Verwendung eines Influenza-Antigen-Mikroarrays zur Messung der Breite von Serum-Antikörpern über Virussubtypen hinweg

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll zur Verwendung eines Protein-Mikroarrays, das durch den Druck von Influenza-Antigenen auf nitrozellulosebeschichtete Dias konstruiert wurde, um gleichzeitig Serum für mehrere Antikörper-Isotypen gegen über 250 Antigene aus verschiedenen Virusstämmen zu sonden, Messung der Breite von Serumantikörpern über Virussubtypen hinweg.

Zusammenfassung

Das Influenzavirus ist aufgrund der begrenzten Wirksamkeit der derzeit verfügbaren Impfstoffe nach wie vor eine bedeutende Todesursache weltweit. Eine zentrale Herausforderung für die Entwicklung universeller Grippeimpfstoffe ist die hohe antigene Vielfalt, die sich aus antigenen Treibwirkungen ergibt. Um diese Herausforderung zu bewältigen, sind neue Forschungsinstrumente erforderlich, um die Breite von Serumantikörpern zu messen, die gegen viele Virusstämme über verschiedene antigene Subtypen gerichtet sind. Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der Breite von Serumantikörpern gegen verschiedene Influenzavirusstämme unter Verwendung eines Proteinmikroarrays von Influenza-Antigenen vor.

Dieses Influenza-Antigen-Mikroarray wird durch Dendruck von gereinigtem Hemagglutinin- und Neuraminidase-Antigen auf eine Nitrocellulose-beschichtete Membran mit einem Mikroarray-Drucker konstruiert. Menschliche Seren werden auf dem Mikroarray inkubiert, um Antikörper gegen die Influenza-Antigene zu binden. Quantenpunktkonjugierte sekundäre Antikörper werden verwendet, um gleichzeitig IgG- und IgA-Antikörper zu erkennen, die an jedes Antigen auf dem Mikroarray binden. Die quantitative Antikörperbindung wird als Fluoreszenzintensität mit einem tragbaren Imager gemessen. Repräsentative Ergebnisse zeigen die Reproduzierbarkeit von Assay bei der Messung subtypspezifischer und kreuzreaktiver Influenza-Antikörper in menschlichen Seren.

Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden wie ELISA bietet das Influenza-Antigen-Mikroarray einen Multiplex-Ansatz mit hohem Durchsatz, der in der Lage ist, Hunderte von Seren auf mehrere Antikörper-Isotypen mit Hunderten von Antigenen in kurzer Zeit zu testen, und Anwendungen in der Sero-Überwachung und Impfstoffentwicklung. Eine Einschränkung ist die Unfähigkeit, bindungsantikörper von neutralisierenden Antikörpern zu unterscheiden.

Einleitung

Das Influenzavirus ist für den Verlust von 20 Millionen Lebensjahren jährlich durch Tod oder Behinderung verantwortlich, einschließlich 1 % aller Todesfälle weltweit pro Jahr, mit unverhältnismäßigen Auswirkungen auf ältere Menschen und Die Bevölkerung in den Tropen und Entwicklungsländern^{1, 2,3}. Neben der Krankheitslast saisonaler Epidemien könnte das Auftreten neuartiger Grippestämme durch genetische Neusortierung entweder natürlich in gemeinsamen Wirten oder künstlich für Bioterrorismus zu weltweiten Pandemien mit rascher Ausbreitung und hoher Letalität führen. ^{4 , 5}. Obwohl derzeit zahlreiche Grippeimpfstoffe verfügbar sind, ist ihre Wirksamkeit durch die Subtypspezifität⁶begrenzt, was die Notwendigkeit schafft, universelle Grippeimpfstoffe zu entwickeln, die eine langanhaltende Immunität gegen mehrere Viren verleihen. Dehnungen⁷.

Eine zentrale Herausforderung für die Entwicklung universeller Grippeimpfstoffe ist die hohe antigene Vielfalt zwischen den Stämmen. Die antigene Spezifität aktueller Impfstoffe in Kombination mit antigenen Variationen zirkulierender Viren führt zu einer Diskrepanz zwischen Impfstoffstämmen und zirkulierenden Stämmen. Dies verschafft einen evolutionären Vorteil, der eine weitere genetische Abdrift von Impfstoffstämmen während einer Epidemie begünstigt und die Wirksamkeit des Impfstoffs oft auf weniger als 50%^8,9begrenzt. Eine weitere Quelle antigener Missübereinstimmung sind eiadaptive Virusmutationen, die bei der Herstellung von Impfstoffen entstehen und zu Antikörpern führen, die schlecht an zirkulierende Viren binden^10,11.

Um diese Herausforderung der hohen antigenen Vielfalt zu bewältigen, sind neue Forschungsinstrumente erforderlich, um die Breite der bereits bestehenden und ausgelösten Immunantworten über klinisch relevante antigene Varianten in Serum- und Schleimhautproben zu charakterisieren. Derzeit verfügbare Methoden, einschließlich Hemagglutinationshemmung (HAI), Mikroneutralisation (MN) und herkömmlicher ELISA, beschränken sich auf den Nachweis von Antikörpern gegen einen einzelnen Virusstamm gleichzeitig, so dass ihre Verwendung für den Nachweis mehrerer Antikörper-Isotypen gegen mehrere Virusstämme erschöpft schnell verfügbare klinische Proben und Laborressourcen. Darüber hinaus benötigen HAI und MN eine Live-Virenkultur, die nur in spezialisierten Laboratorien verfügbar ist.

Protein-Mikroarrays, die möglicherweise aus bis zu Tausenden von Antigenen bestehen, die auf nitrozellulosebeschichtete Dias gedruckt werden, wie in Abbildung 1dargestellt, können diesen Bedarf füllen¹². Diese Mikroarrays können in einer Hohen Durchsatz-Manier hergestellt und untersucht werden, während kleine Mengen klinischer Proben verbraucht werden, um quantitative Antikörper-Isotyp-/Subtyp-Spiegel gegen jedes einzelne Antigen auf dem Array zu bestimmen. Dieser Ansatz zur Antigenentdeckung wurde auf die Diagnose- und Impfstoffentwicklung gegen mehrere infektiöse Erreger angewendet¹³. Bis heute haben wir Proteinmikroarrays für über 35 Krankheitserreger, darunter über 60.000 insgesamt exprimierte Proteine, hergestellt und sie verwendet, um über 30.000 menschliche Seren von infizierten und kontrollierenden Individuen zu untersuchen. Eine kürzlich entwickelte tragbare Bildgebungsplattform für Mikroarray-Dias hat diese Methode für den Endbenutzer zugänglicher gemacht¹⁴.

Aufbauend auf umfangreichen früheren Arbeiten von mehreren Mitwirkenden im Feld^{15,16,17,18,19}wurde vor kurzem ein Influenza-Protein-Mikroarray entwickelt, das über 250 gereinigte Hemagglutinin (HA) antigene Varianten mit Darstellung aller 18 Subtypen^12,20. Mit dieser Methode wurde eine natürliche Influenza-Infektion nachgewiesen, die weitgehend reaktive IgG- und IgA-Antikörper gegen phylogenetisch verwandte HA-Subtypen erzeugte, während eine intramuskuläre Influenza-Impfung nur subtypspezifischeIg-Ähnliche erzeugte. Antikörper²¹. Jedoch, Hinzufügen eines Adjuvans, das mautähnliche Rezeptoren zu Grippeimpfstoffen aktiviert wurde gezeigt, um die ausgelöste IgG-Antikörper-Antwort über HA-Subtypen in Tierstudien zu erweitern²².

Dieses Mikroarray wird derzeit verwendet, um Seren zu untersuchen, die aus einer prospektiven Kohortenstudie von College-Studenten gesammelt wurden, die wegen einer Influenza-Infektion verfolgt wurden. Hierwird wird die Methodik des Influenza-Antigen-Mikroarrays mit Nachweis der Assay-Reproduzierbarkeit zum Nachweis subtypspezifischer und kreuzreaktiver Antikörper in einer Teilmenge von Proben aus dieser Studie berichtet.

Protokoll

Alle menschlichen Seren werden nach anerkannten institutionellen Protokollen für die Biologische Sicherheit unter Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung behandelt und entsorgt. Alle Labormitarbeiter, die an diesem Protokoll teilnehmen, haben eine Ausbildung in Biosicherheit und Forschungsethik erhalten.

1. Herstellung von Influenza-Antigen-Mikroarrays

1. Design und erhalten Antigen-Set für Mikroarray
   1. Erhalten Sie exprimierte und gereinigte Proteinantigene als lyophilisiertes Pulver.
2. Antigene auf Mikroarray-Dias drucken
   1. Rekonstituieren Sie jedes lyophilisierte Antigen auf eine Konzentration von 0,1 mg/ml in phosphatgepufferter Salin (PBS) mit 0,001% Tween-20 (T-PBS). Übertragen Sie 10 l jedes rekonstituierten Antigens auf einzelne Brunnen einer unbehandelten 384-Well-Flachbodenplatte.
   2. Drucken Sie Antigene mit einem Mikroarray-Drucker (der in dieser Studie verwendete Mikroarraydrucker ist nicht mehr kommerziell erhältlich, siehe Diskussion) mit Kleinvolumen-Mikroarray-Spotting-Pins, die Antigen in den Probenkanal aspirieren und über direkt ablagern Kontakt und Kapillarwirkung auf 16-Pad nitrocellulosebeschichtete Glasschlitten.
      1. Programmieren Sie die Drucksoftware (z.B. Gridder) mit der Quellplattenkonfiguration und den Druckparametern.
         1. Verwenden Sie das Pulldown-Menü, um den Namen des Plattentyps auszuwählen, der bei dieser Druckmethode verwendet wird. Verwenden Sie für diese Studie eine unbehandelte 384-Well-Flachbodenplatte.
         2. Markieren Sie das Textfeld neben Anzahl der Platten, und geben Sie die Anzahl der Musterplatten ein, die in diesem Druckprotokoll verwendet werden. Verwenden Sie für diese Studie 1 Platte.
         3. Wählen Sie eine Pinkonfiguration aus, die mit dieser Methode verwendet werden soll. Verwenden Sie für diese Studie eine 8-polige Konfiguration.
         4. Stellen Sie sicher, dass die Ursprungsversätze die Abstände (in X- und Y-Richtung) zwischen dem Folienursprung (der im Administrativen Abschnitt kalibriert wird) und der Position sind, an der die Druckstifte auf den Folien zu drucken beginnen.
         5. Definieren Sie mithilfe der Registerkarte Arrayentwurf die Größe und Form der Arrays (Punktabstand und Anzahl der Punkte pro Unterarray). Drucken Sie für diese Studie 324 Spots (180 m Durchmesser mit 300 m Abstand) auf 16-Pad-Dias im 18x18-Format mit 8 Pins.
         6. Wählen Sie die Parameter aus, wie die Druckstifte Proben aufnehmen und verteilen. Für diese Studie, jeder Stift aspirate 250 nL Antigen-Lösung und druckt 1 nL auf jeden von 40 Spots (insgesamt 20 Dias für alle 8 Pins)
         7. Konfigurieren Sie das Pin-Reinigungsprotokoll und das Blotting-Protokoll. Für diese Studie, jeder Pin druckt Antigen, wird in sterile ddH₂O in beschallten Waschbehälter getaucht, und dann Aspirate nächsten Antigen.
         8. Definieren Sie die Reihenfolge, in der die Beispielblöcke auf die Folien gedruckt werden. Die Array-Software erstellt eine annotierte Grid-Indexdatei (.gal), um die Anordnung von Antigenen innerhalb jedes Mikroarrays zu beschreiben.
            HINWEIS: Die obere Reihe wird für Treuhänder (mit Fluoreszenz bei allen Wellenlängen, die in der Bildgebung verwendet werden, z. B. Mischung aus Qdot 585 nm Streptavidin-Konjugat und Qdot 800 nm Streptavidin-Konjugat in dieser Studie) verwendet, um Gitter während der Bildgebung auszurichten. Bei langen Druckauflagen können Antigene in der Quellplatte periodisch durch Pipettieren nach oben und unten und dann zentrifugieren auf- und abgehängt werden, oder neue Quellenplatten können vorbereitet und verwendet werden.
   3. Un-sonnierte Mikroarray-Dias in eine lichtdichte Box legen und in einem Trockenschrank bei Raumtemperatur für eine langzeitige Lagerung aufbewahren.
      HINWEIS: Das Protokoll kann an dieser Stelle auf unbestimmte Zeit angehalten werden.
3. Qualitätskontrolle durchführen (erfordert Polyhistidin-Tags)
   1. Befestigen Sie das Dia an Sondierungskammern und rehydrieren Sie mit dem Sperrpuffer, wie in Schritt 2.1.1-2.1.2 beschrieben und in Abbildung 2dargestellt.
   2. Verdünnen Sie die Maus monoklonalen Poly-His Antikörper 1:100 in gefilterten 1x Sperrpuffer.
      ANMERKUNG: Wenn nicht gereinigte Proteinantigene (z. B. in In-vitro-Transkriptions- und Translationssystem ausgedrückt) direkt zum Drucken von Mikroarrays verwendet werden, fügen Sie Komponenten des Proteinexpressionssystems (z. B. E. coli Lysat) in einem Verhältnis von 1:10 mit dem Sperrpuffer, der für die Serumverdünnung verwendet wird, um Antikörper zu blockieren, die gegen diese Komponenten gerichtet sind.
   3. Fügen Sie 100 l verdünnten Poly-His-Antikörper in jede Gleitkammer mit Array-Pad nach Aspiration und inkubieren für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C auf Shaker. Waschen Sie 3x mit T-TBS-Puffer, wie in Schritt 2.2.1 beschrieben. Biotinkonjugierte Ziege Anti-Maus IgG Sekundärantikörper 1:200 im Sperrpuffer verdünnen, 100 l pro Bohrung nach aspiration hinzufügen und 1 h bei Raumtemperatur auf Shaker inkubieren. 3x mit T-TBS-Puffer waschen.
   4. Qdot 585 nm Streptavidin konjugieren sie im Sperrpuffer auf 4 nM, fügen Sie 100 l pro Bohrung nach der Aspiration hinzu und brüten sie 1 h bei Raumtemperatur auf dem Shaker. Waschen Sie 3x mit T-TBS-Puffer und dann einmal mit TBS-Puffer (ohne Tween).
   5. Dias wie in Schritt 2.2.5 – 3.1.2 beschrieben zu dissemble und quantifizieren.
      HINWEIS: Proteinantigene müssen Seine₁₀ Tags enthalten, um dieses Qualitätskontrollprotokoll verwenden zu können. Wenn ein anderes Tag enthalten ist, kann auch die Qualitätskontrolle mit Antikörper oder Liganden für dieses Tag durchgeführt werden.

2. Sondenserfür Influenza-Antikörper mit Mikroarrays

1. Inkubationsseren auf Mikroarrays zur Antikörperbindung
   1. Befestigen Sie Mikroarray-Dias mit Clips an Kammern und platzieren Sie sie in Rahmen, wie in Abbildung 3dargestellt.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es immer, das Microarray-Pad mit Händen und Instrumenten zu berühren. Stellen Sie sicher, dass die Dias mit der Padseite nach oben und der kleinen Kerbe in der oberen rechten Ecke ausgerichtet sind.
   2. Rehydrieren Sie Mikroarray-Dias mit 100 l pro Bohrung des gefilterten 1x-Blockierpuffers und verdünnen Sie das Serum 1:100 in 100 l Blockierpuffer (kann unbehandelte 96-Well-Platten oder 2 ml-Rohre verwenden). Inkubieren Sie sowohl rehydrierte Mikroarray-Dias in abgedeckten Rahmen als auch verdünnte Seren getrennt für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf Orbital-Shaker bei 100-250 Rpm. Führen Sie alle nachfolgenden Inkubationsschritte auf dem Shaker auf ähnliche Weise aus.
      HINWEIS: Sera sollte bei einer Langzeitlagerung bei -80 °C eingefroren werden, um Frost-Tau-Zyklen zu minimieren, und es sollte gewirbelt und gegliedert werden, um Partikel vor der Verwendung zu entfernen. Beobachten Sie die Gleitkammern während und nach diesem Schritt sorgfältig, um Leckagen zu erkennen, die eine neu montagebasierte Schiebekammer erfordern.
   3. Mit Pipettenspitzen, die mit einer Vakuumleitung mit sekundärem Sammelkolben verbunden sind, saugen Sie vorsichtig den Sperrpuffer aus der Ecke jeder Kammer, ohne die Pads zu berühren. Führen Sie alle nachfolgenden Aspirationsschritte auf ähnliche Weise aus. Fügen Sie verdünnte Seren schnell nach der Aspiration zu Dengenen hinzu, um die Pads nicht trocknen zu lassen.
   4. Legen Sie abgedeckte Rahmen in Schalen in einem sekundären Behälter, umgeben von feuchten Papiertüchern und versiegelt, um Verdunstung zu verhindern. Über Nacht bei 4 °C auf Schaukelschüttler inkubieren (alternativ kann bei Raumtemperatur auf Orbital-Shaker bei 100-250 Rpm 2 h inkubieren).
2. Etikettengebundene Serumantikörper mit quantenpunktkonjugierten Sekundärantikörpern
   1. Aspirate sera aus Kammern sorgfältig wie oben beschrieben, fügen Sie 100 l pro Bohrung T-TBS Puffer (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20 in ddH₂O auf pH 7,5 eingestellt und gefiltert, kann kommerziell erhalten werden), und inkubieren für 5 min auf Orbital-Shaker bei 100-250 Rpm. Wiederholen Sie diesen Waschschritt insgesamt 3x (alle nachfolgenden Waschschritte werden ähnlich ausgeführt).
   2. Mischen von sekundären Antikörpern, die im Blockierpuffer auf 1 M verdünnt sind, vorbereiten und durch Pipettieren vor und während der Anwendung gründlich mischen, um die Homogenität aufrechtzuerhalten.
      ANMERKUNG: Um die Reproduzierbarkeit des Asses zu erhalten, sollte für alle Sondierungsexperimente, für die ein quantitativer Vergleich der Daten über Experimente hinweg geplant ist, dieselbe Charge jedes sekundären Antikörpers verwendet werden. Die spezifische Konzentration von sekundären Antikörpern muss je nach Affinität variieren; den Protokollen des Herstellers folgen, wann immer verfügbar.
   3. Aspiratpuffer aus Kammern nach der letzten Wäsche, fügen Sie 100 l pro Brunnen der sekundären Antikörpermischung, und inkubieren für 2 h bei Raumtemperatur auf Shaker.
   4. Aspirieren Sekundärantikörper-Gemisch waschen 3x mit T-TBS-Puffer, und dann einmal mit TBS-Puffer (ohne Tween) waschen.
   5. Entfernen Sie Mikroarray-Dias aus Kammern sorgfältig, um das Berühren von Pads zu vermeiden, spülen Sie vorsichtig mit gefilterten ddH₂O, und trocknen Sie durch Platzieren in 50 ml Rohre und Zentrifugieren bei 500 x g für 10 min.
   6. Sonden-Mikroarray-Dias in eine lichtdichte Box legen und in einem Trockenschrank bei Raumtemperatur für eine langzeitige Lagerung aufbewahren.
      HINWEIS: Das Protokoll kann an dieser Stelle bis zu 1 Woche angehalten werden.

3. Quantifizieren Sie die Antikörperbindung an Antigene innerhalb des Mikroarrays

1. Visualisierung von Mikroarray-Dias und Quantifizierung der Fluoreszenzintensität zur Messung der Antikörperbindung
   1. Erfassen Sie Bilder von Mikroarray-Dias mit dem tragbaren Imager mit integrierter Software.
      1. Wählen Sie auf der Registerkarte Imager konfigurieren die richtige Folienkonfiguration aus. Verwenden Sie für diese Studie 16-Pad-Folien.
      2. Wählen Sie auf der Registerkarte Bildsteuerung den richtigen Fluoreszenzkanal aus, und passen Sie die Verstärkung, Belichtungszeit und Erfassungszeit in Abhängigkeit von der Reaktivität der Seren an, um optimale Bilder zu erhalten. Für diese Studie betrugen die fluoreszierenden Kanäle für IgA und IgG 585 nm bzw. 800 nm, und die Bildeinstellungen waren eine Verstärkung von 50, eine Belichtungszeit von 500 ms und eine Erfassungszeit von 1 s.
      3. Klicken Sie auf Erfassen, um den Prozess des Erfassens des Bildes zu starten.
         HINWEIS: Microarray-Dias können bei mehreren Einstellungen neu abgebildet werden, ohne das Signal zu verschlechtern, solange sie dunkel und trocken gespeichert sind. Andere Bildgebungssysteme können verwendet werden, wenn sie mit den Dias kompatibel sind.
   2. Erkennen Sie Array-Spots mithilfe von Rastern, die auf den fiduzialen Markern ausgerichtet sind, und messen Sie die Spotintensität als Median der Pixelintensität minus Hintergrund, der um Flecken gemessen wird. Führen Sie diesen Quantifizierungsalgorithmus im Batch mit der integrierten Imager-Software durch, die die in Schritt 1.2.2 konstruierte .gal-Datei verwendet, um Spotintensitäten mit einzelnen Antigenen auf jedem Mikroarray zu verbinden.
      1. Laden Sie im Bedienfeld Dateiinfo die .gal-Datei hoch, indem Sie aus ihrem Ordner auf dem Computer auswählen, und geben Sie den Ordner an, in dem die Analyseausgabedateien im Abschnitt Analyseoptionen gespeichert werden sollen.
      2. Öffnen Sie auf der Registerkarte Bildsteuerung eines der erfassten Bilder, das quantifiziert werden soll, und wählen Sie die Schaltfläche Auto in der oberen rechten Ecke aus.
      3. Erstellen Sie im Abschnitt Arrayanalyse in der unteren rechten Ecke eine treuerstellen Vorlage, wie von der Software angewiesen.
      4. Klicken Sie auf die Batchanalyse, wählen Sie den Ordner aus, der die zu quantifizierenden Bilder enthält, und wählen Sie die Treuhandvorlage aus, die im vorherigen Schritt erstellt wurde. Die Software analysiert jedes Bild und quantifiziert die Spot-Intensität.
         HINWEIS: Dieser Schritt generiert eine .csv-Datei, die Spotintensitäten zur Quantifizierung von Antikörpern in jeder Serumprobe enthält, die an jedes einzelne Antigen auf dem Mikroarray binden, das anschließend in Tabellenbearbeitungs- oder Analysesoftware bearbeitet werden kann.
   3. Analysieren Sie Rohdaten, um die Antikörperbindung über Antigene und Serumproben hinweg zu vergleichen. Für diese Studie wurden IgA- und IgG-Antikörper, gemessen als 585 nm und 800 nm fluoreszierende Punktintensitäten, über alle Antigene zwischen 2 unabhängigen Durchläufen des Experiments mit verschiedenen Dias an verschiedenen Tagen verglichen und Korrelationsanalysen durchgeführt, um Messung der Assay-Reproduzierbarkeit.
      HINWEIS: Bei nicht gereinigten Proteinen, die als Expressionsmischung gedruckt werden, sollte die Datenanalyse mit der Hintergrundsubtraktion einer nicht-DNA-Kontrolle beginnen.

Ergebnisse

Als Demonstration des Protokolls wurden Die Basisseren von 16 Personen in einer prospektiven Kohortenstudie von College-Studenten untersucht, die auf eine Influenza-Infektion mit dem Influenza-Antigen-Mikroarray folgten. Um die Reproduzierbarkeit des Asses zu demonstrieren, wurden diese Proben zweimal an verschiedenen Dias und an verschiedenen Tagen untersucht.

Für diese Studie wurden gereinigte Influenza-Antigene mit seinen₁₀ Tags von kommerziellen Anbietern (siehe Tabelle derMaterialien) und Mitarbeitern erhalten. Diese Antigene umfassen insgesamt 251 HA-Antigene mit 63 Kugelkopfdomänen (HA1) und 186 Volllängenproteinen (HA0), darunter 96 monomere HA0-Proteine und 90 trimerisierte HA0-Proteine, die eine geschmolzene Trimerisierung ("Foldon") enthalten. Eine vollständige Liste der Antigene und Kontrollen, die in dieser Studie verwendet werden, ist als Ergänzende Dateienthalten. Für diese Studie wurden sekundäre Antikörper verwendet, die mit dem mit Quantenpunkt emittierenden Quantenpunkt konjugiert wurden, um 800 nm (GAH-IgG-Q800) auszustoßen, und Ziegenantihuman-IgA, konjugiert mit Quantenpunkt, der bei 585 nm (GAH-IgA-Q585) emittiert wird, um IgG- und IgA-Antikörper als Multiplex-Erkennung von IgG- und IgA-Antikörpern als in Abbildung 3dargestellt . IgG- und IgA-Antikörperbindung an verschiedene Subtypen und molekulare Formen von Influenza-HA-Antigenen wurden mit Seren verglichen, die aus der oben beschriebenen klinischen Kohorte gewonnen wurden.

Die resultierende Heatmap ist in Abbildung 4 mit grafischer Darstellung in Abbildung 5dargestellt. In diesen Zahlen werden nur die klinisch relevanten Subtypen mit hoher Darstellung auf dem Array gekennzeichnet, um Platz zu sparen, wobei "+" alle verbleibenden Subtypen höherer Zahl und kleinere oder weniger gut dargestellte Subtypen als geordnet enthalten (z. B. H2 zwischen H1 und H3). Eine vollständige Liste der Stämme und Subtypes im Array ist als Ergänzende Dateienthalten. Diese Daten zeigen, dass Antikörper gegen die Kopfgruppe von HA subtypspezifisch sind und eine erwartete hohe Menge an Antikörpern gegen klinisch vorherrschende Stämme (H1N1, H3N2 und B) und eine geringe Menge an Antikörpern gegenüber anderen Stämmen aufweist. Antikörper gegen die gesamte HA, die die Stieldomäne umfasst, sind jedoch über Subtypen hinweg mehr kreuzreaktiv, und dieser Effekt scheint verstärkt zu werden, wenn die gesamte HA trimmerisiert wird. Dieses Ergebnis kommt nicht unerwartet, da die gesamte HA den Stammbereich umfasst, der über Subtypen hinweg stark konserviert ist. Daher stellen Antikörper gegen ganze HA-Moleküle aus nicht-klinischen Subtypen (z. B. H5 und H7) wahrscheinlich Anti-Stamm-Antikörper dar, die ursprünglich gegen klinische Subtypen (z. B. H1 und H3) ausgelöst wurden, die mit den Stammregionen der anderen HA-Subtypen kreuzreagieren. auf dem Array. Dieser Punkt veranschaulicht, wie wichtig es ist, sowohl Kopf-HA als auch ganzes Molekül HA in das Array einzubeziehen, um zwischen Antikörpern gegen den Kopf und den Stammregionen zu unterscheiden, die unterschiedliche Reaktivitätsprofile aufweisen.

Der Test zeigt eine gute Reproduzierbarkeit über Probeläufe hinweg. Der zweite Durchlauf zeigt etwas niedrigere IgG-Antikörper über alle Stämme hinweg, obwohl das Muster zwischen den Stämmen konsistent ist. Dieser generelle leichte Rückgang ist wahrscheinlich auf die Batch-zu-Charge-Variabilität des sekundären Antikörpers zurückzuführen, die zwischen den Durchläufen für IgG, aber nicht für IgA geändert wurde. Daher wird, wie im Protokoll erwähnt, empfohlen, für alle Experimente, zwischen denen ein quantitativer Vergleich geplant ist, dieselbe Charge jedes sekundären Antikörpers zu verwenden. Wenn aufgrund einer hohen Anzahl zu prüfender Proben unterschiedliche Antikörperchargen erforderlich sind, empfehlen wir, gemeinsame Proben zwischen Versuchsläufen mit unterschiedlichen Antikörperchargen einzubeziehen, um einen quantitativen Vergleich mit der Korrektur zu ermöglichen.

Abbildung 1: Schematisches Protein-Mikroarray. Jede Folie enthält mehrere Pads mit jeweils einem einzigen Array, das aus Hunderten von Antigenen besteht, die auf Flecken gedruckt werden, die in einem Raster angeordnet sind, wobei jeder Punkt ein Antigen enthält, das auf die dreidimensionale Topographie der Nitrozelluloseoberfläche adsorbiert wird, auf die Antikörper aus Serum gebunden sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Schematic des Influenza-Antigen-Mikroarraydruck- und -sondierungsprotokolls. Von links nach rechts wird Microarray mit Nitrozellulose-beschichteten Dias gedruckt, die zur Sondense für IgG- und IgA-Antikörper mit quantenpunktkonjugierten Sekundärantikörpern verwendet werden, wobei Dias mit einem tragbaren Imager abgebildet und Die Ergebnisse analysiert werden, um eine Heatmap zu erstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Verfahren zum Anbringen von Sondierungskammern an Mikroarray-Dia. Von A bis Fwird die Sondierungskammer in korrekter Ausrichtung auf dem Dia platziert, mit horizontalen Clips an den Seiten an der Folie befestigt und im Sondierungsfach platziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse des Influenza-Antigen-Mikroarrays. Heatmaps stellen antigenspezifische Antikörperreaktionen dar, wobei jede Zeile ein einzelnes Antigen darstellt, das nach Molekül, Subtyp und Stamm angeordnet ist, und jede Spalte, die einen Sondierungslauf einer einzelnen Probe darstellt, geordnet nach Antikörper-Isotyp und -lauf (A, weiß = 0, schwarz = 20000, rot = 40000 Fluoreszenzintensität). Die Antigen-Subtypen einschließlich aller Hemagglutinin-Subtypen von 1 bis 18 und alle Neuraminidase-Subtypen von 1 bis 10 sind vertikal angeordnet und links beschriftet. Ein Vergleich der Fluoreszenzintensität zwischen zwei Durchläufen zeigt eine gute Assay-Reproduzierbarkeit durch lineare Regression für IgA (B) und IgG(C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Breite der Serumantikörper, gemessen am Influenza-Antigen-Mikroarray. Serum IgA (A) und IgG (B) werden nach HA- und NA-Molekülformen und Subtypen gruppiert, um eine hohe Spezifität von HA-Kopfgruppenantikörpern für klinische Subtypen und eine hohe Kreuzreaktivität ganzer HA- und trimerisierter Einbeziehung der Stielregion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei: Liste der Antigene auf Influenza-Antigen-Mikroarray. Der Inhalt wird für alle 324 Flecken auf dem Array angezeigt, einschließlich Rohlinge, Treuhänder, Kontrollen (menschliches IgG und IgA und antihumanes IgG und IgA bei 0,1 mg/ml und 0,3 mg/ml) und Antigene mit Informationen über Quelle, molekulare Form, Subtyp und Stamm. Abkürzungen sind wie folgt: für Quelle, Sino = Sino Biological Inc., FKL = Florian Krammer Laboratory; für molekulare Form, HA1 = Kopf HA, HA0 = ganzes HA, HA2 = Stiel HA, NP = Nukleoprotein. Für Antigene von Sino Biological Inc. werden Katalognummern angezeigt; für Antigene aus dem Krammer-Labor sind Antigen-IDs aufgeführt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Das hier beschriebene Influenza-Antigen-Mikroarray-Protokoll ist an jedes Projekt anpassbar, das die Analyse von Antikörperreaktionen auf viele Antigene erfordert. Die Microarray-Plattform kann mit jedem gewünschten Satz von Proteinantigenen verwendet werden, die in jedem System ausgedrückt werden, das 0,1 mg/ml oder einen höheren Ertrag mit oder ohne Reinigung erreichen kann, wie zuvor beschrieben¹². Werden nicht gereinigte Proteinantigene (z. B. in In-vitro-Transkriptions- und Translationssystem ausgedrückt) direkt zum Drucken von Mikroarrays verwendet, sollten Komponenten des Proteinexpressionssystems (z. B. E. coli Lysat) 1:10 zum Sperrpuffer hinzugefügt werden, der für Verdünnung von Seren und Qualitätskontrollantikörpern, um Antikörper gegen diese Komponenten zu blockieren. Folienkonfigurationen sind mit einer geringeren Anzahl größerer Pads auf jeder Folie verfügbar, um eine höhere Anzahl von Antigenen pro Array aufzunehmen. Für diese Studie haben wir einen GeneMachines OmniGrid 100 Mikroarray-Drucker verwendet, der Pins verwendet, die direkt mit der Nitrozelluloseoberfläche in Kontakt treten, um Flecken auf dem Array zu deponieren. Obwohl dieser Microarray-Drucker nicht mehr kommerziell erhältlich ist, können andere handelsübliche Microarray-Drucker in diesem Protokoll verwendet werden, erfordern jedoch möglicherweise benutzerdefinierte Pins (entweder Kontakt oder Kontakt) und Software und sollten eine ausreichende Spotauflösung aufweisen. und Kompatibilität mit Dias und Imager. Je nach Reaktivität der Seren können Verdünnungen von 1:50 bis 1:400 verwendet werden. Serumfreier Puffer kann als Negativkontrolle verwendet werden, während monoklonale Antikörper, die bekanntermaßen an Antigen binden, als Positivkontrolle verwendet werden können.

Benutzer sollten einige Probleme bei der Problembehandlung kennen. Der Zweck der Qualitätskontrolle mit Antikörpern gegen das His-Tag ist es, nach Antigenen zu suchen, für die der Druck nicht erfolgreich war. Alle Flecken, die konsequent niedriges Signal in der Qualitätskontrolle Überprüfung von mehreren Arrays wahrscheinlich darstellen unzureichend Antigen gedruckt. Mögliche Gründe sind Aggregation oder Niederschlag oder Antigen in der Quellplatte oder schlechter Kontakt zwischen Druckstift und Mikroarray-Schlitten aufgrund der variablen Dicke des Nitrozellulose-Pads. An dieser Stelle führen wir keine Assay-Normalisierung auf der Grundlage quantitativer Ergebnisse der Qualitätskontrolle durch, da die nachgewiesene Bindung von Anti-His-Antikörpern durch die Verfügbarkeit dieses Tags beeinflusst werden kann, die von der dreidimensionalen Konformation abhängt. spezifisch für jedes Antigen.

Das Influenza-Antigen-Mikroarray bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden wie ELISA und ergänzt funktionelle Tests wie HAI und MN. Das 16-Pad-Protein-Mikroarray ist eine probensparende Technologie mit der Fähigkeit, Antikörper mehrerer Isotypen gleichzeitig gegen etwa 300 Antigene aus 1 L Serum zu messen. Die Anzahl der Antigene kann auf Tausende erhöht werden, indem die Anzahl der Pads pro Dias verringert wird. Der Multiplex-Assay spart auch Personalzeit und Verbrauchsmaterialien, da Hunderte von Seren in 2 Tagen auf Antikörper untersucht werden können und alle Materialien außer Dias und Reagenzien wiederverwendbar sind, so dass keine großen Mengen an Plastikmüll entstehen.

Während Microarray-Drucker möglicherweise nicht weit verbreitet sind, können Mikroarray-Dias an einem zentralen Ort gedruckt und dann zum Endbenutzer zur Sondierung transportiert werden. Die einzige Ausrüstung, die für die Sondierung benötigt wird, ist der kostengünstige und tragbare Imager. Das Ziel der Verbreitung dieses Protokolls ist es, die Nutzung dieser Technik weiter zu verbreiten.

Die Haupteinschränkungen des Influenza-Antigen-Mikroarrays sind die Unfähigkeit, die Funktion und Kinetik der nachgewiesenen Antikörper zu charakterisieren. Das Mikroarray erkennt für jedes Antigen einen polyklonalen Satz von Bindungsantikörpern. Diese Antikörper können bei der Neutralisierung von Viren in HAI- und MN-Assays funktional sein oder nicht. HAI- und MN-Assays erfordern jedoch eine lebende Viruskultur mit dem damit verbundenen Bedarf an spezialisierten Einrichtungen mit hochrangigen Biosicherheitsschränken, um Antikörper gegen Vogelsubtypen der Influenza zu testen, während das Proteinmikroarray keine lebenden Viren umfasst. Komponenten können so in jedem Basislabor eingesetzt werden. In Bezug auf die Bindungskinetik ergibt eine einzelne Verdünnung des Serums, das mit einem Array mit einer einzigen Konzentration jedes Antigens untersucht wird, einen einzigen Datenpunkt, der einen Zusammengesetzten von Mengen und Affinität darstellt, der über alle Antikörper summiert wird, die an das Antigen binden. . Um die Antigen-Antikörper-Bindungskinetik vollständig aufzulösen, sind mehrere Antigenkonzentrationen und/oder serielle Verdünnungen von Seren erforderlich.

Trotz dieser Einschränkungen ist das Influenza-Antigen-Mikroarray ein nützliches Werkzeug, um die Breite von Influenza-Antikörpern in der gesamten antigenen Landschaft zu charakterisieren, die funktionelle Assays ergänzen können, die in Durchsatz und Verfügbarkeit begrenzter sind.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
16-pad nitrocellulose-coated glass slides	Grace Bio Labs	305016
1x GVS FAST blocking buffer	Fischer Scientific	10485356
ArrayCam portable imager	Grace Bio Labs	400S	Other imaging devices can be used to visualize slides if capable of achieving the resolution of the microarray spots and the excitation and emission wavelengths of the quantum dots.
Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG antibody	Thermo Fischer	31800
HiBase 384-well plate	Greiner Bio-One	T-3037-11
Microarray pins	ArrayIt	GMP2	Each different microarray printer may require its own custom microarray pins.
Mouse monoclonal poly-His antibody	Sigma-Aldrich	H1029
OmniGrid 100 microarray printer	GeneMachines		The version of the microarray printer used in this work is no longer commercially available, but the updated similar equipment is the OmniGrid Accent microarray printer from Digilab (Hopkinton, MA), and the same protocol can be carried out with most commercially available microarray printers.
ProPlate slide chambers	Grace Bio Labs	246890
ProPlate slide clips	Grace Bio Labs	204838
ProPlate slide frames	Grace Bio Labs	246879
Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA antibody	Grace Bio Labs	110620
Quantum dot 585 nm streptavidin conjugate	Thermo Fischer	Q10111MP
Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG antibody	Grace Bio Labs	110610