불꽃을 침묵 : 약한 전기 물고기에서 CRISPR / Cas9 게놈 편집

요약

여기서, CRISPR/Cas9 게놈 녹아웃 전기 물고기를 생산하고 후방에 프로토콜이 제시된다. 상세히 설명된 것은 체육관 및 모르미리드 모두에 필요한 분자 생물학, 사육 및 축산 요구 사항, 및 Cas9-유도 인델 F₀ 애벌레를 생산하는 주입 기술이다.

초록

전기 수신 및 전기 발생은 척추 동물의 진화 역사에서 변경되었습니다. 일반적인 유전 아키텍처를 공유하는 이 독립적으로 파생된 표현형에는 수렴의 현저한 정도가 있습니다. 이것은 아마도 가장 좋은 체육관과 mormyrids의 수많은 수렴 기능에 의해 예시, 생산 하 고 약한 전기 물고기 라고 하는 두 종 풍부한 teleost clades. 약한 전기 물고기가 주변 을 감지하고 의사 소통하기 위해 전기를 사용하는 발견 이후 50 년 동안, 과학자의 성장 커뮤니티는 개발, 시스템 및 회로 신경 과학의 진화에 엄청난 통찰력을 얻고있다, 세포 생리학, 생태학, 진화 생물학 및 행동. 최근에는 전기 어류에 대한 게놈 자원이 확산되고 있습니다. 이 자원의 사용은 이미 이 종에 있는 유전자형과 표현형 사이 연결에 관하여 중요한 통찰력을 촉진했습니다. 유전체학 데이터를 약한 전기 어류의 자형적 데이터와 통합하는 데 큰 장애물은 기능성 유전체학 도구가 부족하다는 것입니다. 우리는 약한 전기 물고기에 있는 내인성 DNA 복구 기계장치를 이용하는 CRISPR/Cas9 돌연변이 발생을 능력을 발휘하기 위한 가득 차있는 프로토콜을 여기에서 보고합니다. 우리는 이 프로토콜이 CRISPR/Cas9를 사용하여 인델과 포인트 돌연변이를 표적으로 하여 모미리드 종 브리아노미러스 brachyistius와 체육관 브라키하이포무스 고데리오 모두에서 동등하게 효과적이라는 것을 입증합니다. 나트륨 채널 유전자 scn4aa. 이 프로토콜을 사용하여, 두 종으로부터의 배아를 수득하고 유전자형화하여 나트륨 채널 scn4aa의 제1 엑소에서 예측된 돌연변이가 존재했다는 것을 확인하였다. 녹아웃 성공 표현형은 주입되지 않은 크기 일치 대조군과 비교할 때 감소된 전기 기관 방전 진폭을 보여주는 기록으로 확인되었다.

서문

전기 수신 및 전기 발생은 척추 동물의 진화 역사에서 변경되었습니다. 텔레오스트 물고기, 골테오그로시포메 및 실리리폼의 두 계보, 병렬로 진화된 전기 수신, 텔레오스트의 다섯 계보(체육관, 모르미리드, 그리고 제네라 아스트로스코푸스, 말라프테루스, 시노돈티스) 병렬로 진화 전기 발생. 이러한 독립적으로 파생된 표현형에는 공통의 유전 아키텍처^1,2,3을공유하는 수렴정도가 눈에 띄는 정도이다.

이것은 아마도 가장 좋은 체육관과 mormyrids의 수많은 수렴 기능에 의해 예시, 생산 하 고 약한 전기 물고기 라고 하는 두 종 풍부한 teleost clades, 약한 전기 물고기 라고. 약한 전기 물고기가 주변을 감지하고^의사소통하기 위해 전기를 사용하는 발견 이후 50 년 동안, 과학자의 성장 커뮤니티는 개발^1,5의 진화에 엄청난 통찰력을 얻고있다 ^,6, 시스템 및 회로 신경 과학^7,8,9,10,세포 생리학^11,12,생태 및 에너지^{13 ,14,15,16,17}, 동작^18,19, 및 매크로 진화^3,20,21 .

최근에는 전기어류^{1,22,23,24,25,26, 27,28}. 이러한 자원의 사용은 이미 이 종^{1, 2,3,28,}29에서 유전자형과 표현형 사이의 연결에 관한 중요한 통찰력을 생성했습니다. ^,30. 유전체학 데이터를 약한 전기 어류의 자형적 데이터와 통합하는 데 큰 장애물은 기능성 유전체학^{도구(31)의}현재 부족이다.

이러한 도구 중 하나는 Cas9 엔도너첼리스(CRISPR/Cas9, CRISPR) 기법과 결합된 최근 개발된 클러스터된 정규 간격 짧은 Palindromic 반복입니다. CRISPR/Cas9는 모델^32,33,34 및 비모델 유기체^35,36,37 모두에서 광범위하게 사용되었던 게놈 편집 도구입니다. CRISPR/Cas9 기술은 비복제 방법^38을사용하여 저렴한 비용으로 기본 분자 생물학이 가능한 실험실에서 짧은 가이드 RNA(sgRNAs)라고 불리는 유전자 특이적 프로브를 쉽게 생성할 수 있는 지점으로 발전했습니다. CRISPR은 모폴리노스^39,40,전사 활성제 와 같은 이펙터 뉴클레아제(TALENs) 및 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)와 같은 다른 녹아웃/녹다운 전략에 비해 비용이 많이 들고 모든 표적 유전자를 생성하는 데 시간이 많이 걸립니다.

CRISPR/Cas9 시스템은 sgRNA 서열에 의해 지시된 게놈의 특정 영역을 표적으로 하고, 이중 가닥 중단을 일으키는 원인이 되어 유전자 녹아웃을 생성하기 위하여 기능합니다. 이중 가닥 휴식은 세포에 의해 검출되고 비상동종 종단 접합(NHEJ) 경로를 우선적으로 사용하여 내인성 DNA 복구 메커니즘을 유발합니다. 이 통로는 높게 오류가 발생하기 쉽습니다: 복구 프로세스 도중, DNA 분자는 수시로 이중 좌초 된 중단 사이트에 삽입 또는 삭제 (indels)를 통합할 것입니다. 이러한 인델은 (1) 개방 판독 프레임의 이동, (2) 조기 정지 코돈의 삽입, 또는 (3) 유전자 생성물의 중요한 1차 구조의 이동으로 인해 기능의 손실을 초래할 수 있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 약한 전기 물고기 종에 있는 NHEJ를 사용하여 표적 유전자에 있는 표적 점 돌연변이를 표적으로 하기 위하여 CRISPR/Cas9 편집을 이용합니다. 다른 기술보다 간단하고 효율적이지만, 돌연변이 발생의이 방법은 유전 모자이크^{41,42,43에 기인하는 F 0에서 현상형 경건의 범위를 초래할 것으로 예상된다 ,44}.

유기체의 선택
약한 전기 물고기의 비교 유전체학에 대한 미래 연구를 촉진하기 위해 프로토콜 개발을위한 체육관 및 mormyrids 모두에 대한 대표적인 종을 선택해야합니다. 우루과이 몬테비데오에서 열린 2016 년 전기 물고기 회의에서 논의 한 후, 이미 실험실에서 사육 될 수있는 종을 활용하고 유전체 자원을 사용할 수있는 종을 활용하기 위한 지역 사회의 합의가 있었습니다. 체육관 브라키하이포무스 가우디오와 모르미리드 브리노미러스 브라키시스티우스는 이러한 기준에 맞는 종으로 선정되었다. 두 종 모두에서 번식 조건을 유도하고 유지하는 자연 신호는 포로로 모방하기 쉽습니다. B. gauderio,남미에서 체육관 종, 낮은 축산 요구 사항의 장점을 가지고 : 물고기는 상대적으로 작은 (4 L) 탱크에서 상대적으로 높은 밀도로 유지 될 수있다. B. gauderio는 또한 포로 조건하에서 빠른 세대 회전율을 가지고있습니다. 실험실 조건에서, B. gauderio 약에 계란에서 성인으로 개발할 수 있습니다 4 개월.

B. brachyistius, 서중앙 아프리카에서 모미리드 물고기의 종, 포로에서 쉽게 품종. B. brachyistius는 수족관 무역을 통해 쉽게 사용할 수 있으며, 많은 연구에서 널리 사용되어 왔으며, 현재 는 다수의 유전체 자원을 사용할 수 있습니다. 그들의 수명 주기는 실험실 조건에 따라 1-3 년 동안 지속됩니다. 축산 요구 사항은 이 종에 대해 다소 더 집중적이며, 사육 중 침략으로 인해 적당한 크기의 탱크 (50−100 L)가 필요합니다.

전기 물고기의 그밖 종을 공부하는 실험실은 종을 사육할 수 있는 한 이 프로토콜을 쉽게 적응할 수 있어야 하고, 단세포 배아는 성인으로 집합되고 양육될 수 있습니다. 주택, 애벌레 축산, 체외 수정 (IVF) 비율은 가능성이 다른 종으로 변경됩니다; 그러나,이 프로토콜은 다른 약한 전기 물고기의 번식 시도를위한 출발점으로 사용할 수 있습니다.

개념 증명을 위한 이상적인 유전자 표적: scn4aa
약한 전기 mormyrid 및 체육관 물고기는 전기 기관이라고 하는 특수 기관을 방전해서 전기장 (전기 발생)을 생성합니다. 전기 기관 방전 (EODs)는 전기 세포라는 전기 기관 세포에서 활동 전위가 동시에 생성되어 발생합니다. EOD는 물고기의 주변의 고해상도 전기 이미지를 만들기 위해 피부에 전기 수용체의 배열에 의해^{검출된다 45.} 약한 전기 물고기는 또한 그들의 conspecifics의 EOD 파형의 기능을 감지 할 수 있습니다¹⁸ 뿐만 아니라 그들의 방전 속도^46,EOD는 새소리 또는 개구리와 유사한 소셜 통신 신호로 추가로 작동 할 수 있도록 발성⁴⁷.

모르마이리드와 체육관의 전위 전위 생성의 주요 구성 요소는 전압 게이트 나트륨 채널 NaV1.4^2입니다. 비전기 텔레오스스트는 전압 게이트 나트륨 채널 NaV1.4^30에대한 코딩, 두 개의 paralogous 유전자 사본을 표현, scn4aa 및 scn4ab. 체육관에서 약하게 전기 물고기 혈통 모두에서, scn4aa는 급속하게 진화하고 그것의 운동 특성에 영향을 미치는 수많은 아미노산 치환을 겪었다^48. 가장 중요한 것은, scn4aa는 전기 기관^2,3에두 계보에서 구획화되고있다. 전기 기관에 scn4aa의 상대적으로 제한 된 발현, 뿐만 아니라 EODs의 생성에 그것의 중요 한 역할, 그것은 CRISPR/Cas9 녹아웃 실험에 대 한 이상적인 대상, 그것은 최소한의 해로운 pleiotropic 효과. 약한 전기 물고기는 그들의 애벌레 전기 기관을 배출 하기 시작 하기 때문에 6-8 일 후 수정 (DPF), scn4aaa의 타겟팅은 이상적으로 배아 미세 주입 다음 빠른 자형질에 적합.

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프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 미시간 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. sgRNA 표적 선택

참고: 1.1단계에서 sgRNAs의 수동 설계를 위한 프로토콜이 제공됩니다. 이것은 scn4aa 표적 선택에 이용되었다. EFISHGENOMICS 웹 포털을 사용하여 이러한 프로세스(단계 1.2)를 용이하게 하기 위해 추가 프로토콜이 제공된다. 사용자 지정 대상에 대한 sgRNAs 를 설계하는 데 성공하기 위해 여러 개의 자동화된 '검사'를 특징으로 하는 프로토콜 1.2를 선택하는 것이 좋습니다.

1. 설계 sgRNA 대상.
   1. sgRNA 가이드 올리고스를 생성하기 위해, 그것은 exon 1, 또는 다른 5'엑소온을 대상으로하는 것이 가장 좋습니다. 5' UTR을 대상으로 지정할 수 있습니다. 그러나 5' 코딩 시퀀스를 대상으로 하는 것이 가장 좋습니다. 게놈 정보를 활용하는 것이 바람직하지만, 전사체 데이터를 사용하여 성공적인 sgRNAs를 개발할 수 있다. 인트론/엑손 경계(게놈 데이터) 또는 엑손/엑손 경계의 주석이 바람직합니다.
   2. 1.1로부터의 후보 게놈 서열은 패턴 5'-N(18)-NGG-3'과 일치하는 가양성 표적 서열에 대해 검색된다. 데스크톱 시퀀스 분석 소프트웨어, 사용자 지정 스크립트 또는 시퀀스의 수동 검사를 통해 자동으로 수행할 수 있습니다.
   3. 시퀀스는 온-타겟 활성에 대한 Doench et al.^49의 방법을 사용하여 우선 순위를 지정할 수 있다. 추가적으로, 표적 서열은 오프 타겟 결합을 위한 게놈/전사학 데이터베이스에 대하여 BLAST 검색에 의해 평가될 수 있다.
   4. 대상 시퀀스의 측면에 표준 PCR 프라이머를 생성할 수 있는지 확인합니다. 프라이머는 절단 부위의 양쪽으로부터 적어도 20 bp이어야 한다(NGG 서열의 3개의 염기 상류). 이상적으로, PCR 제품은 150-200 염기 쌍 (bp)이어야 한다.
   5. T7 프로모터(N_18의5') 및 상수 올리고머(1.1.6)에 어닐링을 위한 보완 영역(N_18의3')을 포함하는 아래 템플릿을 사용하여 위의 기준을 충족하는 디자인 올리고머(5'-TAATACTCACTATAGG-N_18)를 -GTTTTAGAGCTAGAAAAAAG-3'
      참고: N18 서열은 NGG 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 포함하지 않는다. 올리고머에 이것을 포함하지 마십시오.
   6. 모든 sgRNAs, sgRNA 표적을 위한 올리고머(단계 1.1.5), PCR 프라이머(단계 1.1.4)를 올리고뉴클레오티드 생산 서비스에서 표준 탈염 올리고머로서 합성하는데 사용될 상수 올리고머(표1)를주문한다. 올리고머 및 PCR 프라이머는 표준 탈염 올리고머로 주문될 수 있으며 추가 정제가 필요하지 않습니다.
2. sgRNA 표적의 자동 설계를 수행합니다.
   1. 게놈 데이터를 사용하여 표적 유전자를 선택합니다. 엑시온/인트론 경계가 알려진 경우 전사체 데이터를 대신 사용할 수 있습니다. 대상은 EFISHGENOMICS 포털(http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu)을 사용하여 식별할 수 있습니다. 이상적인 대상은 엑슨 1 내에 있을 것입니다. 그러나, 다른 5' 엑온과 5' UTR을 고려할 수 있습니다.
   2. 대상 시퀀스가 식별되면 자유롭게 사용할 수 있는 EFISHGENOMICS CRISPR 웹 도구(http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu/crispr_tool/)를 로드합니다. 이 웹 도구는 대상 생성^50,51에대한 CRISPOR 알고리즘의 사용자 정의 버전을 사용합니다.
   3. 1단계상자에 시퀀스의 이름을 입력하고 대상 시퀀스를 적절한 상자에 입력합니다.
3. 서열에서 파생되는 적절한 게놈을 선택합니다. 현재, 게놈 데이터는 B. brachyistius 및 B. gauderio에사용할 수 있습니다. 게놈 서열은 이 도구의 사용에 필요하지 않지만 잠재적인 원치 않는 오프 타겟 효과를 평가하는 데 유용합니다.
4. 적절한 PAM을 선택합니다. 20 bp-NGG PAM을 권장합니다.
5. 보고서는 제안된 가이드 서열과 함께 게놈 내의 표적 서열의 위치와 함께 생성될 것이다. 예측된 오프 타겟 효과, 높은 특이도 점수 및 높은 효율 점수를 가진 세 개의 대상을 선택합니다. 가장 높은 점수 가이드 시퀀스는 왼쪽에 녹색으로 강조 표시됩니다. 가능하면 노란색과 빨간색으로 강조 표시된 가이드 시퀀스를 피해야 합니다.
6. 선택한 대상 시퀀스를 클릭하면 포괄적인 CRISPOR 보고서가 생성됩니다. 이들 보고서에서 주요 정보는 "겹치는 올리고뉴클레오티드로부터의 시험관내 발현 T7"에 대한 것이다. 이 보고서에서, 다음 정보를 추출: 권장 된 sgRNA 올리고, 대상 사이트에 대 한 PCR 프라이머, 그리고 모든 sgRNAs를 합성 하는 데 사용 됩니다 일정 한 올리고머.
7. 올리고뉴클레오티드 생산 서비스에서 선택된 올리고머(1.6단계)를 주문한다. 올리고머 및 PCR 프라이머는 표준 탈염 올리고머로 주문될 수 있으며 추가 정제가 필요하지 않습니다.

2. sgRNA 생성

1. PCR 튜브에 있는 Anneal 올리고머: 1 μL 의 1 μL의 1 μL100 μM 상수 올리고머, 100 μM sgRNA 특정 올리고머의 1 μL, 및 8 μL의 뉴클레아제 자유로운_H2O를 추가하십시오
2. 다음 프로그램과 함께 열 사이클러에서 어닐 올리고머 : 5 분 동안 95 °C에서 열, -2 °C에서 85 °C로 냉각, 0.1 °C / s에서 25 °C로 냉각, 4 °C에서 유지.
3. sgRNA 템플릿을 생성하려면, 2.5 μL의 dNTP 혼합물(10 mM), 10x 완충제의 2 μL, T4 DNA 폴리머라제의 0.5 μL, 그리고 5 μL의 뉴클레아제 프리_H2O를 단계 2.2에서 어닐링된 올리고머에 추가한다. 12 °C에서 20 분 동안 배양하십시오.
4. 제조업체의 지침에 따라 PCR 정리 열을 사용하여 템플릿을 정화합니다.
5. 20-30 μL. 분광광도계를 사용하여 농도와 순도를 추정합니다. 템플릿은 100-200 ng/μL 및 1.8-1.9 A_{260/280이어야}합니다.
6. 아가로즈 젤을 통해 1-5 μL을 실행하여 확인하십시오. 지배적 인 밴드는 120 bp이어야합니다. 대표적인 결과는 그림 1A를 참조하십시오.
7. 겔 검증 된 sgRNA 템플릿을 -20 °C (장기) 또는 4 °C (단기, 1-4 주)에 저장하십시오.
8. DNTP 믹스의 실온 8 μL (dA, dT, dG, dC의 동등한 볼륨), 2 μL의 10x 버퍼 (실온), T7 RNA 폴리머라제의 2 μL, 100-200 ng의 sgRNA 템플릿에서 1.5 mL 마이크로 원심 분리지 튜브에 추가하여 T7 RNA 전사 키트를 사용하여 sgRNA를 전사 , 뉴클레아제 프리_H2O 를 20 μL 총 부피. 하단에 수집 스핀. 37 °C에서 2-4 시간 동안 배양하십시오.
9. DNase 1 μL을 넣고 37°C에서 15분 더 배양합니다.
   1. sgRNA를 전사하기 위해 글리코겐 1 μL, 무핵 물질 없는 H_{2 O}30 μL, 5 M 암모늄 아세테이트의 30 μL 및 100% EtOH의 180 μL을 추가하여 sgRNA를 정리한다. 잘 섞어서 -80°C(냉동 될 때까지)에서 또는 -20 °C에서 하룻밤 동안 적어도 20 분 동안 배양하십시오. 4 °C에서 최대 속도로 15 분 동안 원심 분리기.
10. 펠릿을 방해하지 않고 상류를 제거하고 폐기하고 -20°C에서 냉각된 RNase-free 70% EtOH 1 mL로 세척합니다. 4°C에서 최대 속도로 5분 더 회전합니다.
11. 펠릿을 방해하지 않고 상류를 제거하고 폐기하고 펠릿을 5 분 동안 공기 건조시하십시오.
12. 30 μL의 뉴클레아제 프리_H2O로 재중단하고 UV 분광법(최소 수율 200 ng/μL)을 사용하여 순도와 수율을 결정합니다.
13. RNase 가없는 젤에 sgRNA의 존재를 확인하십시오. sgRNA는 이차 구조에 기인하는 2개의 대역으로 50 및 150 bp 사이에서 나타난다(도 1B).
14. 3 μL로 알리쿼트하고 -80°C에서 보관하십시오.

3. 체외에서 절단 효율 검증

1. 상업적 DNA 추출 키트를 사용하여 표적 종으로부터 게놈 DNA를 추출한다. 조직이 재생되기 때문에 복부 지느러미 클리핑은 물고기를 희생하지 않고도 사용할 수 있습니다.
2. 표준 PCR을 사용하여 단계 1.6 및 1.7에 기재된 바와 같이 설계된 프라이머를 사용하여 표적 DNA 영역을 증폭시다. 젤 전기 동으로 제품을 확인합니다. 적절한 영역이 증폭되고 있는지 확인하기 위해 조각을 시퀀싱하는 것이 제안되지만 필요하지는 않습니다. scn4aa 템플릿에 대한 대표적인 결과는 그림 2에나와 있습니다.
3. 확립된 실험실 또는 회사 프로토콜로 PCR 조각을 정리합니다.
4. 증폭된 DNA를 -20°C에 저장한다. 동결 해동 주기를 줄이기 위해 aliquots로 분리하는 것이 좋습니다.
5. 각 구성 요소의 필요한 양과 볼륨을 결정합니다. 사용 가능한 경우 음성 대조군(sgRNA 또는 Cas9 제외)과 양성 대조군(표적 PCR 증폭 DNA를 절단하는 이전에 테스트된 sgRNA)과 sgRNA의 농도 계열을 실행하는 것을 고려한다.
6. sgRNA 및 Cas9 단백질을 실온에서 PCR 튜브로 지정된 순서로 아래의 반응 혼합물을 설정하고, 최상의 결과를 위해 sgRNA 및 Cas9 단백질을 추가합니다: 표적 DNA PCR 제품의 50-100 ng, 1 μL의 1 μL 의 1 0x 완충액 3, 10x BSA의 1 μL (0.1 g/mL) , 50-200 cas9 단백질의 ng (1 mg /mL, 150 ng 제안), 그리고 30-200 ng sgRNA (100 ng 제안).
   1. 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음 65°C에서 10분 동안 Cas9 단백질을 비활성화합니다.
   2. 양성 및 음성 대조군과 함께 전체 샘플을 2%-3% 아가로즈 젤(30-200 bp 사이의 예상 밴드 크기)에서 실행합니다. 성공적인 분열은 PCR 제품의 일부를 표시 할 수 있지만, 또한 두 개의 작은 밴드를해야합니다. 대표적인 결과는 그림 2에나와 있습니다.

4. 배아 얻기

참고: 약한 전기 물고기의 배아를 얻는 것은 어려울 수 있습니다. 수질, 어류 관리를 위한 적절한 시간, 정기적인 수유를 주의 깊게 모니터링하는 것이 성공적인 사육 프로그램의 핵심입니다. 물고기는 먼저 프로토콜 단계 4.1에 설명 된 대로 재생^(52)에 대 한 몇 주 동안 컨디셔닝 되어야 합니다. 이에 따라, 자연산란 행동(4.3)에 사용하기 위한 천연 gametogenesis(4.2)를 증강시키는 프로토콜이 제시되며, 정밀하게 시기 적절한 배아(4.4)를 얻기 위한 시험관내 기술이 최근에 개발되었다. 프로토콜 4.3은 B. brachyistius 및 B. gauderio에동등하게 효과적이며, 프로토콜 4.4는 B. gauderio에서우수합니다.

1. 컨디셔닝
   1. B. brachyistius 를 커플/소그룹(100-150L 탱크) 또는 매우 큰 탱크(수컷 2마리, 암컷 5-6마리)에 보관하십시오. 대피소로 사용할 물고기 당 적어도 1-2 PVC 튜브가 있어야합니다(그림 3A,B).
   2. B. gauderio는 훨씬 더 높은 밀도로 사육 될 수있다. 100 L 탱크 (2 남성 과 6 암컷)에 8 명까지 유지합니다. 대피소로 사용할 물고기 당 적어도 1 PVC 튜브가 있어야합니다. 얽힌 원사를 추가하면 농축과 은신처가 증가합니다. 성인이 튜브에 자연적으로 스폰 할 수 있도록 탱크의 상단에 드릴 1cm 직경 구멍 50mL 원심 분리기 튜브를 추가합니다(그림 3C).
   3. 번식기에는 냉동 된 피벌레로 보충 된 신선한 검은 벌레를 매일 먹입니다. 원하는 경우 비타민과 보충제로 음식을 풍부하게 할 수 있습니다.
   4. 일반적으로 상대적으로 높은 전도도 (300-600 μS), pH 균형 용액에서 물고기를 집. 번식기 동안, 고나드 의 회수및 산란을 유도하기 위해 1-3 주 동안 적어도 절반으로 전도도를 점차적으로 낮춥시다. 전도도가 낮을 때 pH에 주의를 기울이면서 역삼투(RO) 물을 매일 첨가하여 전도도를 낮춥니다(pH & lt;6).
   5. 사육 조건은 시간이 지남에 따라 계란 생산이 가늘어져 약 3-5 개월 동안 유지 될 수 있습니다. 이 시간 후, 천천히 높은 전도도에 물고기를 반환 1-3 주. 다시 번식 조건에 노출되기 전에 또 다른 3 개월 높은 전도도에 유지.
2. 스폰 에이전트 (SGnRHa + 돔페리돈) 주사를 사용하십시오.
   1. 그라비드가 나타나는 번식 조건에서 암컷 물고기를 식별합니다(그림4). B. gauderio에서 여성은 부어 생식조를 단지 통풍구에 꼬리를 해야합니다. B. brachyistius 여성은 부어 배를 가지고 깊은 몸을 나타납니다(그림 4A). 남성은 일반적으로 정자를 생산하는 문제가 없습니다. 그러나, 더 큰 남성은 집합된 더 큰 정액 양 때문에 선호됩니다.
      참고: 산란제는 게임테의 성숙을 용이하게 하고 산란을 좌표하는 상용 호르몬 혼합물이다. 물고기는 과거에 산란 에이전트와 함께 주입 된 경우, 허용 >4 휴식의 주 및 주사 사이 충분 한 먹이. 우리는 적어도 주입 하는 것이 좋습니다 2 남성과 4-5 계란과 정자의 많음의 몇 클러치를 보장 하기 위해 여성.
   2. MS-222 (0.4 g /3 L)에서 물고기를 몇 분 동안 마취, 물고기가 자세를 유지할 수 없을 때까지, 움직이지 않지만, 방반 운동이 계속 (단계^{II 53).}
   3. 산란제 양(0.5 μL/g) + 0.5 μL을 계산하기 위해 물고기(g)의 무게를 측정합니다. 추가 0.5 μL은 파이펫팅 오류를 차지합니다.
   4. 스폰 에이전트를 PCR 튜브에 버퍼(1x PBS 또는 DPBS)의 4배 부피에 추가하고 잘 섞습니다. 해결책은 흐린 될 것입니다. 산란제를 열가소성 수지에 분배한 다음 파이펫을 사용하여 계산된 용량을 측정하는 데 도움이 됩니다. 산란제는 점성이 있으므로 전체 용량을 분배하고 파이펫팅에 주의하십시오.
   5. 열가소성 플라스틱에 사출 용액을 파이펫과 기포를 피하고 정밀 유리 주사기에 그립니다. 우리는 28G, 19-25mm 길이, 경마 바늘을 권장합니다.
   6. 용액을 등지 트렁크 근육에 매끄러운 속도로 주입하십시오. 바늘을 2-4 s에 대 한 앉아 하자 다음 제거. 즉시 복구를 위해 신선한 시스템 물에 물고기를 넣습니다.
   7. 약 24 시간 후에 배아 수집을 준비하십시오 (4.3 또는 4.4 참조). 단세포 미세 주입에 필요한 것을 포함하여 필요한 모든 물질을 수집합니다(섹션 5 참조).
3. 자연 산란을 통해 배아를 얻습니다.
   1. 집 산란제 주입 성인 (4.2) 큰 450 L 탱크. 가장 효과적인 섹스 비율은 일반적으로 1-2 남성과 3-4 PVC 튜브로 만든 적절 한 은신처와 여성, 그리고 계란 소비를 방지 하기 위해 탱크 바닥에 어두운 대리석 기판. 대리석은 일반적으로 B. gauderio보다 b. brachyistius에 대 한 더 중요 한, 틈새또는 50 mL 원심 분리 튜브에 그들의 끈적 끈적한 계란을 입금 하는 것을 선호 하는 위에서 설명한 대로.
   2. 야간 산란을 정규 실험실 근무 시간에 맞게 역광 주기에 물고기를 놓습니다. 상용 소비자 등급 보안 시스템을 사용하여 적외선 조명을 사용하여 물고기를 모니터링하여 원격으로 연결된 PC의 방해를 최소화합니다(그림3).
   3. 물고기는 산란제 주입을 포스트 약 24 시간 어두운 포토 기간 동안 자발적으로 산란합니다.
   4. 스폰이 시작되면 산란 동작이 발생하는 동안 매시간 계란을 수집합니다. B. brachyistius에서는, 갓 산란된 계란에 손상을 최소화하기 위해 미세한 면 망 그물 위에 작은 직경의 사이펀을 사용하여 계란을 수집합니다. 50 mL 원심 분리튜브 또는 탱크 기판에서 B. gauderio 계란을 수집합니다. 저강도 적색광이 있는 헤드 램프를 사용하여 물고기를 산란하는 데 방해가 되지 않도록 효율적으로 작업할 수 있습니다. 첫 번째 분열은 약 1 시간 후 수정 (HPF)이 발생함에 따라, 계란의 많은 부분이 단세포 미세 주사에 적합할 것입니다.
   5. 즉시 미세 주입으로 진행하십시오 (섹션 5 참조).
4. B. gauderio의체외 수정을 위해 남성을 짜내 .
   1. 제브라피쉬 북^54에기재된 바와 같이 정자 익스텐더 용액(SES)을 준비한다: 10 mM HEPES, 80 mM KCl, 45 mM NaCl, 45 mM 나트륨 아세테이트, 0.4 mM CaCl_2,및 0.2 mM MgCl_2.
      1. ddH₂O를 사용하여 볼륨을 가져오고 1 M NaOH로 pH를 7.7로 조정합니다.
      2. 냉장고에 보관하십시오.
      3. 사용하기 전에 0.22 μm 필터를 통해 필터링하십시오.
   2. MS-222 (0.4 g /3 L)에서 물고기를 몇 분 동안 마취, 물고기가 자세를 유지할 수 없을 때까지, 움직이지 않지만, 방반 운동이 계속 (단계^{II 53).} SES 의 500 μL aliquots를 얼음에 넣습니다.
   3. 건조 한 손과 물고기 철저 하 게, 특히 머리와 통풍 구 주위. MS-222에 담근 젖은 종이 타월로 덮인 폴리스티렌 폼/스폰지 홀더에 복부 쪽을 왼쪽(오른손잡이 개인의 경우)으로 놓습니다. 머리는 가능한 한 테이블과 평행해야 합니다.
      참고: 단계 4.4.4-4.4.6 가능한 한 빨리 수행해야하며, 물고기는 30-60 s의 물에서만해야합니다.
   4. 통풍구를 향해 생식기 위에 가볍게 압박하여 로스트랄 방향으로 압력을 가합니다. 물고기는 폐기물을 추방 할 수 있습니다. 폐기물이 배출되는 경우 섬세한 작업 으로 통풍구를 청소하십시오. 정자로 폐기물을 수집하지 마십시오. 남성의 크기에 따라 10-60 μL이 일반적입니다.
   5. 팁이있는 마이크로 파이프를 사용하여 50 μL 단위로 남성에게서 압착되는 정자를 조심스럽게 수집하십시오. 얼음에 SES의 500 μL aliquots에 직접 정자를 놓습니다. 다른 압박 하는 동안 정자를 수집에 다른 연구원 지원 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 정자는 가능한 한 빨리 사용되어야하지만, 적어도 1 시간 동안 실행 가능한 남아있다.
   6. 수집 직후, 회복을 위해 물고기를 담수에 넣으시고 회복하십시오. 물고기는 30-60 s에 대 한 물 에서 만 해야 합니다.
5. B. gauderio의체외 수정을 위해 여성을 짜내 .
   1. MS-222 (0.4 g /3 L)에서 물고기를 몇 분 동안 마취, 물고기가 자세를 유지할 수 없을 때까지, 움직이지 않지만, 방반 운동이 계속 (단계^{II 53).} 워크스테이션에 폴리테트라플루오로에테네 시트를 놓습니다.
      참고: 섹션 4.5.1-4.5.5 가능한 한 빨리 수행해야하며 물고기는 30-60 s의 물에서만 해야합니다.
   2. 마른 손, 도구, 폴리 테트라 플루오로에테네 시트, 그리고 철저하게 물고기, 특히 머리와 통풍구 주위에. (오른손잡이 개인의 경우) 앞쪽을 향한 머리를 옆으로 놓습니다.
   3. 통풍구를 향해 생식기 위에 가볍게 압박하여 로스트랄 방향으로 압력을 가합니다. 물고기는 폐기물을 추방 할 수 있습니다. 폐기물이 배출되는 경우 섬세한 작업 으로 통풍구를 청소하십시오. 물고기의 크기에 따라 20~150개의 알이 일반적입니다. 폴리테트라플루오로에테엔 코팅 주걱/도구를 사용하여 클로아카에서 압착되는 계란을 조심스럽게 수집합니다. 계란을 작은 페트리 접시에 빠르게 옮기고 뚜껑을 덮습니다. 이 과정에서 계란이 건조한 상태로 유지되도록 하십시오. 또는 압착 후, 계란 덩어리를 작은 페트리 접시의 베이스 또는 암컷에서 추방되는 폴리테트라플루오로에테네 시트에 만지다.
   4. 수집 직후, 회복을 위해 물고기를 깨끗한 시스템 물에 넣으하십시오.
6. B. gauderio의체외 수정을 위한 계란 수정을 수행합니다.
   1. SES에 잘 혼합 된 정자의 100 μL을 추가하십시오 (단계 4.4 참조) 계란 덩어리 위에 직접.
   2. 시스템 물 1mL(0.22 μm 필터를 통해 여과)를 추가하고 30-60s에 잘 섞습니다.
   3. 1-2 mL 시스템 물을 추가하고 (페트리 접시에 약간의 공간을 남겨) 인큐베이터에 놓습니다. 페트리 접시에 IVF의 시간을 기록하고 29°C 인큐베이터로 이동한다. 50분 타이머를 설정하여 개발 진행 상황을 확인합니다(예를 들어, 동물 극에서 단일 세포의 형성, 도 6참조). 이 시간 동안 미세 주입을위한 재료를 준비하십시오.

5. 단세포 미세 주입

1. 산란제 주사(단계 4.2) 또는 천연 산란(단계 4.3)에 앞서 미세 주사 바늘을 당긴다. 필라멘트 (O.D. 1.0 mm, I.58 mm, 10cm 길이)와 바늘 풀러와 함께 보로 실리 케이트 유리 모세관을 사용하여 미세 주입 바늘을 당깁니다. 준비 2-4 계획된 치료 주입 당 바늘.
   참고: 필라멘트가 팁쪽으로 용액을 심지하고 기포를 제거하기 때문에 필라멘트가있는 백로딩 바늘이 바람직합니다. 그러나 필라멘트가없는 바늘을 사용할 수 있으며 프론트 로딩은 결과에 영향을 미치지 않아야합니다. 바늘은 길지만 튼튼한 테이퍼가 있어야합니다. 열 = 500 : 시작 점으로 다음 사양과 바늘 당기기 프로그램을 사용; 끌어오기 = 70; 속도 = 70; 및 시간 = 100. 대표적인 바늘 형태는 도 5A에도시되어 있다.
2. 주입 용액을 준비하고 바늘을 준비하십시오.
   1. pcR 튜브에 0.9 μL의 sgRNA 및 0.9 μL의 Cas9 효소 (1 mg/mL)를 0.2 μL의 10% 또는 100% 페놀 적색(각각 1% 및 10% 최종 페놀 적색 농도)에 추가합니다. 잘 섞어서 sgRNA와 Cas9가 복잡해지도록 얼음 에 2-5 분 간 두십시오. 주사 용액에서 sgRNA, Cas9 및 페놀 레드의 최종 농도를 계산합니다.
      참고: 위의 레시피를 사용하여 바늘 막힘 또는 절단 효율에 문제가있는 경우, Cas9를 안정화하고 바늘 막힘을 방지하기 위해 1 x 최종 농도 염 / 버퍼 믹스를 사용하는 것이 유용 할 수 있습니다.
   2. 마이크로 로더 파이펫 팁을 사용하여 2 μL의 용액을 미세 주입 바늘에 역하시면 됩니다. 액체를 가능한 한 팁에 가깝게 배출하십시오.
   3. 마이크로 조작기로 바늘을로드하고 압력 설정을 설정 (775p_i, 0.1−0.2 s, 및 8-12p_c로시작합니다).
   4. 스코프 아래에서 미세 한 쌍의 집게를 사용하여 바늘 끝을 경정맥 각도로 부수게합니다. 바늘의 테이퍼가 강성을 갖기 시작하는 쪽으로 휴식하십시오. 팁에 더 가깝게 부수고 사출 용액의 크기를 테스트한 다음 필요한 경우 더 이상 파손하는 것이 가장 좋습니다. 바늘의 보어는 단단한 테이퍼를 유지하면서 가능한 한 작게 유지되어야합니다(그림 5A).
   5. 미네랄 오일과 마이크로미터를 사용하여 사출 용액의 크기를 측정하십시오. 1-2 nL는 일반적으로 사용된다; 0.1 mm 직경은 0.5 nL입니다.
   6. 바늘 팁 또는 압력 설정을 조정하여 사양 내에서 사출 부피를 가져옵니다.
3. 개발 zygotes를 식별 하 고 주입 단계를 준비. 주입 단계를 설정합니다. 직경 100mm의 페트리 접시를 가져 가라. 바닥을 반전하고 반전된 위쪽 아래에 놓습니다. 유리 현미경 슬라이드를 반전된 상단 내에 놓습니다. 마이크로 조작기를 범위에 장착하는 방법에 따라 반전된 베이스에서 추가된 높이가 불필요할 수 있습니다.
   1. 개발 난자를 보고 IVF 후 50-60 분 후에 수정된 zygotes 추정된 확인. 동물 극이 형성되기 시작하고 노른자 / 동물 세포 인터페이스 주위에 작은 지방 방울이 과다하게 있을 것입니다(그림 6).
   2. 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 가능한 한 적은 물로 10-20 개의 달걀을 모으고 (계란이 통과 할 수 있도록 팁을 약간 자르십시오) 슬라이드의 가장자리에 놓습니다. 물은 슬라이드 아래에 사악하고 가장자리에 계란을 당깁니다.
   3. 섬세한 작업 와이프를 사용하여 부드럽게 여분의 물을 제거하고 계란이 슬라이드의 가장자리에 단단히 부착 할 수 있도록 슬라이드를 누릅니다. 주입 하는 동안 계란 움직임을 피하기 위해 작은 서 수 분을 유지 하면서 계란 을 축 축 하 유지 하는 충분 한 물이 있어야 합니다.
4. 단일 셀에 직접 주입하십시오.
   1. 알을 밀기 바늘에 수직으로 수직으로 슬라이드에정렬합니다(그림 5B).
   2. 마이크로 조작기를 사용하여 바늘을 코리온에 대고 놓습니다. 대략 45 ° 각도에서 바늘을 융자에 삽입 한 다음 단일 셀에 넣습니다. 노른자를 통해 단일 세포를 입력하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 자유 손 및 마이크로 매니퓰레이터를 가진 주입 단계를 둘 다 이동하면 주사 공정에 대한 보다 많은 제어를 제공할 수있다(도 5B).
   3. 단일 세포에 sgRNA/Cas9/페놀 적색 용액을 주입합니다. 조심스럽게 바늘을 제거하십시오. 다음 달걀을 진행하고 모든 계란이 주입 될 때까지 5.4.1 - 5.4.3 단계를 반복합니다.
   4. 미세 한 집게와 주입 하는 동안 깨진 어떤 계란을 제거. 분출 병에 여과 된 시스템 물 0.22 μm를 사용하여 주입 단계에서 계란을 새로운 100mm 직경의 페트리 접시로 부드럽게 제거하십시오.
   5. 모든 계란이 주입되거나 2 세포 단계로 발전할 때까지 5.3.3-5.4.6 단계를 반복합니다. 수정 속도와 주입 성공을 결정하기 위해 무주사 대조군으로 약 20 개의 수정란을 따로 두어야합니다. 더 큰 클러치의 경우 2 세포 단계로 발전 한 주입되지 않은 배아를 사용하고, 더 작은 클러치는 추정 수정란을 따로 설정합니다.
   6. 추가적으로, 게놈에서 존재하지 않는 유전자에 대하여 sgRNA로 복잡한 Cas9를 가진 15-25배아를 주입해서 sgRNA/주입 통제를 고려하십시오. 야생형 배아에 권장되는 GFP 유전자. 각 페트리 접시에 계란, 부모, IVF 시간 및 날짜를 기록합니다. sgRNA 표적 또는 라벨을 주입되지 않은 것으로 포함한다. 29°C 인큐베이터로 이동합니다.

6. 축산

1. 계란에 대 한 관리.
   1. 계란 생존을 확인 4-6 다음 주사 시간.
   2. 죽은 계란의 수뿐만 아니라 수정되지 않은 모든 것을 기록합니다. 비수정 된 계란은 8 세포 단계 주위에 체포하고 동물 극에서 세포의 장미 패턴을 가질 것이다(그림 6). 죽은 계란의 수와 물에 계란 파편의 양에 따라, 적어도 50 %-80 %의 물을 제거하고 여과 된 시스템 물로 교체합니다. 세포 파편 필름 이나 생물 막 형성 하는 경우 페트리 접시의 바닥을 문질러 도움이 될 수 있습니다.
   3. 다음 2-3 일 동안, 매일 계란 1-2 배 확인. 계란을 확인할 때마다 6.1.2-6.1.3 단계를 반복합니다.
   4. 2-3 일 후에 애벌레가 부화할 것입니다. 부화할 때 모든 달걀 케이스를 제거합니다. 부드러운 파이펫팅은 반 해치 애벌레를 확보하는 데 도움이 될 수 있습니다.
2. 애벌레에 대 한 관리.
   1. 매일 1-2배 의 달걀을 확인하십시오. 유충을 검사할 때마다 6.1.2-6.1.3단계를 반복합니다.
   2. 6-14 DPF에서 식초 뱀장어를 유충에 공급합니다. 식초 뱀장어는 요리에 살아 남아 있기 때문에 음식의 약간의 과잉은 좋다. 접시를 점검하고 청소할 때마다 식초 장어를 넣습니다.
   3. 11-14 DPF에서, 식초 뱀장어 이외에 유충 당 5-10 갓 부화 한 아르테미아를 추가하십시오. 이 기간 동안 애벌레는 무료 수영 아르테미아를먹는 법을 배웁니다.
   4. 15 DPF에서 유충을 달걀 컵(섹션 6.2.5 참조)으로 옮기고 흐르는 물, 여과 및 폭기와 함께 탱크를 옮니다. 컵 당 약 25 배아 이상이어야합니다. 달걀 컵은 바닥에 메쉬 그물과 플라스틱 컵입니다. 100mm 페트리 접시 상단/하단을 달걀 컵 바닥에 추가하여 음식이 메쉬를 통과하는 것을 막을 수 있습니다. 달걀 컵은 물고기를 수질상의 이유로 더 많은 양의 물에 보관할 수 있게 하면서 도산그룹을 유지합니다. 15-18일부터 유충당 식초 뱀장어와 15-30 갓 부화한 아르테미아를 계속 넣습니다. 매일 페트리 접시 조각을 청소하고 죽은 아르테미아의질량을 제거하기 위해 파이펫을 사용합니다.
   5. 18일부터 30일까지는 갓 부화한 아르테미아만먹이는 다. 물고기가 성장하고 꼬리 물기가 보이는 경우 먹이 양을 증가.
   6. 약 30 일 후, 10 L (2.5 갤런) 탱크, 탱크 당 약 25 개인에 물고기를 이동합니다. 여과, 폭기 및 숨길 장소가 있는지 확인하십시오. 원통형 생물 여과 매체 및 작은 직경의 PVC 튜브를 고려하십시오.
   7. 갓 부화한 아르테미아와 검은 벌레를 약 30-45일 후에 먹이세요. 탱크의 표준 세척 및 물 변화(즉, 1주당 최소 ~10%-20%의 물 변화)를 유지하십시오.
   8. ~ 45 DPF 후, ~60 DPF까지 검은 벌레만 먹이.
   9. ~ 60 DPF 후, 약 15 물고기의 코호트를 이동 40 L (10 갤런) 탱크와 성인 축산 절차를 시작합니다. PVC 튜브와 실 "걸레"(코르크 주위에 함께 묶인 갈색 원사 덩어리)를 추가하여 숨어있는 장소를 위해(그림 3C). 물고기는 약 3-4 개월 후 수정 후 번식 크기 (10−12cm)에 가까워야합니다.

7. 성인 축산

1. 다음 수유시 소량의 검은벌레가 존재할 수 있도록 매일 충분한 검은 벌레로 물고기에게 먹이를 주어 보라고 합니다. 이 광고 리비텀 수유는 최대 성장을 허용합니다.
2. 일주일에 몇 번, 그것은 혈액 벌레와 함께 먹이 검은 벌레를 보충 하는 데 도움이 될 수 있습니다.
3. 2-4주마다 20%-30%의 물 변화로 깨끗한 탱크를 청소하십시오. 원사 걸레에 생물막/조류가 가득 차면 RO 물에서 깨끗하게 문지릅니다.

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결과

sgRNA 표적 부위는 섹션 1에 기재된 바와 같이 B. gauderio 및 B. brachyistius 둘 다에서 scn4aa의 엑톤 1 내에서 확인되었다. sgRNAs는 섹션 2에 기재된 바와 같이 생성되었다. 성공적인 sgRNA 선택 및합성(도 1)에이어, 시험관내 절단을 시험하였다(도2). 시험관내 절단을 시나는 sgRNAs는 그 후 단일 세포 미세 주사를 위해 선택되었다.

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토론

약한 전기 물고기의 현상학적 풍요로움은 유전체학 자원의 최근 확산과 함께, 약한 전기 물고기 모델에서 기능적 유전체 도구에 대한 강력한 필요성을 동기를 부여합니다. 이 시스템은 실험실에서 쉽게 보관되는 물고기의 병렬 계보에서 수많은 현상형 특성의 수렴 진화로 인해 특히 매력적입니다.

여기에 설명된 프로토콜은 전기 발생과 전기 수신을 병렬로 진화시킨 약한 전...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 mg/mL RNA grade Glycogen	Thermo Scientific	R0551
50 bp DNA ladder	NEB	N3236L
Borosilicate glass capillary with filament	Sutter Instrument	BF100-58-10	(O.D. 1.0 mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)
Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL	PNA Biology	CP01
Dneasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69506
Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector	Fisher Scientific	E5252000021
Eppendorf Microloader Pipette Tips	Fisher Scientific	10289651
Hamilton syringe	Fisher Scientific	14-824-654	referred to as "precision glass syringe" in the protocol
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666	referred to as "delicate task wipe" in the protocol
MEGAscript T7 Transcription Kit	Invitrogen	AM1334
NEBuffer 3	NEB	B7003S	used for in vitro cleavage assay
OneTaq DNA kit	NEB	M0480L
Ovaprim	Syndel USA	https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html	referred to as "spawning agent" in the protocol
Parafilm	Fisher Scientific	S37440	referred to as "thermoplastic" in the protocol
Pipette puller	WPI	SU-P97	sutter brand
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Reusable needle- requires customization	Fisher Scientific	7803-02	Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25
T4 DNA polymerase	NEB	M0203L	Use with the 10x NEB buffer that is included
Teflon coated tools	bonefolder.com	T-SPATULA4PIECE	referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol