JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لإنتاج والخلفية CRISPR/كاس 9 الجينوم الأسماك الكهربائية ضربه قاضيه. المبينة بالتفصيل هي البيولوجيا الجزيئية المطلوبة ، وتربيه ، ومتطلبات تربيه لكل من عاريه القدمين والفطريات ، وتقنيات الحقن لإنتاج كاس 9 المستحثة اليرقات F0 .

Abstract

وقد تغيرت الكهرباء والتوليد الكهربائي في التاريخ التطوري من الفقاريات. هناك درجه مذهله من التقارب في هذه الأنماط الظاهرية المشتقة بشكل مستقل ، والتي تشترك في الهندسة الوراثية المشتركة. ولعل هذا هو أفضل مثال من قبل العديد من الميزات المتقاربة من عاريات والmormyrids ، وهما الأنواع الغنية تيليست التوثيق التي تنتج والكشف عن المجالات الكهربائية الضعيفة وتسمي الأسماك الكهربائية ضئيله. في السنوات 50 منذ اكتشاف ان الأسماك الكهربائية ضعيف استخدام الكهرباء للشعور محيطها والتواصل ، وقد اكتسبت مجتمع متنام من العلماء رؤى هائله في تطور التنمية والنظم والدوائر علم الأعصاب ، فسيولوجيا الخلوية ، والإيكولوجيا ، والبيولوجيا التطورية ، والسلوك. وفي الاونه الاخيره ، كان هناك تكاثر في الموارد الجينية للأسماك الكهربائية. وقد يسر استخدام هذه الموارد بالفعل رؤى هامه فيما يتعلق بالصلة بين النمط الجيني والنمط الظاهري في هذه الأنواع. ومن العقبات الرئيسية التي تحول دون دمج بيانات الجينوم مع البيانات الظاهرية للأسماك الكهربائية الضعيفة نقص حالي في أدوات الجينوم الوظيفية. نحن الإبلاغ هنا بروتوكول كامل لأداء CRISPR/كاس 9 الطفرات التي تستخدم أليات إصلاح الحمض النووي الذاتية في الأسماك الكهربائية ضعيف. ونحن نثبت ان هذا البروتوكول هو نفس القدر من الفعالية في كل من الأنواع القنوميه بالضغط البري والضرب بالضغط العضلي الخاص gauderio باستخدام crispr/كاس 9 لاستهداف indels ونقطه الطفرات في اكسون الأول من قناه الصوديوم الجينات scn4aa. باستخدام هذا البروتوكول ، تم الحصول علي الاجنه من كلا النوعين والتنميط الجيني للتاكد من ان الطفرات المتوقعة في أول اكسون من قناه الصوديوم scn4aa كانت موجودة. تم تاكيد النمط الظاهري نجاح ضربه الخروج مع التسجيلات التي تظهر انخفاض الجهاز الكهربائية التفريغ السعه بالمقارنة مع الضوابط المتطابقة حجم غير المحقونة.

Introduction

وقد تغيرت الكهرباء والتوليد الكهربائي في التاريخ التطوري من الفقاريات. اثنين من السلالات من الأسماك تيليوست ، العظم العظمي و siluriformes ، تطورت الكهربي في موازاة ذلك ، وخمسه السلالات من تيليوستس (جينوتيفورسيس ، mormyrids ، والأجناس astroscopus، مالتراوروس ، والزليلي) تطورت الكهربية بالتوازي. هناك درجه ضرب من التقارب في هذه الأنماط الظاهرية المستمدة بشكل مستقل ، والتي تشترك في العمارة الوراثية المشتركة1،2،3.

ولعل هذا هو أفضل مثال من قبل العديد من الميزات المتقاربة من عاريات والmormyrids ، وهما الأنواع الغنية تيليست clades ، والتي تنتج والكشف عن الحقول الكهربائية الضعيفة وتسمي الأسماك الكهربائية بشكل ضعيف. في السنوات 50 منذ اكتشاف ان الأسماك الكهربائية ضعيف استخدام الكهرباء لاستشعار محيطها والتواصل4، وقد اكتسبت مجتمع متنام من العلماء رؤى هائله في تطور التنمية1،5 ،6، نظم ودوائر علم الأعصاب7،8،9،10، فسيولوجيا الخلوية11،12، الإيكولوجيا و تصغر13 ،14،15،16،17، السلوك18،19، و ماكروايفوليوشن3،20،21 .

في الاونه الاخيره ، كان هناك انتشار الجينوم ، الناسخ ، والموارد البروتينية للأسماك الكهربائية1،22،23،24،25،26، 27و28. وقد أسفر استخدام هذه الموارد بالفعل عن رؤى هامه فيما يتعلق بالصلة بين النمط الجيني والنمط الظاهري في هذه الأنواع1و2و3و28و29 ،30. ومن العقبات الرئيسية التي تحول دون دمج بيانات الجينوم مع البيانات الظاهرية للأسماك الكهربائية الضعيفة نقص حالي في أدوات الجينوم الوظيفية31.

واحده من هذه الاداات هي التي تم تطويرها مؤخرا متفاوت المسافات المتقاربة بانتظام المتناظرة القصيرة التكرارات المقترنة مع كاس 9 نوكليوداز (CRISPR/كاس 9 ، CRISPR) تقنيه. Crispr/كاس 9 هو أداه تحرير الجينوم التي دخلت استخداما واسع النطاق في كل من نموذج32،33،34 وغير الكائنات النموذجية35،36،37 علي حد سواء. وقد تقدمت تكنولوجيا CRISPR/كاس 9 إلى نقطه حيث يمكن للمختبر قادر علي البيولوجيا الجزيئية الاساسيه بسهوله توليد تحقيقات الجينات الخاصة تسمي الإرشاد القصير RNAs (sgRNAs) ، بتكلفه منخفضه باستخدام طريقه عدم الاستنساخ38. Crispr لديه مزايا علي غيرها من الضربات القاضية/الضربة القاضية استراتيجيات, مثل مورفولينوس39,40, النسخ المنشط مثل المنحرف المستجيب (talens), والزنك الاصبع نوكليسيس (zfns), التي هي مكلفه و تستغرق وقتا طويلا لتوليد كل الجينات المستهدفة.

وظائف نظام CRISPR/كاس 9 لخلق الضربات القاضية الجينات من خلال استهداف منطقه معينه من الجينوم ، من إخراج تسلسل sgRNA ، وتسبب كسر التي تقطعت بهم السبل مزدوجة. يتم الكشف عن الكسر المزدوج الذي تقطعت به السبل من قبل الخلية ويحفز أليات إصلاح الحمض النووي الذاتية بتفضيل باستخدام المسار غير المتماثلة نهاية الانضمام (NHEJ). هذا المسار هو عرضه للخطا للغاية: خلال عمليه الإصلاح ، وجزيء الحمض النووي وغالبا ما تدمج الادراج أو الحذف (indels) في موقع كسر التي تقطعت بها السبل مزدوجة. هذه العوامل يمكن ان يؤدي إلى فقدان وظيفة بسبب اما (1) التحولات في اطار القراءة المفتوحة ، (2) ادراج codon توقف سابق لأوانه ، أو (3) التحولات في البنية الاساسيه الحرجة من المنتج الجيني. في هذا البروتوكول ، ونحن نستخدم CRISPR/كاس 9 التحرير إلى الطفرات نقطه الهدف في الجينات المستهدفة باستخدام NHEJ في أنواع الأسماك الكهربائية ضعيفه. في حين ابسط وأكثر كفاءه من التقنيات الأخرى ، ومن المتوقع ان يؤدي هذا الأسلوب من الطفرات في مجموعه من السلالات الظاهرية في F0، والذي يعزي إلى الجينات الوراثية41،42،43 ،44.

اختيار الكائنات الحية
ولأغراض تيسير الدراسات المقبلة بشان الجينوم المقارن للأسماك الكهربائية الضعيفة ، هناك حاجه إلى اختيار نوع تمثيلي لكل من النماذج الرياضية والmormyrids لتطوير البروتوكول. وفي أعقاب المناقشات التي جرت خلال اجتماع 2016 الأسماك الكهربائية في مونتيفيديو ، اوروغواي ، كان هناك توافق في الآراء بين المجتمعات المحلية لاستخدام الأنواع التي يمكن تربيتها بالفعل في المختبر والتي تتوفر لديها موارد جينيه. وقد تم اختيار الأنواع التي تناسب هذه المعايير والتي تم تحديدها بالشكل المثالي لهذا النوع من الكائنات. في كلا النوعين ، من السهل تقليد العظة الطبيعية للحث علي ظروف التكاثر والحفاظ عليها في الأسر. B. gauderio، الأنواع عاريه الشكل من أمريكا الجنوبية ، لديه ميزه انخفاض متطلبات التربية: يمكن الاحتفاظ بالأسماك في كثافة عاليه نسبيا في الدبابات الصغيرة نسبيا (4 لتر). B. gauderio لديها أيضا دوران الأجيال بسرعة في ظل ظروف الأسير. تحت الظروف المختبرية ، b. gauderio يمكن ان تتطور من البيض إلى الكبار في حوالي 4 أشهر.

B. بالضغط الذاتي ، وهو نوع من الأسماك القنوميه من غرب وسط افريقيا ، والسلالات بسهوله في الأسر. B. بسهوله المتاحة من خلال التجارة حوض السمك ، وقد استخدمت علي نطاق واسع في العديد من الدراسات ، والآن لديها عدد من الموارد الجينوم المتاحة. تمتد دوره حياتهم من 1 − 3 سنوات ، اعتمادا علي الظروف المختبرية. وتعد متطلبات التربية أكثر كثافة إلى حد ما بالنسبة لهذه الأنواع ، التي تتطلب دبابات متوسطه الحجم (50 − 100 لتر) بسبب عدوانها اثناء التكاثر.

وينبغي ان تكون المختبرات التي تدرس أنواعا أخرى من الأسماك الكهربائية قادره علي تكييف هذا البروتوكول بسهوله ما دام النوع يمكن ان يولد ، ويمكن جمع أجنه الخلايا الوحيدة وتربيتها في مرحله البلوغ. ومن المرجح ان تتغير معدلات الإسكان وتربيه اليرقات والإخصاب في الأنابيب مع الأنواع الأخرى ؛ ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول كنقطه انطلاق لمحاولات تربيه في الأسماك الكهربائية الأخرى ضعيفه.

هدف الجينات المثالي لإثبات المفهوم: scn4aa
[مورلي] كهربائيه [مورميريد] و [غنوتيفورم] سمكه يلدون [الكتريك فيلد] ([الكتروجينيسيس]) ب يقيل جهاز يختص, يدعي الجهاز كهربائيه. تصريف الأعضاء الكهربائية (EODs) نتيجة لإنتاج في وقت واحد من إمكانات العمل في خلايا الجهاز الكهربائي يسمي الكتروسيتس. يتم الكشف عن EODs بواسطة مجموعه من المستقبلات الكهربية في الجلد لإنشاء صور كهربائيه عاليه الدقة لمحيط الأسماك45. الأسماك الكهربائية ضعيفه هي أيضا قادره علي الكشف عن ملامح الموجات التخلص من الذخائر المتفجرة الخاصة بهم18 وكذلك معدلات التفريغ الخاصة بهم46، مما يسمح eods للعمل بالاضافه إلى ذلك كاشاره الاتصالات الاجتماعية مماثله للطيور أو الضفدع النطق47.

المكون الرئيسي للعمل توليد المحتملة في الكهرباء من كلا القنوميه وعاريه السمك الكهربائية ضعيف هو الجهد بوابات قناه الصوديوم التنقل 1.42. لاكهربائية تيليوستس التعبير عن نسختين بارالوجوس الجينات ، scn4aa و scn4ab، والترميز لقناه الصوديوم الجهد بوابات التنقل 1.430. في كل من عاريه الشكل و القنوميه الأسماك الكهربائية ضعيفه السلالات, scn4aa تطورت بسرعة وخضع العديد من البدائل الأحماض الامينيه التي تؤثر علي خصائصه الحركية48. الأهم من ذلك ، أصبح scn4aa مجزاه في كلا السلالتين إلى الجهاز الكهربائي2،3. التعبير المقيد نسبيا من scn4aa إلى الجهاز الكهربائي ، فضلا عن دورها الرئيسي في توليد المواد المستنفدة للأوزون ، يجعلها هدفا مثاليا لتجارب الضربة القاضية crispr/كاس 9 ، كما ان لديها الحد الأدنى من الآثار الوخيمة الضارة. لان الأسماك الكهربائية الضعيفة تبدا التفريغ أجهزتهم الكهربائية اليرقات 6 − 8 أيام بعد الإخصاب (DPF) ، واستهداف scn4aa هو مناسبه بشكل مثالي للنمط الظاهري السريع بعد الحقن المجهري الجنين.

Protocol

تمت الموافقة علي جميع الطرق الموصوفة هنا من قبل لجنه الرعاية الحيوانية المؤسسية والاستخدام (IACUC) من جامعه ولاية ميشيغان.

1. تحديد أهداف sgRNA

ملاحظه: يتم توفير بروتوكول للتصميم اليدوي من sgRNAs في الخطوة 1.1. وقد استخدم هذا لاختيار الهدف scn4aa . ويتم توفير بروتوكول إضافي لتيسير هذه العملية (الخطوة 1.2) باستخدام بوابه الويب الخاصة ب EFISHGENOMICS. ومن المستحسن ان المستخدمين تحديد بروتوكول 1.2 ، الذي يتميز العديد من "الشيكات" الألى لضمان النجاح في تصميم sgRNAs للأهداف المخصصة.

  1. تصميم أهداف sgRNA.
    1. لتوليد sgrna دليل oligos ، فمن الأفضل لاستهداف اكسون 1 ، أو غيرها من 5 ' اكسون. ويمكن استهداف 5 ' UTR; ومع ذلك ، فمن الأفضل لاستهداف 5 ' تسلسل الترميز. الاستفادة من المعلومات الجينية هو الأفضل ، ولكن من الممكن تطوير sgRNAs ناجحه باستخدام البيانات الناسخ. ومن الأفضل الشروح المتعلقة بالحدود الفاصلة بين الداخل والاخر (البيانات الجينية) أو حدود exon/exon.
    2. يتم البحث عن متواليات الجينوم المرشح من 1.1 للتسلسلات المستهدفة المفترضة التي تتطابق مع نمط 5 '-N (18)-NGG-3 '. يمكن تنفيذ ذلك تلقائيا باستخدام برنامج تحليل تسلسل سطح المكتب أو البرامج النصية المخصصة أو من خلال الفحص اليدوي للتسلسل.
    3. يمكن إعطاء الاولويه للتسلسل باستخدام طريقه Doench et al.49 للنشاط المستهدف. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن تقييم التسلسلات المستهدفة عن طريق البحث عن الانفجارات ضد قواعد البيانات الجينية/الناسخة للربط خارج الهدف.
    4. تاكد من انه يمكن إنشاء الإشعال PCR القياسية التي الجناح تسلسل الهدف. يجب ان تكون الإشعال 20 bp علي الأقل من جانبي موقع القطع (ثلاثه قواعد منبع سلسله NGG). ومن الناحية المثالية ، يجب ان يكون المنتج PCR 150 − 200 أزواج القاعدة (bp).
    5. تصميم اوليغمرات الاجتماع المعايير المذكورة أعلاه باستخدام القالب أدناه ، والذي يتضمن T7 المروج (5 ' من N18) والمنطقة التكميلية (3 ' ن18) للصلب إلى القلة المستمرة (1 ، 25): 5 '-تاتاكجاكتكاكتاتاج-n18 -Gttttagagctagaaatagcaag-3 '
      ملاحظه: لا يتضمن تسلسل N18 المتتالية المجاورة ل ngg protospacer عزر (بأم). لا تشمل هذا في قله العمر.
    6. تامر القلة المستمرة (الجدول 1) التي سيتم استخدامها لتوليف جميع sgRNAs ، قله المواليد لأهداف Sgrnas (الخطوة 5 ، 10) ، والإشعال PCR (الخطوة 1-1-4) كما القياسية القلة المحلية من خدمه إنتاج قله الكريات الدنيا. ويمكن ان يؤمر قله المواليد والإشعال PCR كمعيار القلة المحلية ، لا تنقيه اضافيه ضرورية.
  2. تنفيذ التصميم الألى للأهداف sgRNA.
    1. باستخدام البيانات الجينية ، حدد جين هدف. ويمكن استخدام البيانات الناسخة بدلا من ذلك عندما تعرف الحدود exon/داخل. ويمكن تحديد الأهداف باستخدام بوابه EFISHGENOMICS (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu). سيكون الهدف المثالي داخل اكسون 1 ؛ ومع ذلك ، الأخرى 5 ' الاكسون و 5 ' utr يمكن النظر فيها.
    2. وبمجرد التعرف علي التسلسل المستهدف ، يمكنك تحميل أداه ويب EFISHGENOMICS CRISPR المتاحة بحريه (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu/crispr_tool/). تستخدم أداه ويب هذه إصدار مخصص من خوارزميه crispor للجيل المستهدف50،51.
    3. في المربع الخاص بالخطوة 1، ادخل اسم التسلسل وادخل تسلسل الهدف في المربع المناسب.
  3. حدد الجينوم المناسب الذي يستمد التسلسل منه. في الحاضر ، تتوفر البيانات الجينية ل b. الكثيستييوس و b. gauderio. لا يلزم تسلسل الجينوم لاستخدام هذه الاداه ولكنها مفيده في تقييم الآثار غير المرغوب فيها المحتملة خارج الهدف.
  4. حدد PAM المناسبة. ومن المستحسن 20 bp-NGG PAM, علي الرغم من ان هناك العديد من الزخارف بأم اضافيه للاختيار من بينها, اعتمادا علي البروتين كاس 9 المستخدمة.
  5. سيتم إنشاء تقرير مع موقع تسلسل الهدف في الجينوم مع تسلسل الدليل المقترح. حدد ثلاثه أهداف مع انخفاض الآثار المتوقعة خارج الهدف ، ودرجات الدقة العالية ، ودرجات الكفاءة العالية. ويسلط الضوء علي اعلي تسلسل دليل التهديف مع الأخضر علي الجانب الأيسر. وينبغي تجنب الأصفر والأحمر تسلسل دليل المبرزة ، إذا كان ذلك ممكنا.
  6. يؤدي النقر فوق التسلسلات المستهدفة المحددة إلى إنشاء تقرير CRISPOR شامل. والمعلومات الرئيسية المستمدة من هذه التقارير هي "التعبير الT7 في المختبر من تداخل القلة الكريات". من هذا التقرير ، استخراج المعلومات التالية: أوصت sgRNA oligos ، PCR الإشعال للموقع المستهدف ، والقلة المستمرة التي سيتم استخدامها لتوليف جميع Sgrna.
  7. اطلب من مجموعه القلة المختارة (الخطوة 1.6) من خدمه إنتاج قله الكريات الوحيدة. ويمكن ان يؤمر قله المواليد والإشعال PCR كمعيار القلة المحلية ، لا تنقيه اضافيه ضرورية.

2. توليد sgRNA

  1. اننيل اوليغمرات في أنبوب PCR: أضافه 1 μL من 100 ميكرومتر ثابته اوليغمير ، 1 μL من 100 μM sgRNA محدده القلة ، و 8 μL من النيوداز خاليه H2س
  2. اننيل اوليغمرات في ثيرموسيكلير مع البرنامج التالي: الحرارة في 95 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، بارده إلى 85 درجه مئوية في-2 درجه مئوية/ثانيه ، بارده إلى 25 درجه مئوية في 0.1 درجه مئوية/ثانيه ، وعقد في 4 درجه مئوية.
  3. لتوليد قالب sgRNA ، أضافه 2.5 μL من المزيج dNTP (10 ملم) ، 2 μL من 10x العازلة ، 0.5 μL من الحمض النووي T4 ، و 5 μL من النيوداز خاليه H2O إلى القلة الصلبة من الخطوة 2.2. احتضان لمده 20 دقيقه في 12 درجه مئوية.
  4. تنقيه قالب باستخدام PCR تنظيف العمود في تعليمات الشركة المصنعة.
  5. Elute في 20-30 μL. استخدام مقياس طيفي لتقدير التركيز والنقاء. يجب ان يكون القالب 100 – 200 نانوغرام/μL و 1.8-1.9 A260/280.
  6. تحقق من خلال هلام اجبرز عن طريق تشغيل 1-5 μL. يجب ان يكون النطاق المهيمن 120 bp. انظر الشكل 1 الف للاطلاع علي النتائج التمثيلية.
  7. مخزن هلام التحقق من قالب sgRNA في-20 درجه مئوية (طويلة الأجل) أو 4 درجه مئوية (قصيرة الأجل ، 1-4 أسابيع).
  8. نسخ sgRNA باستخدام T7 الحمض الريبي النيبالي النسخ عده من خلال أضافه إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 mL في درجه حرارة الغرفة 8 μL من المزيج dNTP (وحدات متساوية من دا ، dT ، dG ، dC) ، 2 μL من 10x العازلة (درجه حرارة الغرفة) ، 2 μL من T7 الحمض ، وخاليه من النيوداز H2O إلى حجم إجمالي 20 μl. تدور لجمع في الجزء السفلي. احتضان لمده 2 – 4 ح عند 37 درجه مئوية.
  9. أضافه 1 μL من DNase واحتضان 15 دقيقه اضافيه في 37 درجه مئوية.
    1. تنظيف sgRNA عن طريق أضافه 1 μL من الجليكوجين ، 30 μL من النيوداز خاليه H2O ، 30 μl من 5 م خلات الأمونيوم و 180 μl من 100 ٪ etoh لكتب sgRNA. تخلط جيدا واحتضان ما لا يقل عن 20 دقيقه في-80 درجه مئوية (حتى المجمدة) أو في-20 درجه مئوية بين عشيه وضحيها. أجهزه الطرد المركزي في 4 درجه مئوية لمده 15 دقيقه في السرعة القصوى.
  10. أزاله وتجاهل ماده طافي دون إزعاج بيليه ، ويغسل مع 1 مل من rnase خاليه 70 ٪ etoh المبردة في-20 درجه مئوية. تدور اضافيه 5 دقيقه في السرعة القصوى عند 4 درجه مئوية.
  11. أزاله وتجاهل ماده طافي دون إزعاج بيليه ، والهواء الجاف بيليه لمده 5 دقائق.
  12. أعاده التعليق في 30 μL من النيوداز-ح2س وتحديد النقاء والغلة باستخدام الاشعه فوق البنفسجية الطيفي (الحد الأدنى لمحصول 200 Ng/μl).
  13. تحقق من وجود sgRNA علي هلام خاليه من RNase. يظهر sgRNA بين 50 و 150 bp كنطاقين بسبب البنية الثانوية (الشكل 1B).
  14. Aliquot إلى 3 μL وتخزين في-80 درجه مئوية.

3. التحقق من كفاءه القطع في المختبر

  1. استخراج الحمض النووي الجيني من الأنواع المستهدفة باستخدام مجموعه استخراج الحمض النووي التجارية. يمكن استخدام قصاصات الزعنفة البطنية دون الحاجة إلى التضحية بالأسماك ، لان الانسجه يتم أعاده إنشائها.
  2. تضخيم منطقه الحمض النووي الهدف باستخدام الإشعال مصممه كما هو موضح في الخطوات 1.6 و 1.7 باستخدام PCR القياسية. تحقق من المنتج عن طريق الكهربائي هلام. ويقترح تسلسل الجزء لضمان تضخيم المنطقة المناسبة ، ولكن ليس من الضروري. تظهر النتائج التمثيلية لقالب scn4aa في الشكل 2.
  3. تنظيف جزء PCR مع المختبر الراسخ أو بروتوكول الشركة.
  4. خزن الحمض النووي المضخم عند-20 درجه مئوية. النظر في فصلها إلى قسامات للحد من دورات تجميد الذوبان.
  5. تحديد الكميات ووحدات التخزين المطلوبة لكل مكون. النظر في تشغيل عناصر التحكم السلبية (باستثناء اما sgRNA أو كاس 9) وعنصر تحكم إيجابي (sgRNA اختبارها سابقا ان يلتصق الهدف PCR تضخيم الحمض النووي) إذا كانت متاحه ، فضلا عن سلسله تركيز من sgRNA.
  6. اعداد خليط التفاعل أدناه في الترتيب المحدد في أنبوب PCR في درجه حرارة الغرفة ، مضيفا sgRNA و كاس 9 البروتين الماضي للحصول علي أفضل النتائج: 50-100 نانوغرام من المنتج الحمض النووي PCR الهدف ، 1 μL من 10x العازلة 3 ، 1 μL من 10x بوسنيا (0.1 g/mL) ، 50-200 نانوغرام من البروتين كاس 9 (1 ملغ/مل ، 150 ng المقترحة) ، و 30-200 من نانوغرام sgRNA (100 ng المقترحة).
    1. احتضان رد الفعل في 37 درجه مئوية لمده 1 ساعة ثم في 65 درجه مئوية لمده 10 دقيقه لتعطيل بروتين كاس 9.
    2. تشغيل العينة بأكملها علي 2 ٪-3 ٪ هلام اجبرز (احجام الفرقة المتوقعة بين 30-200 bp) جنبا إلى جانب مع الضوابط الايجابيه والسلبية. الانقسام الناجح قد تظهر بعض المنتجات PCR ولكن سيكون أيضا اثنين من العصابات الصغيرة. وترد النتائج التمثيلية في الشكل 2.

4. الحصول علي الاجنه

ملاحظه: الحصول علي الاجنه من الأسماك الكهربائية ضعيف يمكن ان يكون تحديا. الرصد الدقيق لنوعيه المياه ، والوقت الكافي لرعاية الأسماك ، والتغذية العادية هي المفتاح لبرنامج تربيه ناجحه. يجب أولا ان تكون مشروطه الأسماك لعده أسابيع للاستنساخ52 كما هو موضح في الخطوة البروتوكول 4.1. وبعد ذلك ، يتم تقديم بروتوكول لزيادة التكتل الطبيعي (4.2) لاستخدامه في سلوك التفريخ الطبيعي (4.3) ، وهو بديل استحدث مؤخرا في المختبر للحصول علي الاجنه الموقوتة بدقه (4.4). البروتوكول 4.3 بنفس القدر من الفعالية ل b. الكثييسيوس و b. gauderio، وبروتوكول 4.4 متفوقة في b. gauderio.

  1. تكييف
    1. الاحتفاظ بها في الأزواج/المجموعات الصغيرة (100-150 l دبابات) أو في خزانات كبيره جدا (2 الذكور و 5-6 الإناث في حوالي 475 لتر دبابة) ، لأنها تصبح عدوانيه جدا في ظل ظروف التكاثر. يجب ان يكون هناك علي الأقل 1-2 أنابيب PVC لكل سمكه لاستخدامها كملجا (الشكل 3 ا،ب).
    2. B. gauderio يمكن ان تربي في كثافة اعلي بكثير. الحفاظ علي ما يصل إلى ثمانيه افراد في خزان 100 L (2 الذكور و 6 الإناث). يجب ان يكون هناك علي الأقل 1 PVC أنبوب لكل سمكه لاستخدامها كملجا. أضافه خيوط متشابكة يزيد من التخصيب والاختباء البقع. أضافه أنابيب الطرد المركزي 50 mL مع ثقوب قطرها 1 سم حفر فيها إلى الأعلى من الخزان للسماح للبالغين تفرخ بشكل طبيعي في أنابيب (الشكل 3C).
    3. وخلال موسم التكاثر ، تغذي الديدان السوداء الطازجة اليومية التي تستكمل بالديدان الدموية المجمدة. يمكن إثراء الطعام بالفيتامينات والمكملات الغذائية ، إذا رغبت في ذلك.
    4. الأسماك المنزلية عاده في الموصليه عاليه نسبيا (300-600 μS) ، محلول متوازن pH. خلال موسم التكاثر ، وخفض تدريجيا الموصليه من قبل ما لا يقل عن نصف علي مدي 1-3 أسابيع للحث علي تجدد الغدد التناسلية والتفريخ. انخفاض الموصليه عن طريق الإضافات اليومية من التناضح العكسي (RO) المياه ، والحفاظ علي اهتمام وثيق لدرجه الحموضة عندما الموصليه منخفضه (pH < 6).
    5. ويمكن الحفاظ علي ظروف التكاثر لحوالي 3 − 5 أشهر مع تناقص إنتاج البيض مع مرور الوقت. بعد هذا الوقت ، وأعاده الأسماك إلى الموصليه العالية ببطء أكثر من 1-3 أسابيع. الحفاظ علي 3 أشهر أخرى في الموصليه عاليه قبل ان تتعرض لظروف التكاثر مره أخرى.
  2. استخدام عامل التفريخ (SGnRHa + Domperidone) الحقن.
    1. تحديد الأسماك الانثويه في ظروف التكاثر التي تظهر بالفريك (الشكل 4). في b. gauderio سيكون الإناث تورم الغدد التناسلية فقط الذيليه إلى تنفيس. B. الإناث بالضغط الشديد سيكون لها بطون متورمة وتبدو جسديه عميقة (الشكل 4a). الذكور عموما ليس لديهم قضية إنتاج السائل المنوي. مهما, يفضل ذكران كبيره واجبه إلى الكبيرة عنبر حجم يجمع.
      ملاحظه: عامل التفريخ هو مزيج هرمون التجارية التي تسهل نضوج الامشاج وإحداثيات التفريخ. إذا تم حقن الأسماك مع عامل التفريخ في الماضي ، والسماح لمده > 4 أسابيع من الراحة والتغذية وافره بين الحقن. نقترح حقن ما لا يقل عن 2 ذكور و 4 – 5 إناث لضمان عدد قليل من براثن البيض والكثير من السائل المنوي.
    2. تخدير الأسماك في MS-222 (0.4 g/3 L) لبضع دقائق ، حتى الأسماك ليست قادره علي الحفاظ علي موقفها ، غير المتنقلة ، ولكن لا تزال لديها حركه المعامل (المرحلة الثانية53).
    3. تزن الأسماك (ز) لحساب كميه عامل التفريخ ، (0.5 μL/g) + 0.5 μL. حسابات اضافيه 0.5 μL لأخطاء التنضيد.
    4. أضافه عامل التفريخ إلى وحدات تخزين 4x من العازلة (1x تلفزيوني أو DPBS) في أنبوب PCR وتخلط جيدا. سيصبح الحل غائما. فانه يساعد علي الاستغناء عن عامل التفريخ علي الحرارة ومن ثم استخدام ماصه لقياس الجرعة المحسوبة. عامل التفريخ لزج ، لذلك تاكد من الاستغناء عن الجرعة بأكملها وتوخي الحذر مع التنضيد.
    5. ماصه محلول الحقن علي الحرارة والتعادل في حقنه زجاجيه الدقة ، وتجنب فقاعات الهواء. ونحن نوصي 28 G ، 19-25 ملم طول ، ابره مشطوف.
    6. حقن المحلول في عضله الجذع الظهرية بمعدل سلس. دع الابره تجلس لمده 2 – 4 ثانيه ثم تزيلها. وضع الأسماك علي الفور في المياه نظام جديد للانتعاش.
    7. بعد حوالي 24 ح الاستعداد لجمع الاجنه (انظر 4.3 أو 4.4). جمع جميع المواد اللازمة بما في ذلك ما هو مطلوب لحقن الخلايا المجهرية واحده (انظر القسم 5).
  3. الحصول علي الاجنه من خلال التفريخ الطبيعي.
    1. منزل عامل التفريخ-حقن البالغين (4.2) في خزانات كبيره 450 L. نسب الجنس الأكثر فعاليه وعاده ما كانت 1-2 الذكور و 3-4 الإناث مع أماكن اختباء كافيه مصنوعة من أنابيب PVC ، والركيزة من الرخام الداكن علي قاع الخزان لمنع استهلاك البيض. الرخام وعاده ما تكون أكثر اهميه ل b. بالضغط العالي من b. gauderio، الذي يفضل إيداع البيض لزجه في الشقوق أو 50 mL أنابيب الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه.
    2. ضع السمك في دوره الضوء العكسي لمطابقه التفريخ الليلي مع ساعات العمل المعملية العادية. باستخدام نظام أمن الصف المستهلك خارج الرف ، ومراقبه الأسماك باستخدام الاشعه تحت الحمراء الاضاءه للتقليل من الإزعاج من جهاز كمبيوتر متصل عن بعد (الشكل 3).
    3. وسوف تفرخ الأسماك تلقائيا خلال الضوء الداكن حوالي 24 ساعة بعد حقن عامل التفريخ.
    4. عند بدء التفريخ ، وجمع البيض كل ساعة في حين يحدث السلوك التفريخ. في b. بالضغط العضلي ، وجمع البيض باستخدام سيفون قطرها الصغيرة علي شبكه القطن غرامه صافي للحد من الاضرار التي لحقت البيض الطازجة. جمع البيض b. gauderio من أنابيب الطرد المركزي 50 mL أو خزان الركيزة. العمل بكفاءة مع الحد الأدنى من الإزعاج لتفريخ الأسماك باستخدام مصباح الراس مع ضوء احمر منخفض الكثافة. كما يحدث الانقسام الأول ما يقرب من 1 ح بعد الإخصاب (HPF) ، وجزء كبير من البيض تكون مناسبه لحقن ميكروخليه واحده.
    5. الشروع فورا في الحقن المجهري (انظر القسم 5).
  4. ضغط الذكور للإخصاب في المختبر من b. gauderio.
    1. اعداد محلول السائل المنوي الموسع (SES) كما هو موضح في كتاب Zebrafish54: 10 مم hepes ، 80 Mm kcl ، 45 mm كلوريد الصوديوم ، 45 mm خلات البوتاسيوم ، 0.4 Mm cacl2، و 0.2 مم mgcl2.
      1. استخدام ddH2O لجلب إلى حجم وضبط درجه الحموضة إلى 7.7 مع 1 م naoh.
      2. يحفظ في الثلاجة.
      3. فلتر من خلال فلتر 0.22 μm قبل الاستخدام.
    2. تخدير الأسماك في MS-222 (0.4 g/3 L) لبضع دقائق ، حتى الأسماك ليست قادره علي الحفاظ علي موقفها ، غير المتنقلة ، ولكن لا تزال لديها حركه المعامل (المرحلة الثانية53). ضع 500 μL علي الارصفه من SES في الجليد.
    3. تجفيف اليدين والأسماك جيدا ، وخصوصا حول الراس وتنفيس. وضع الجانب البطني حتى ، الامامي إلى اليسار (للافراد اليمين) في رغوة البوليسترين/حامل الإسفنج مغطاه في 222 MS--الرطب ، منشفه مبلله ورقه. وينبغي ان يكون الراس موازيا للجدول قدر الإمكان.
      ملاحظه: الخطوات 4.4.4 – 4.4.6 يجب ان يتم في أسرع وقت ممكن, والأسماك يجب ان تكون فقط من الماء لمده 30-60 s.
    4. تطبيق الضغط في الذيليه إلى اتجاه منقاري مع الضغط الخفيف الوسيط علي الغدد التناسلية نحو تنفيس. قد تطرد الأسماك النفايات. كن حذرا لتنظيف تنفيس مع مسح مهمة حساسة إذا تم طرد اي النفايات. لا تجمع النفايات مع السائل المنوي. اعتمادا علي حجم الذكور ، 10-60 μL هو شائع.
    5. باستخدام الأنابيب الصغيرة مع طرف ، وجمع بعناية السائل المنوي كما انها تقلص من الذكور في الزيادات 50 μL. وضع السائل المنوي مباشره في 500 μL الطحالب المجهرية من SES علي الجليد. قد يكون من المفيد ان يساعد باحث آخر في جمع المني بينما يضغط الآخرين. يجب استخدام السائل المنوي في أقرب وقت ممكن ، ولكن يبقي قابلا للحياة لمده 1 ساعة علي الأقل.
    6. مباشره بعد جمع ، ووضع الأسماك في المياه نظام جديد للانتعاش. يجب ان تكون الأسماك فقط من الماء لمده 30-60 s.
  5. ضغط الإناث للإخصاب في المختبر من b. gauderio.
    1. تخدير الأسماك في MS-222 (0.4 g/3 L) لبضع دقائق ، حتى الأسماك ليست قادره علي الحفاظ علي موقفها ، غير المتنقلة ، ولكن لا تزال لديها حركه المعامل (المرحلة الثانية53). ضع ورقه بوليتترافلوروثيني علي محطه العمل.
      ملاحظه: الأقسام 4.5.1 – 4.5.5 ينبغي ان يتم في أسرع وقت ممكن والأسماك يجب ان تكون فقط من الماء لمده 30-60 s.
    2. جفاف اليدين ، والاداات ، ورقه بوليتترافلوروثيني ، والأسماك جيدا ، وخصوصا حول الراس وتنفيس. ضعها علي الجانب الامامي مع الراس الاماميه (للافراد الأيمن).
    3. تطبيق الضغط في الذيليه إلى اتجاه منقاري مع الضغط الخفيف الوسيط علي الغدد التناسلية نحو تنفيس. قد تطرد الأسماك النفايات. كن حذرا لتنظيف تنفيس مع مسح مهمة حساسة إذا تم طرد اي النفايات. اعتمادا علي حجم الأسماك ، 20-150 البيض هو شائع. باستخدام ملعقة المغلفة بوليتترافلوروثيني/أداه بعناية جمع البيض كما انها تقلص من cloaca. انقل البيض بسرعة إلى طبق بتري صغير وغطه. تاكد من بقاء البيض جافا خلال هذه العملية. بدلا من ذلك ، بعد الضغط ، لمس كتله البيض إلى قاعده طبق بيتري صغير أو إلى ورقه بوليتترافلوروثيني كما يتم طردهم من الإناث.
    4. مباشره بعد جمع ، ووضع الأسماك في المياه نظام جديد للانتعاش.
  6. أداء الإخصاب البيض للإخصاب في المختبر من b. gauderio.
    1. أضافه 100 μL من السائل المنوي مختلطة جيدا في SES (انظر الخطوة 4.4) مباشره علي كتله البيض.
    2. أضف 1 مل من مياه النظام (المصفاة من خلال فلتر 0.22 μm) واخلط جيدا لمده 30 – 60 ثانيه.
    3. أضافه 1-2 المياه نظام mL اضافيه (ترك بعض المساحة في طبق بيتري) ووضع في حاضنه. وقت قياسي من التلقيح الاصطناعي علي طبق بيتري والانتقال إلى حاضنه 29 درجه مئوية. تعيين المؤقت 50 دقيقه للتحقق من التقدم في التنمية (علي سبيل المثال ، تشكيل خليه واحده في قطب الحيوانية ، انظر الشكل 6). خلال هذا الوقت ، واعداد المواد للحقن المجهري.

5. خليه واحده ميكروحقن

  1. سحب ابر الحقن المجهري قبل حقن عامل التفريخ (الخطوة 4.2) أو التفريخ الطبيعي (الخطوة 4.3). استخدام الشعرية الزجاج بوروسيليكات مع خيوط (متعاطي 1.0 mm ، والهوية 0.58 ملم ، طول 10 سم) وساحبه ابره لسحب ابر حقن مجهريه. اعداد 2 – 4 ابر لكل حقن العلاج المخطط لها.
    ملاحظه: ويفضل الابر تحميل الخلفية مع خيوط ، لان خيوط فتائل الحل نحو غيض ويزيل فقاعات. ومع ذلك ، يمكن استخدام الابر دون خيوط والتحميل الامامي يجب ان يكون اي تاثير علي النتيجة. يجب ان يكون الابره طويلة ، ولكن تفتق قوي. استخدام ابره سحب البرنامج مع المواصفات التالية كنقطه انطلاق: الحرارة = 500 ؛ سحب = 70; السرعة = 70 ؛ والوقت = 100. ويرد في الشكل 5 الفالتمثيل الشكلي لابره.
  2. اعداد محلول الحقن واعداد الابره.
    1. أضافه 0.9 μL من sgRNA و 0.9 μL من انزيم كاس 9 (1 مغ/مل) إلى 0.2 μL من 10 ٪ أو 100 ٪ الفينول الأحمر (ل 1 ٪ و 10 ٪ تركيز الفينول الأحمر النهائي ، علي التوالي) في أنبوب PCR. تخلط جيدا والسماح الجلوس علي الجليد 2 − 5 دقيقه للسماح sgRNA و كاس 9 إلى المعقدة. حساب التركيز النهائي من sgRNA ، كاس 9 ، والفينول الأحمر في محلول الحقن.
      ملاحظه: إذا كان هناك مشاكل مع انسداد ابره أو قطع الكفاءة باستخدام وصفه أعلاه ، قد يكون من المفيد استخدام 1x التركيز النهائي الملح/العازلة مزيج لتحقيق الاستقرار كاس 9 ومنع انسداد ابره.
    2. استخدم طرف ماصه ميكرولودر لتحميل المحلول إلى 2 μL في ابره الحقن المجهري. طرد السائل بالقرب من الطرف قدر الإمكان.
    3. تحميل ابره في الجزئي وضبط إعدادات الضغط (تبدا مع 775 pi، 0.1 − 0.2 s ، و 8-12 pc).
    4. تحت النطاق ، استخدم زوج من الملقط الناعم لكسر طرف الابره بزاوية مشطوفة. كسر نحو حيث تفتق من الابره يبدا في الصلابة. فمن الأفضل لكسر أقرب إلى غيض ، واختبار حجم محلول الحقن ومن ثم كسر مزيد من الوقت إذا لزم الأمر. وينبغي ان تظل تتحمل الابره صغيره قدر الإمكان مع الحفاظ علي تفتق جامده (الشكل 5A).
    5. استخدام الزيوت المعدنية وميكرومتر لقياس حجم محلول الحقن. 1 – 2 يتم استخدام nL عاده; 0.1 ملم قطرها هو 0.5 nL.
    6. ضبط طرف الابره أو إعدادات الضغط للحصول علي حجم الحقن ضمن المواصفات.
  3. تحديد النامية تخليق ملقح واعداد مرحله الحقن. اعداد مرحله الحقن. خذ طبق بيتري قطر 100 ملم. عكس أسفل ومكان تحت الأعلى مقلوب. وضع شريحة المجهر الزجاجي داخل الأعلى المقلوب. اعتمادا علي كيفيه تحميل المفصلة الخاصة بك إلى النطاق ، قد يكون الارتفاع المضاف من القاعدة المقلوبة غير ضروري.
    1. ننظر إلى البيض النامية وتحديد المخصبة المفترضة تخليق ملقح 50-60 دقيقه بعد التلقيح الاصطناعي. وسوف تبدا القطب الحيواني لتشكيل وسوف يكون هناك فائض من قطرات الدهون الصغيرة حول الصفار/الحيوانية واجهه الخلية (الشكل 6).
    2. جمع 10-20 بيضه مع اقل قدر ممكن من الماء باستخدام ماصه نقل البلاستيك (قطع غيض قليلا للسماح البيض لتمرير) ووضع علي حافه الشريحة. وسوف يكون الماء الأشرار تحت الشريحة وسحب البيض ضد الحافة.
    3. استخدم مسح المهمة الحساسة واضغط برفق علي الشريحة لأزاله الماء الزائد والسماح للبيض بالتصاق بقوة بحافه الشريحة. يجب ان يكون هناك ما يكفي من الماء فقط للحفاظ علي البيض رطبه مع الحفاظ علي القليل من الرطوبة الدائمة لتجنب حركه البيض اثناء الحقن.
  4. حقن مباشره في خليه واحده.
    1. محاذاة البيض ضد الشريحة عموديا ، عمودي علي الابره تقترب (الشكل 5B).
    2. باستخدام الجزئي ، وضع الابره ضد chorion. في تقريبا 45 درجه زاوية ، ادراج الابره في chorion ، ومن ثم في خليه واحده. يمكن ان يكون مفيدا لدخول خليه واحده من خلال صفار البيض. نقل كل من مرحله الحقن مع اليد الحرة والجزئية قد توفر المزيد من السيطرة علي عمليه الحقن (الشكل 5 ب).
    3. حقن sgRNA/كاس 9/الفينول الحل الأحمر في خليه واحده. أزاله الابره بعناية. انتقل إلى البيضة التالية وكرر الخطوات 5.4.1 – 5.4.3 حتى يتم حقن جميع البيض.
    4. أزاله اي البيض مكسوره اثناء الحقن مع ملقط غرامه. استخدام 0.22 μm من المياه نظام تصفيتها في زجاجه بخ لأزاله البيض بلطف من مرحله الحقن إلى جديد 100 مم طبق بيتري القطر.
    5. كرر الخطوات 5.3.3 – 5.4.6 حتى يتم حقن جميع البيض أو طورت إلى مرحله الخليتين. احرص علي وضع حوالي 20 بيضه مخصبه مفترضه كعنصر تحكم بدون حقن لتحديد معدلات الإخصاب ونجاح الحقن. للحصول علي براثن أكبر استخدام الاجنه غير المحقونة التي تطورت إلى مرحله الخليتين ، النسبة براثن أصغر وضع جانبا البيض المخصب المفترض.
    6. بالاضافه إلى ذلك ، النظر في sgRNA/حقن التحكم عن طريق حقن 15-25 الاجنه مع كاس 9 معقده مع sgRNA ضد الجينات التي ليست موجودة في الجينوم. واوصي جين GFP لأجنه من النوع البري. تسجيل عدد من البيض والاباء والأمهات والتلقيح الاصطناعي الوقت ، والتاريخ علي كل طبق بيتري. تضمين sgRNA الهدف أو التسمية كما غير المحقونة. الانتقال إلى حاضنه 29 درجه مئوية.

6. تربيه المواشي

  1. اعتني بالبيض
    1. التحقق من سلامه البيض 4 – 6 ساعات بعد الحقن.
    2. تسجيل عدد من البيض الميت ، فضلا عن اي التي هي غير المخصبة. سيعتقل البيض غير المخصب حول المرحلة الثمانية للخلايا ويكون له نمط من الخلايا في قطب الماشية (الشكل 6). اعتمادا علي عدد من البيض الميت وكميه من الحطام البيض في الماء ، وأزاله ما لا يقل عن 50 ٪-80 ٪ من المياه واستبدال مع نظام تنقيه المياه. يمكن ان يكون من المفيد فرك الجزء السفلي من طبق بيتري إذا كان فيلم الحطام الخلوي أو اشكال بيوفيلم.
    3. للأيام التالية 2 – 3 ، افحص البيض 1 – 2 × يوميا. كرر الخطوات 6.1.2 – 6.1.3 في كل مره يتم فيها فحص البويضات.
    4. بعد 2 − 3 أيام سوف يفقس اليرقات. أزاله جميع أغلفه البيض لأنها يفقس. يمكن ان تساعد الأنابيب اللطيفة علي تحرير اليرقات نصف الفقس.
  2. رعاية اليرقات.
    1. افحص البيض 1 − 2x يوميا. كرر الخطوات 6.1.2 – 6.1.3 في كل مره يتم فيها فحص اليرقات.
    2. من 6 – 14 DPF ، أطعم الخل الثعابين إلى اليرقات. فائض طفيف من الطعام جيد ، لان ثعابين الخل سوف تبقي علي قيد الحياة في الطبق. أضافه الخل الثعابين في كل مره يتم فحص الطبق وتنظيفها.
    3. من 11 – 14 DPF ، أضافه 5-10 الطازجة فقست Artemia لكل اليرقات بالاضافه إلى الخل الثعابين. خلال هذا الوقت سوف تتعلم اليرقات للأكل السباحة الحرة Artemia.
    4. في 15 DPF ، نقل اليرقات إلى أكواب البيض (انظر القسم 6.2.5) في خزان مع المياه المتدفقة ، والترشيح ، والتهوية. ولا ينبغي ان يكون هناك أكثر من 25 مضغه لكل كوب. أكواب البيض هي أكواب بلاستيكية مع شبكه المعاوضه في الجزء السفلي. ويمكن أضافه طبق بتري 100 mm اعلي/أسفل إلى الجزء السفلي من كاس البيض للمساعدة في وقف الطعام من السقوط من خلال شبكه. أكواب البيض تسمح للأسماك ان تكون في حجم أكبر من المياه لأسباب نوعيه المياه ، مع الحفاظ علي مجموعات منفصلة. استمري في أضافه كل من ثعابين الخل و 15 − 30 من الفقس الطازج لكل يرقه من الأيام 15 – 18. نظيفه طبق بيتري قطعه يوميا واستخدام ماصه لأزاله الجماهير من Artemiaالقتلى.
    5. من الأيام من 18 إلى 30 ، أطعم فقط الطازجة الفقس Artemia. زيادة كميه التغذية كما ينمو السمك وإذا كان ينظر العض الذيل.
    6. بعد ما يقرب من 30 يوما ، نقل الأسماك إلى 10 لتر (2.5 غالون) الدبابات ، ما يقرب من 25 فردا لكل دبابة. تاكد من وجود الترشيح ، والتهوية ، وأماكن للاختباء. النظر في وسائط الترشيح البيولوجي أسطواني وأنابيب PVC قطرها صغيره.
    7. تغذيه الطازجة فقست Artemia والديدان السوداء من حوالي 30-45 يوما فصاعدا. الحفاظ علي التنظيف القياسي وتغيير المياه للدبابات (اي ، علي الأقل ~ 10 ٪-20 ٪ تغيير المياه لكل 1 أسبوع).
    8. بعد ~ 45 DPF ، تغذيه فقط الديدان السوداء حتى ~ 60 DPF.
    9. بعد ~ 60 DPF ، تحرك الأفواج من حوالي 15 سمكه إلى 40 لتر (10 غالون) الدبابات والبدء في إجراءات تربيه الكبار. أضافه أنابيب PVC والغزل "ممسحة" (كتله من الغزول البني مرتبطة معا حول الفلين) لإخفاء الأماكن (الشكل 3C). يجب ان تقترب الأسماك من حجم التكاثر (من 10 − 12 سم) بعد الإخصاب بعد 3 − 4 أشهر تقريبا.

7. تربيه الكبار

  1. إطعام الأسماك يوميا مع ما يكفي من الديدان السوداء بحيث كميه صغيره من الديدان السوداء موجودة في التغذية القادمة. هذا التغذية الاعلانيه يسمح النمو القصوى.
  2. بضع مرات في الأسبوع ، يمكن ان يكون من المفيد تكمله الدودة السوداء التغذية مع الديدان الدموية.
  3. خزانات نظيفه كل 2-4 أسابيع مع 20 ٪-30 ٪ تغيير المياه. إذا كان الغزل الممسحة يحصل الكامل من بيوفيلم/الطحالب ، فرك نظيفه تحت الماء RO.

النتائج

تم تحديد المواقع المستهدفة sgrna ضمن اكسون 1 من scn4aa في كل من b. gauderio و b. بالضغط الموضعي كما هو موضح في القسم 1. تم إنشاء sgRNAs كما هو موضح في القسم 2. بعد نجاح sgRNA الاختيار والتوليف (الشكل 1) ، تم اختبار الانقسام في المختبر (الشكل 2). وبعد ذلك تم اختيار ال sgR...

Discussion

ان الثراء الظاهري للأسماك الكهربائية الضعيفة ، إلى جانب الانتشار الأخير لموارد الجينوم ، يحفز الحاجة القوية للأدوات الجينية الوظيفية في نموذج السمك الكهربائي الضعيف. هذا النظام جذاب بشكل خاص بسبب التطور المتقارب للعديد من الصفات الظاهرية في السلالات المتوازية من الأسماك ، والتي يتم الا...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

ويعترف المؤلفون بالجهود البطولية التي بذلتها مونيكا لوكاس ، وكاثرين شو ، وريان تايلور ، وجاريد تومسون ، ونيكول روبيهرود ، وهوب هيلي للمساعدة في تربيه الأسماك ، وجمع البيانات ، وتطوير البروتوكولات المبكرة. ونود أيضا ان نشكر المستعرضين الثلاثة علي اقتراحاتهم المقدمة إلى المخطوطة. ونحن نعتقد ان المنتج النهائي لتكون ذات نوعيه أفضل بعد معالجه تعليقاتهم. وقد تم تمويل هذا العمل بدعم من المؤسسة الوطنية للعلوم #1644965 و#1455405 إلى JRG ، ومنحه المدير الخاص لمجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية إلى VLS.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
20 mg/mL RNA grade GlycogenThermo ScientificR0551
50 bp DNA ladderNEBN3236L
Borosilicate glass capillary with filamentSutter InstrumentBF100-58-10(O.D. 1.0 mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)
Cas9 protein with NLS; 1 mg/mLPNA BiologyCP01
Dneasy Blood & Tissue KitQiagen69506
Eppendorf FemptoJet 4i MicroinjectorFisher ScientificE5252000021
Eppendorf Microloader Pipette TipsFisher Scientific10289651
Hamilton syringeFisher Scientific14-824-654referred to as "precision glass syringe" in the protocol
KimwipeFisher Scientific06-666referred to as "delicate task wipe" in the protocol
MEGAscript T7 Transcription KitInvitrogenAM1334
NEBuffer 3NEBB7003Sused for in vitro cleavage assay
OneTaq DNA kitNEBM0480L
OvaprimSyndel USAhttps://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.htmlreferred to as "spawning agent" in the protocol
ParafilmFisher ScientificS37440referred to as "thermoplastic" in the protocol
Pipette pullerWPISU-P97sutter brand
QIAquick PCR Purification KitQiagen28106
Reusable needle- requires customizationFisher Scientific7803-02Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25
T4 DNA polymeraseNEBM0203LUse with the 10x NEB buffer that is included
Teflon coated toolsbonefolder.comT-SPATULA4PIECEreferred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol

References

  1. Gallant, J. R., et al. Genomic basis for the convergent evolution of electric organs. Science. 344 (6191), 1522-1525 (2014).
  2. Zakon, H. H., Lu, Y., Zwickl, D. J., Hillis, D. M. Sodium channel genes and the evolution of diversity in communication signals of electric fishes: convergent molecular evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (10), 3675-3680 (2006).
  3. Arnegard, M. E., Zwickl, D. J., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system--twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22172-22177 (2010).
  4. Lissmann, H. W. Continuous electrical signals from the tail of a fish. Gymnarchus niloticus Cuv. Nature. 167 (4240), 201-202 (1951).
  5. Cuellar, H., Kim, J. A., Unguez, G. A. Evidence of post-transcriptional regulation in the maintenance of a partial muscle phenotype by electrogenic cells of S. macrurus. FASEB Journal. 20 (14), 2540 (2006).
  6. Modrell, M. S., Baker, C. V. Evolution of electrosensory ampullary organs: conservation of Eya4 expression during lateral line development in jawed vertebrates. Evolution & Development. 14 (3), 277-285 (2012).
  7. Hopkins, C. D. Design features for electric communication. Journal of Experimental Biology. 202, 1217-1228 (1999).
  8. Kawasaki, M. Sensory hyperacuity in the jamming avoidance response of weakly electric fish. Current Opinion in Neurobiology. 7 (4), 473-479 (1997).
  9. Bell, C. C., Han, V. Z., Sugawara, Y., Grant, K. Synaptic plasticity in a cerebellum-like structure depends on temporal order. Nature. 387 (6630), 278-281 (1997).
  10. Heiligenberg, W. . Neural Nets in Electric Fish. , (1991).
  11. Ban, Y., Smith, B. E., Markham, M. R. A highly polarized excitable cell separates sodium channels from sodium-activated potassium channels by more than a millimeter. Journal of Neurophysiology. 114 (1), 520-530 (2015).
  12. Markham, M. R., Kaczmarek, L. K., Zakon, H. H. A sodium-activated potassium channel supports high-frequency firing and reduces energetic costs during rapid modulations of action potential amplitude. Journal of Neurophysiology. 109 (7), 1713-1723 (2013).
  13. Gavassa, S., Stoddard, P. K. Food restriction promotes signaling effort in response to social challenge in a short-lived electric fish. Hormones and Behavior. 62 (4), 381-388 (2012).
  14. Sinnett, P. M., Markham, M. R. Food deprivation reduces and leptin increases the amplitude of an active sensory and communication signal in a weakly electric fish. Hormones and Behavior. 71, 31-40 (2015).
  15. Salazar, V. L., Stoddard, P. K. Sex differences in energetic costs explain sexual dimorphism in the circadian rhythm modulation of the electrocommunication signal of the gymnotiform fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Journal of Experimental Biology. 211, 1012-1020 (2008).
  16. Lewis, J. E., Gilmour, K. M., Moorhead, M. J., Perry, S. F., Markham, M. R. Action potential energetics at the organismal level reveal a trade-off in efficiency at high firing rates. Journal of Neuroscience. 34 (1), 197-201 (2014).
  17. Salazar, V. L., Krahe, R., Lewis, J. E. The energetics of electric organ discharge generation in gymnotiform weakly electric fish. Journal of Experimental Biology. 216 (13), 2459-2468 (2013).
  18. Hopkins, C. D., Bass, A. Temporal coding of species recognition signals in an electric fish. Science. 212 (4490), 85-87 (1981).
  19. Arnegard, M. E., Jackson, B. S., Hopkins, C. D. Time-domain signal divergence and discrimination without receptor modification in sympatric morphs of electric fishes. The Journal of Experimental Biology. 209, 2182-2198 (2006).
  20. Sullivan, J. P., Lavoue, S., Arnegard, M. E., Hopkins, C. D. AFLPs resolve phylogeny and reveal mitochondrial introgression within a species flock of African electric fish (Mormyroidea: Teleostei). Evolution. 58 (4), 825-841 (2004).
  21. Crampton, W. G. R. Effects of anoxia on the distribution, respiratory strategies and electric signal diversity of gymnotiform fishes. Journal of Fish Biology. 53, 307-330 (1998).
  22. Pinch, M., Guth, R., Samanta, M. P., Chaidez, A., Unguez, G. A. The myogenic electric organ of Sternopygus macrurus: a non-contractile tissue with a skeletal muscle transcriptome. PeerJ. 4, 1828 (2016).
  23. Lamanna, F., Kirschbaum, F., Waurick, I., Dieterich, C., Tiedemann, R. Cross-tissue and cross-species analysis of gene expression in skeletal muscle and electric organ of African weakly-electric fish (Teleostei; Mormyridae). BMC Genomics. 16, 668 (2015).
  24. Traeger, L. L., et al. Unique patterns of transcript and miRNA expression in the South American strong voltage electric eel (Electrophorus electricus). BMC Genomics. 16, 243 (2015).
  25. Salisbury, J. P., et al. The central nervous system transcriptome of the weakly electric brown ghost knifefish (Apteronotus leptorhynchus): de novo assembly, annotation, and proteomics validation. BMC Genomics. 16, 166 (2015).
  26. Lamanna, F., Kirschbaum, F., Tiedemann, R. De novo assembly and characterization of the skeletal muscle and electric organ transcriptomes of the African weakly electric fish Campylomormyrus compressirostris (Mormyridae, Teleostei). Molecular Ecology Resources. 14 (6), 1222-1230 (2014).
  27. Mate, S. E., Brown, K. J., Hoffman, E. P. Integrated genomics and proteomics of the Torpedo californica electric organ: concordance with the mammalian neuromuscular junction. Skeletal Muscle. 1 (1), 20 (2011).
  28. Swapna, I., et al. Electrostatic Tuning of a Potassium Channel in Electric Fish. bioRxiv. , (2017).
  29. Futuyma, . Evolution. Third Edition. , (2013).
  30. Thompson, A., Vo, D., Comfort, C., Zakon, H. H. Expression Evolution Facilitated the Convergent Neofunctionalization of a Sodium Channel Gene. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 1941-1955 (2014).
  31. Pitchers, W. R., Constantinou, S. J., Losilla, M., Gallant, J. R. Electric fish genomics: Progress, prospects, and new tools for neuroethology. Journal of Physiology Paris. , (2016).
  32. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  33. Jung, C. J., et al. Efficient gene targeting in mouse zygotes mediated by CRISPR/Cas9-protein. Transgenic Research. 26 (2), 263-277 (2017).
  34. Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR Toolbox in Zebrafish for Studying Development and Disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7 (13), (2019).
  35. Zu, Y., et al. Biallelic editing of a lamprey genome using the CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 6, 23496 (2016).
  36. Crispo, M., et al. Efficient Generation of Myostatin Knock-Out Sheep Using CRISPR/Cas9 Technology and Microinjection into Zygotes. PLoS One. 10 (8), 0136690 (2015).
  37. Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and Prospects of CRISPR/Cas Systems in Insects and Other Arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).
  38. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9 (5), 98186 (2014).
  39. Kok, F. O., et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental Cell. 32 (1), 97-108 (2015).
  40. Morcos, P. A., Vincent, A. C., Moulton, J. D. Gene Editing Versus Morphants. Zebrafish. 12 (5), 319 (2015).
  41. Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
  42. Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Developmental Biology. 393 (1), 3-9 (2014).
  43. Singh, P., Schimenti, J. C., Bolcun-Filas, E. A Mouse Geneticist's Practical Guide to CRISPR Applications. Genetics. 199 (1), 1-15 (2015).
  44. Mianné, J., et al. Analyzing the outcome of CRISPR-aided genome editing in embryos: screening, genotyping and quality control. Methods. 121-122, 68-76 (2017).
  45. van der Emde, G., Breed, M. D., Moore, J. . Encyclopedia of Animal Behavior. 1, 16-23 (2010).
  46. Carlson, B. A., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U., Hirsch, M. C. . Encyclopedia of Neuroscience. , 4039-4044 (2009).
  47. Hopkins, C. D. Neruoethology of Electric Communication. Annual Reviews of Neuroscience. 11, 497-535 (1988).
  48. Arnegard, M., Zwickl, D., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system- twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22172-22177 (2010).
  49. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  50. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Resarch. 46, 242-245 (2018).
  51. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  52. Kirschbaum, F. Environmental factors control the periodical reproduction of tropical electric fish. Experientia. 31 (10), 1159-1160 (1975).
  53. Iwama, G. K., McGeer, J. C., Pawluk, M. P. The effects of five fish anaesthetics on acid-base balance, hematocrit, cortisol and adrenaline in rainbow trout. Canadian Journal of Zoology. 67, 2065-2073 (1989).
  54. Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed. , (2000).
  55. Barrangou, R., Doudna, J. A. Applications of CRISPR technologies in research and beyond. Nature Biotechnology. 34 (9), 933-941 (2016).
  56. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
  57. Maruyama, T., et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nature Biotechnology. 33 (5), 538-542 (2015).
  58. Liu, M., et al. Methodologies for Improving HDR Efficiency. Frontiers in Genetics. 9, 691 (2018).
  59. Kirschbaum, F., et al. Intragenus (Campylomormyrus) and intergenus hybrids in mormyrid fish: Physiological and histological investigations of the electric organ ontogeny. Journal of Physiology Paris. 110, 281-301 (2016).
  60. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

152CRISPR 9scn4aamormyrid

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved