection in mallards. Emerging Microbes and Infection. 6 (12), e110(2017).
Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
Nakajima, R., et al. Protein Microarray Analysis of the Specificity and Cross-Reactivity of Influenza Virus Hemagglutinin-Specific Antibodies. mSphere. 3 (6), (2018).
Van Hoeven, N., et al. A Formulated TLR7/8 Agonist is a Flexible, Highly Potent and Effective Adjuvant for Pandemic Influenza Vaccines. Scientific Reports. 7, 46426(2017).
Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7 (8), e43603(2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

149

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: