Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الهدف من هذا البروتوكول هو استخدام درجه الحرارة للسيطرة علي سرعات تدفق السوائل النشطة ثلاثية الابعاد. ميزه هذا الأسلوب لا يسمح فقط لتنظيم سرعات التدفق في الموقع ولكن أيضا تمكن التحكم الديناميكي ، مثل بشكل دوري ضبط سرعات التدفق صعودا وهبوطا.

Abstract

نقدم طريقه لاستخدام درجه الحرارة لضبط سرعات التدفق من السوائل النشطة ثلاثية الابعاد (3D) المستندة إلى الميكروبات ، والقائمة علي الميكروتوبولي. هذا الأسلوب يسمح لضبط السرعات في الموقع دون الحاجة إلى تصنيع عينات جديده للوصول إلى سرعات مختلفه المرجوة. وعلاوة علي ذلك ، فان هذه الطريقة تمكن التحكم الديناميكي في السرعة. ركوب الدراجات في درجه الحرارة يؤدي إلى تدفق السوائل بسرعة وبطء ، بشكل دوري. ويستند هذا التحكم علي خصائص Arrhenius من رد فعل kinesin-ميكروتوبولي ، مما يدل علي مدي سرعه تدفق متوسط تسيطر عليها من 4-8 μm/ثانيه. الطريقة المعروضة ستفتح الباب لتصميم الاجهزه الصغيرة التي تكون فيها معدلات التدفق في القناة قابله للتوقد محليا دون الحاجة إلى صمام.

Introduction

وتختلف المادة الفعالة عن المسالة السلبية التقليدية بسبب قدرتها علي تحويل الطاقة الكيميائية إلى عمل ميكانيكي. المواد التي تمتلك هذه القدرة يمكن ان تتكون من الكائنات الحية أو غير الحية مثل البكتيريا والحشرات ، الغرويات ، الحبوب ، وخيوط خلوي1،2،3،4،5،6،7،8،9،10. تتفاعل هذه الكيانات المادية مع جيرانها. علي نطاق أوسع ، انها ذاتية التنظيم في الدوامات المضطربة مثل (الاضطراب النشط) أو تدفقات المواد11،12،13،14،15،16،17،18،19،20. وقد ادي فهم التنظيم الذاتي للمسالة النشطة إلى تطبيقات مختلفه في المكوكات الجزيئية ، والاجهزه البصرية ، والحساب الموازي21،22،23. يتطلب إحضار التطبيقات إلى المستوي التالي التحكم خارج التنظيم الذاتي. علي سبيل المثال ، وضعت Palacci وآخرون الغروانيه المغلفة التي ذاتية الدفع فقط عندما تتعرض للضوء الأزرق المتحكم به يدويا ، مما ادي إلى ظهور البلورات الحية24. إنشات morin وآخرون السيطرة علي الغرويات كوينكه المتداول باستخدام حقل كهربائي الخارجية انضباطي ، مما ادي إلى يتدفقون الغرويه في قناه مثل مضمار السباق25. وتبين هذه الاعمال السابقة دور الرقابة المحلية في التطبيقات وتقدم قاعده المعارف الخاصة بالمادة الفعالة.

في هذه المقالة ، نركز علي التحكم في السوائل النشطة ثلاثية الابعاد المستندة إلى kinesin ، والتي تعتمد علي الميكروبات (MT). تتكون السوائل من ثلاثه مكونات رئيسيه: MTs ، كينيسن المحركات الجزيئية ، والاستنزاف. يحث ال يستنزف قوه استنزاف ان يربط ال [MTs], اي يكون فيما بعد سدت بمحرك عناقيد. هذه المحركات المشي علي طول MTstoward نهاية زائد. عندما زوج من سد متسيس انتيمتوازي ، المحركات المقابلة المشي في اتجاهين معاكسين. ومع ذلك ، فان المحركات منضمة في كتله وغير قادره علي المشي بعيدا ، لذلك فانها بالتعاون الشريحة أزواج من MTs (الخيوط انزلاق ، الشكل 1ا). تتراكم هذه الديناميكيات المنزلقة ، مما يسبب حزما من MTsto تمتد حتى تصل إلى نقطه عدم الاستقرار الخاصة بهم وكسر (حزم اكستيسسيل ، الشكل 1ب)26. الحزم مكسوره صلبت بالاستنزاف قوه, اي فيما بعد يمدد ثانيه, والديناميات تكرار. خلال عمليه الديناميكيات المتكررة ، حركات الحزمة يحرك السائل القريب ، مما يحفز التدفقات التي يمكن تصورها عن طريق المنشطات مع المتتبعين علي نطاق ميكرون (الشكل 1ج). وقد ميزت سانشيز et al. و henkin et al السرعات المتوسطة من المتتبعين ، ووجدت ان السرعات كانت قابله للتوقد من خلال تفاوت تركيزات الفوسفات الثلاثي (ATP) ، والاستنزاف ، والتكتلات الحركية ، و MTs19،27. ومع ذلك ، كانت هذه التوبيليتي موجودة فقط قبل تخليق السوائل النشطة. بعد التوليف ، وفقدت tunability ، والسوائل المنظمة ذاتيا في طريقتهم الخاصة. للسيطرة علي نشاط السوائل النشطة بعد التوليف ، Ross.et al. ذكرت طريقه باستخدام الضوء تنشيط البروتينات الحركية ، مما يسمح للنشاط السوائل ليتم ضبطها وإيقافها باستخدام ضوء28. في حين ان التحكم في الضوء ملائم من حيث تنشيط السوائل محليا ، فان الطريقة تتطلب أعاده تصميم هياكل بروتينات المحركات ، إلى جانب تعديل المسارات البصرية في المجهر. هنا ، ونحن نقدم وسيله سهله الاستخدام للسيطرة علي تدفقات السوائل محليا دون تعديل المجهر مع الحفاظ علي هيكل المحرك سليمه.

ويستند طريقتنا لضبط تدفق السائل النشط محليا علي القانون arrhenius لأنه تم الإبلاغ عن رد فعل kinesin-MT لزيادة مع درجه الحرارة29,30,31,32. وأظهرت دراساتنا السابقة ان الاعتماد علي درجه الحرارة من متوسط سرعه تدفق السوائل النشطة يتبع المعادلة Arrhenius: v = اكسب (-ea/RT) ، حيث هو عامل ما قبل الاسي ، R هو ثابت الغاز ، ea هو الطاقة التنشيط ، و T هو درجه حرارة النظام33. ولذلك ، النشاط السوائل حساسة للبيئة درجه الحرارة ، ودرجه حرارة النظام يحتاج إلى ان تكون متسقة لتحقيق الاستقرار في أداء السيارات ، التالي ، فان سرعه تدفق السوائل34. في هذه المقالة ، ونحن نظهر استخدام الاعتماد علي درجه حرارة المحرك لضبط باستمرار سرعات تدفق السوائل النشطة عن طريق ضبط درجه حرارة النظام. كما اننا نظهر اعداد عينه سائله نشطه ، تليها تركيب العينة علي مرحله المجهر التي يتم التحكم في درجه حرارتها عن طريق برامج الكمبيوتر. زيادة درجه الحرارة من 16 درجه مئوية إلى 36 درجه مئوية يسرع متوسط تدفق سرعات من 4 إلى 8 μm/ثانيه. بالاضافه إلى ذلك ، فان القدرة علي الانعكاس قابله للعكس: زيادة متكررة وخفض درجه الحرارة بالتعاقب يسرع ويبطئ التدفق. وتنطبق الطريقة الموضحة علي مجموعه واسعه من الانظمه التي تمتثل فيها ردود الفعل الرئيسية لقانون arrhenius ، مثل فحص المزلق المنزلق29و30و31و32.

Protocol

1-اعداد الMTs

تحذير: في هذه الخطوة نقوم بتنقية الأنابيب من نسيج الدماغ البقري. الدماغ البقري قد يسبب البديل Creutzfeldt-جاكوب المرض (vCJD)35. ولذلك ، ينبغي جمع نفايات المخ والحلول ذات الصلة ، والزجاجات ، ونصائح الماصة في كيس من النفايات البيولوجية والتخلص منها باعتبارها نفايات بيولوجية خطره وفقا لقواعد المؤسسة.

  1. تنقيه الأنابيب من الدماغ البقري (تعديل من Castoldi وآخرون36).
    1. نقل حوالي 1.5 كيلوغرام من الادمغه البقرية الطازجة من مسلخ محلي إلى غرفه الجامعة الباردة. اثناء النقل ، وتخزين العقول في العازلة الفوسفات (20 مم الجناح2PO4، 150 Mm nacl ، pH 7.2) علي الجليد.
      ملاحظه: لتعظيم الغلة النهائية من الأنابيب ، والكمية الاوليه من الأنابيب الوظيفية في انسجه الدماغ الطازجة هو المفتاح. العقول الطازجة تحتوي علي أنابيب أكثر وظيفية. للحصول علي العقول الطازجة من المسلخ ، ونحن نوصي طلب الجزار لتوفير العقول من الأبقار المذبوحة مؤخرا. يجب ان لا يكون الدماغ أكبر من 3 ساعات عند بدء الاجراء ، لان تقليل الوقت بين الذبح وبدء الإجراءات سينتج عوائد أفضل.
    2. التجانس وتوضيح العقول.
      1. تنظيف الدماغ باستخدام الرؤوس القشرية لقطع الاوعيه الدموية والنسيج الضام إلى قطع أصغر وأزالها من الدماغ باليد.
        ملاحظه: يجب ان تكون العقول التي تم تنظيفها الوردي.
      2. تزج انسجه المخ تنظيفها في 1 لتر من العازلة ديالبلمره (DB: 50 mM 2-(ن-مورفينو) حمض اثانيسولفونيك ، 1 مم CaCl2، pH 6.6) لكل كيلوغرام من الدماغ.
      3. تجانس العقول مع خلاط المطبخ.
      4. الطرد المركزي حل الدماغ المتجانس في 10,000 x g و 4 درجه مئوية ل 150 دقيقه.
    3. تتبلمر MTs (البلمره الاولي).
      1. جمع ومزج ماده طافي مع كميات متساوية من الحلول التالية في 37 درجه مئوية: الجلسرين ، عاليه الحرارة أنابيب العازلة (hmpb: 1 متر الأنابيب ، 10 مم mgcl2، 20 مم الاثيلين جلايكول-bis (β-امينوهيول الأثير)-n ، n ، n ' ، n'-رباعي 6.9 حامض
      2. أضافه 1.5 mM ATP و 0.5 mM غوانوزين ثلاثي الفوسفات (GTP) إلى الخليط.
      3. احتضان الخليط في 37 درجه مئوية لمده 1 ساعة.
    4. ديبوليميريزي MTs (أول ديبوليبوليتي MT).
      1. بيليه MT بواسطة يطرد في 151,000 x g و 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
      2. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق كل بيليه MT في 10 مل من 4 درجه مئوية DB.
      3. احتضان علي الجليد لمده 30 دقيقه.
      4. الخلط بين الخليط كل 5 دقائق مع طرف ماصه لتجنب الترسب MT.
        ملاحظه: الخليط يجب ان تتحول واضحة في 30 دقيقه ، مما يدل علي الانتهاء من ديالبلمره MT.
    5. تتبلمر MTs (ثاني طن متري البلمره).
      1. توضيح الحل عن طريق يطرد في 70,000 x g و 4 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
      2. جمع ومزج ماده طافي مع كميات متساوية من 37 درجه مئوية الجلسرين و hmpb.
      3. أضافه 1.5 mM ATP و 0.5 mM GTP إلى الخليط.
      4. احتضان الخليط في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
    6. كرر الخطوة 1-1-4 ، استبدال hmpb مع المخزن المؤقت تجميع برينكلي (brb) 80 (80 mm أنابيب ، 1 مم mgcl2، 1 mm egta ، pH 6.8) ، تليها توضيح الخليط تطهيرها من قبل يطرد في 79,000 x g و 4 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
    7. جمع العملاق. قياس الامتصاص 280 nm مع مطياف. تحديد تركيز الأنابيب باستخدام قانون البيره لامبرت (معامل الانقراض من الأنابيب: 1.15 (مغ/مل)-1سم-1)37،38.
    8. تخزين البروتين في-80 درجه مئوية.
  2. أعاده تدوير الأنابيب (تعديل من Castoldi et al.36).
    ملاحظه: لتعزيز نقاء الأنابيب ، يتم بلمره الأنابيب المنقية وديبوليميريزيد مره أخرى.
    1. تتبلمر MTs عن طريق خلط الأنابيب المنقية (الخطوة 1.1.7) مع 500 μm ديثيوثريتول (dtt) و 20 μm gtp ، تليها 30 دقيقه من الحضانة في 37 درجه مئوية.
    2. بيليه الMTs.
      1. تحميل 1 مل من وساده الجلسرين (80 mM أنابيب ، 1 مم MgCl2، 1 مم egta ، 60 ٪ v/v الجلسرين ، pH 6.8) في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي.
      2. وضع MTs بلمره علي راس وساده.
      3. جهاز الطرد المركزي في 172,000 x g ل 90 دقيقه في 37 درجه مئوية.
    3. ديبوليميريزي الMTs.
      1. أزاله الفائقة ووسادة.
      2. أعاده تعليق كل بيليه MT في 150 μL من 4 ° c MT العازلة (M2B: 80 mM أنابيب ، 2 مم MgCl2، 1 MM Egta ، pH 6.8).
      3. احتضان الخليط علي الجليد لمده 30 دقيقه.
      4. اجتر الخليط بطرف ماصه كل 5 دقائق. يجب ان يتحول الخليط بوضوح.
    4. توضيح الخليط بواسطة يطرد في 172,000 x g و 4 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
    5. جمع العملاق. قياس تركيز البروتين. يخزن عند-80 درجه مئوية.
  3. تسميه الأنابيب مع صبغ الفلورسنت39.
    1. تتبلمر MTs. خلط الأنابيب المنقية (الخطوة 1.1.7) مع 500 μM DTT و 16.7 μM GTP ، واحتضان الخليط في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
    2. بيليه الMTs.
      1. مكان 1 مل من 37 درجه مئوية وساده عاليه الحموضة (0.1 M NaHEPES ، 1 مم MgCl2، 1 MM egta ، 60 ٪ v/v الجلسرين ، pH 8.6) في أنبوب الطرد المركزي.
      2. وضع بلمره MTs علي وساده.
      3. جهاز الطرد المركزي في 327,000 x g ل 50 دقيقه في 37 درجه مئوية.
    3. تسميه الأنابيب.
      1. أعاده تعليق كل بيليه MT مع 700 μL من 37 درجه مئوية العازلة التسمية (0.1 M NaHEPES ، 1 مم MgCl2، 1 مم egta ، 40 ٪ v/v الجلسرين ، pH 8.6).
      2. اخلطي التعليق مع الفائض المولي من 10 إلى 20 من الصبغة الفلورية الحمراء البعيدة مع استر النجاح.
      3. احتضان الخليط في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه في الظلام للسماح MTs للرد مع استر من صبغه الفلورسنت.
      4. وقف رد فعل العلامات التي تشبع استر من صبغ تعليق مع 50 mM K-الغلوتامات ، احتضان لمده 5 دقائق في 37 درجه مئوية.
    4. بيليه المسمي MTs: كرر الخطوة 1-3-2 ، استبدال وساده عاليه الحموضة مع وساده منخفضه الحموضة (80 mM أنابيب ، 2 مم MgCl2، 1 مم egta ، 60 ٪ v/v الجلسرين ، pH 6.8).
    5. ديبوليميريزي MTs.
      1. تجاهل الفائق والوسادة.
      2. أعاده تعليق بيليه في 700 μL من 4 ° c M2B.
      3. احتضان التعليق علي الجليد.
      4. اجتت كل 5 دقائق بطرف ماصه حتى يصبح المحلول واضحا.
    6. توضيح الحل تطهيرها من قبل يطرد في 184,000 x g و 4 درجه مئوية ل 35 دقيقه.
    7. عزز نقاء محلول الأنابيب المسمي من خلال تكرار الخطوات 1.2.1 – 1-2.
    8. قياس تركيز البروتينات وصبغه الفلورسنت. استخدم هذه القياسات لتحديد تركيز الأنابيب وكسور الأنابيب المسمية ، والتي تعرف بأنها نسبه تركيزات الصبغة الفلورية إلى الأنابيب.
    9. تخزين حل الأنابيب المسمية في-80 درجه مئوية.
  4. تتبلمر MTs (اعتمد من سانشيز وآخرون19):
    1. خلط الأنابيب المعاد تدويرها (الخطوة 1-2) مع المسمي الأنابيب (الخطوة 1.3.9) في نسبه التي تعطي 3% المسمية الجزء الأنبوبي.
    2. مزيج 8 ملغ/مل من خليط الأنابيب مع 1 مم DTT و 0.6 mM غوانوزين ' [(α ، β)-ميثيلينو] ثلاثي الفوسفات (GMPCPP) ، تليها 30 دقيقه من الحضانة في 37 درجه مئوية.
    3. بعد الحضانة ، اننيل MTs في درجه حرارة الغرفة في الظلام لمده 6 ساعات.
    4. Aliquot وتخزين في-80 درجه مئوية.

2. توليف مجموعات كينيسن

ملاحظه: البكتيريا موجودة بشكل مطلق ويمكن ان تنمو في وسائل الاعلام وتلوث عمليه التحضير. لمنع التلوث ، يجب القيام بالإجراءات التي تنطوي علي ملامسه ثقافات الخلايا (علي سبيل المثال ، وضع الأنابيب) بالقرب من اللهب. يجب تعقيم أدوات مثل القوارير والماصات ونصائح الماصة والوسائط واللوحات قبل الاستخدام.

  1. التعبير عن كينيسن المحركات في اساسيكشيا القولونية40.
    1. تحويل الخلايا.
      1. ماصه 1 μl من K401-bccp-H6 البلازميد إلى 10 μl من الخلايا المختصة.
      2. احتضان علي الجليد لمده 5 دقائق.
      3. صدمه الحرارة في 42.5 درجه مئوية ل 45 s.
      4. احتضان الخلايا علي الجليد لمده 2 دقيقه للسماح الانتعاش.
      5. خلط الخلايا مع 300 μL من المضادات الحيوية 2XYT (5 غرام/لتر كلوريد الصوديوم ، 10 غرام/لتر الخميرة استخراج ، 16 غرام/لتر الترتوني).
      6. احتضان الخلايا في 37 درجه مئوية لمده 1 ساعة.
        ملاحظه: ما لم يتم تحديد ، مراقبه نمو الخلية غير مطلوب اثناء الحضانة.
    2. تطعيم اللوحات الاعلاميه.
      1. نشر ثقافة الخلية علي لوحه 2XYT (10 غرام/لتر كلوريد الصوديوم ، 5 غرام/لتر الخميرة استخراج ، 10 غرام/لتر التريتوني ، 15 غرام/لتر أجار ، 100 ميكروغرام/مل الامبيسلين ، 25 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول).
      2. احتضان لوحه راسا علي عقب في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
    3. تطعيم الوسائط السائلة.
      1. من اللوحة الليلية ، حصاد مستعمره واحده معزولة مع طرف ماصه.
      2. إخراج غيض في قارورة تحتوي علي 50 مل من 2XYT.
      3. احتضان ويهز وسائل الاعلام الثقافة في 37 درجه مئوية و 200 دوره في الدقيقة لمده 12-16 ح.
    4. قم بتوسيع الخلايا.
      1. مزيج 2.5 mL من ثقافة الخلية في 500 مل من 2XYT.
      2. احتضان ويهز 500 mL الثقافة في 37 درجه مئوية و 250 دوره في الدقيقة لمده 3-6 ساعة.
    5. الحث علي التعبير عن البروتين.
      1. اثناء الحضانة ، ورصد نمو الخلايا عن طريق قياس الامتصاص في 600 نانومتر ، وذلك باستخدام 2XYT كمرجع. قياس الامتصاص كل دقيقه 60 ، حتى تصل إلى OD600 = 0.3. ثم قياس الامتصاص كل 30 دقيقه حتى تصل إلى 0.5-0.6.
      2. السماح للخلايا بالنمو حتى يصل الامتصاص إلى OD600 = 0.5 – 0.6
      3. أضافه 24 ميكروغرام/مل البيوتين و 1 مم ايزوبروبيل β-د-1-ثيوغالالاكتويرانيوسيد (IPTG) إلى ثقافة الخلية.
        ملاحظه: يستخدم iptg للحث علي التعبير عن البروتين من المحركات كينيسن ، والتي يتم المفتاحية مع البيوتين كربوكسيل البروتين الناقل (bccp) وسته histidines (H6). يتم استخدام العلامة H6 في عمليه التنقية (الخطوة 2.2) ، في حين ان BCCP يربط جزيئات البيوتين المضافة إلى المحركات التي تم التعبير عنها.
      4. احتضان ويهز ثقافة الخلية في 20 درجه مئوية و 250 لفه في الدقيقة لمده 12-20 ساعة.
    6. حصاد الخلايا عن طريق يطرد في 5,000 x g و 4 درجه مئوية لمده 10 دقيقه. تجاهل supernatant. تخزين كريات الخلية في-80 درجه مئوية.
  2. تنقيه بروتين المحرك كينيسن (تعديل من spriestersbach وآخرون41):
    1. تعليق الخلية بيليه (الخطوة 2-1-6) مع حجم متساو من المخزن المؤقت تحلل (أنابيب 50 mM ، 4 مم MgCl2، 50 μM ATP ، 10 ملم 2-mercaptoethanol (السم) ، 20 مم ايميدازول ، pH 7.2) ، تليها أضافه قرص واحد من مثبطات الانزيم البروتيني ، 2 ملغ من فلوريد السلفونيل البيرفلوروكتاني (pmsf) ، و 2 ملغ من lysozyme.
    2. Lyse الخلايا عن طريق تجميد فلاش في النيتروجين السائل (LN) 3x وذوبان خليط الخلية.
      ملاحظه: بعد ليسينج ، يجب ان يصبح الخليط لزج.
    3. توضيح خليط الخلايا التي يطرد في 230,000 x g و 4 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
    4. جمع ماده طافي وتتدفق من خلال عمود الجاذبية ، تليها غسل العمود مع 10 مل من تحلل العازلة.
      ملاحظه: يجب ان تظل البروتينات التي تحتوي علي علامة H6 ، مثل كينيسن K401-bccp-H6 ، في العمود.
    5. التملص من البروتين الموسومة مع 5 مل من المخزن المؤقت eluate (50 mM أنابيب ، 4 مم MgCl2، 50 μM ATP ، 500 mm ايميدازول ، pH 7.2). جمع تدفق-من خلال التسلسل في 1 مل الكسور. لتحديد الكسور المحتوية علي البروتين ، امزج 3 μL من كل كسر مع 100 μL من صبغه التريفينيلميثان. يجب ان تتحول الكسور المحتوية علي البروتين إلى اللون الأزرق. الجمع بين هذه الكسور وتمييع 5x مع تحلل العازلة.
    6. تركيز محلول البروتين.
      1. تحميل الحل في أنبوب فلتر الطرد المركزي.
      2. جهاز الطرد المركزي في 3,000 x g ل 10 دقيقه في 4 °c.
      3. يهز الأنبوب برفق والطرد المركزي مره أخرى حتى حجم الحل هو < 3 مل.
    7. قياس تركيز البروتين مع مطياف (معامل الانقراض: 0.549 (مغ/مل)-1سم-1)42،43. تمييع البروتين إلى 1 مغ/مل في حين أضافه 35 ٪ ث/الخامس السكروز.
    8. يخزن عند-80 درجه مئوية.
  3. قياس تركيزات كينيسن مع هلام الكهربائي (المعدلة من تايلور وآخرون44).
    ملاحظه: لقياس تركيز كينيسن مع هلام الكهربائي ، أنابيب هو سلم التركيز المثالي بسبب نقاء عاليه وتركيزه القابل للقياس عن طريق مطياف (الشكل 2ا)36.
    1. اعداد العينات الأنابيب مع تركيزات 0.25 ، 0.5 ، 0.75 ، 1.00 ، و 1.25 mg/mL. مزيج 15 μl من كل عينه الأنابيب وعينه كينيسن (خطوه 2.2.8) بشكل منفصل مع 5 μl من عينه العازلة (200 mm تريس-HCl ، 8 ٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) ، 400 mm dtt ، 0.2 ٪ بروموفينول الأزرق ، 40 ٪ الجلسرين ، pH 6.8) واحتضان في 90 درجه مئوية لمده 3 دقائق.
    2. جهز الكهربائي
      1. قفل هلام الكهربائي في مربع هلام.
      2. ملء مربع مع تشغيل المخزن المؤقت (50 mM MOPS ، 50 mM قاعده تريس ، 0.1 ٪ SDS ، 1 ملليمتر ايثيلليندياتيتاتاستيك حمض (أدتا) ، pH 7.7).
        ملاحظه: تاكد من ان مستوي المخزن المؤقت اعلي الفتح العلوي للهلام.
    3. تحميل 10 μl من البروتين سلم القياسية ، وعينات الأنابيب ، وعينه كينيسن في الآبار منفصلة وتطبيق 200 V عبر هلام لمده 45 دقيقه.
    4. هلام تلطيخ.
      1. احتضان وصخره هلام مع المغلي (حوالي 95 درجه مئوية) وصمه عار محلول A (0.5 g/L triفينيلبيراسيتام الميثان صبغ ، 10 ٪ v/v حمض الخليك ، 25 ٪ ايزوبروبانول) لمده 5 دقائق ، ثم شطف هلام مع الماء منزوع الأيونات (DI).
      2. كرر مع حلول وصمه عار B (0.05 g/L triفينيلبيراسيتام الميثان صبغ ، 10 ٪ الخامس/الخامس حمض الخليك ، 10 ٪ ايزوبروبانول) ، C (0.02 g/L triفينيلبيراسيتام الميثان صبغ ، 10 ٪ الخامس/الخامس حمض الخليك) ، و D (10 ٪ v/v حمض الخليك) ، بالتتابع. احتضان وصخره الهلام في المياه DI بين عشيه وضحيها.
    5. افحص الهلام. تحويل صوره هلام إلى صوره الرمادي ، تليها عكس الأسود والأبيض وتعزيز التباين للكشف عن عصابات البروتين الساطع في الخلفية السوداء.
    6. قياس سطوع كل نطاق عن طريق جمع قيم البكسل. تطبيق الخطية تناسب C = aB + b، حيث b هو سطوع النطاق الأنبوبي ، C هو التركيز المقابلة ، و a و b هي المعلمات المناسبة. تحديد تركيز كينيسن Ck باستخدام سطوع الفرقة كينيسن Bk لحساب المعادلة الخطية: Ck = aBk + B.
  4. الكتلة المحركات كينيسن.
    1. مزيج 1.5 μm كينيسن (خطوه 2.2.8) مع 120 μm dtt و 120 nM سترافيدين. احتضان علي الجليد لمده 30 دقيقه.
    2. يخزن عند-80 درجه مئوية.

3. اعداد الشرائح الزجاجية المغلفة بولياكرياميد والشفتين (تعديل من Lau et al.45)

  1. تحميل الشرائح الزجاجية الجديدة والزجاج coverslips في الحاويات المقابلة. دمج الشرائح والشفتين في 1 ٪ v/v المنظفات في الماء DI ثم يغلي الماء في الميكروويف.
  2. قم بنسخ الشرائح والشفتين لمده 5 دقائق ثم اشطفها بالماء DI لأزاله المنظفات.
  3. دمج ونسخ الشرائح والشفتين في الايثانول لمده 5 دقائق شطف مع المياه DI.
  4. الدمج والمزج بين الشرائح والشفتين في هيدروكسيد البوتاسيوم 100 مم (KOH) لمده 5 دقائق. شطف مع المياه DI.
  5. احتضان الشرائح والشفتين في محلول سيلان (1 ٪ حمض الخليك و 0.5 ٪ 3-(trimethoxysilyl) بروبيل ميثاكريليت في الايثانول) لمده 15 دقيقه ثم شطف مع الماء دي.
  6. احتضان الشرائح والشفتين في محلول اكريلاميد (2 ٪ ث/ث اكريلاميد ، 0.7 ملغ/مل persulfate الأمونيوم ، و 0.0035 ٪ v/v تيتراميثيليثيلينيدياميني في المياه دي) ل ≥ 3 ح.
  7. تخزين الشرائح والشفتين في محلول اكريلاميد.

4. اعداد السوائل النشطة المستندة إلى المحرك ، والتي تعتمد علي الطن المتري

  1. اعداد السوائل النشطة (المعدلة من سانشيز وآخرون19).
    ملاحظه: توضح الخطوات التالية عمليه تحضير 100 μL من سائل نشط باستخدام أسهم المثال. الحجم النهائي قابل للتطوير ، ويمكن تعديل تركيزات الأسهم المثال طالما يتم الحفاظ علي التركيز النهائي لكل مكون.
    1. مزيج 16.7 μl من 8 مغ/مل MTs (خطوه 1.4.4) مع 6.7 μl من 1.8 μM كينيسن مجموعات المحركات (الخطوة 2-4) ، و 1.1 μl من 500 mm dtt في الملح العالي M2B (M2B + 3.9 mm mgcl2).
    2. حزمه MTs عن طريق أضافه 11.4 μL من 7 ٪ ث/ث البولي إيثيلين غليكول (PEG).
    3. تنشيط المحركات كينيسن عن طريق أضافه 2.8 μl من 50 mM ATP.
    4. الحفاظ علي تركيزات ATP عن طريق أضافه 2.8 μl من الأوراق المالية البيروفات كيناز/اللاكتات نازعه (PK/ldh) و 13.3 μl من 200 ملم فوسففينول بيروفات (PEP).
    5. الحد من تاثير التصوير الضوئي عن طريق أضافه 10 μL من 20 مم Trolox ، 1.1 μL من 3.5 mg/mL catalase ، 1.1 μL من 20 ملغ/مل اكسيداز الجلوكوز ، و 1.1 μL من 300 ملغ/مل الجلوكوز.
    6. تتبع حركه السائل عن طريق أضافه 1.6 μL من 0.025% v/v جزيئات التتبع.
    7. أضافه M2B عاليه الملح لتحقيق حجم إجمالي 100 μL.
      ملاحظه: أوامر الخلط في الخطوات 4-1-1-4.1.6 قابله للتبادل. ومع ذلك ، مره واحده ATP ، MTs ، والمحركات مختلطة ، والمحركات تبدا في استهلاك ATP في حين يخطو علي طول MTs. يتم تنشيط العينة مع عمر محدود بسبب الوقود المحدود (ATP و PEP) ، التالي يجب ان تبدا التجربة علي الفور. يجب ان تحتوي علي السائل النشط النهائي 1.3 ملغ/مل MT ، 120 nM كينيسن مجموعات المحركات ، 5.5 mm dtt ، 0.8 ٪ ث/ث PEG ، 1.4 mm ATP ، 2.8 ٪ v/الخامس PK/ldh ، 27 مم PEP ، 2 مم trolox ، 0.038 mg/ml catalase ، 0.22 ملغ/مل اكسيداز الجلوكوز ، 3.3 ملغ/مل الجلوكوز ، و 0.0004 ٪ v/v الغروانيه في ارتفاع الملح M2B
  2. اعداد عينه في قناه تدفق (المعدلة من ششاناكار وآخرون46):
    1. شطف الشرائح الزجاجية المغلفة بولياكرياميد والمشبك (الخطوة 3.7) مع المياه DI. تجفيف النظارات مع الهواء المضغوط. ضعها علي سطح مستو ونظيف.
    2. قطع شريطين من الأفلام الشمع مع عرض 3 ملم وبنفس طول الزجاج كوفيرسليب (20 ملم). ادراج الشرائط بين الشريحة و كوفيرسليب كفواصل قناه.
    3. التمسك الزجاج إلى الفيلم الشمع عن طريق وضع الزجاج الشمع مجمع علي لوحه الساخنة 80 درجه مئوية لأذابه الشمع. اثناء الذوبان ، اضغط علي المشبك برفق بطرف ماصه لكي يلتزم بشكل موحد بفيلم الشمع علي الأسطح الزجاجية. بعد التصاق ، وتبريد مجمع الزجاج إلى درجه حرارة الغرفة.
    4. تحميل السوائل النشطة (الخطوة 4.1) إلى قناه التدفق. ختم القناة مع الغراء الاشعه فوق البنفسجية.

5. مراقبه درجه حرارة العينة

  1. بناء اعداد التحكم في درجه الحرارة (المعدلة من التصاميم في لووينسوهن et al. وو et al.47،48،49).
    1. اعداد كتله تبريد ألمنيوم.
      1. مطحنه لوحه ألومنيوم مع ابعاد ما يقرب من 30 مم × 30 مم × 5 مم.
      2. حفر قناه داخلية من خلال لوحه (الشكل 3ا) وتثبيت التجهيزات خرطوم في نهايات القناة.
      3. ربط كل المناسب إلى أنبوب المياه.
      4. توصيل أنبوب واحد إلى مضخة خزان الأسماك في خزان المياه في حين تمديد الأنبوب الآخر إلى الخزان.
        ملاحظه: ستقوم المضخة بتوزيع مياه الخزان من خلال قنوات ألمنيوم الداخلية للحفاظ علي درجه حرارة الكتلة عند درجه حرارة الغرفة تقريبا.
    2. سلك بروده حراريه (TEC) و thermosensor إلى وحده تحكم في درجه الحرارة. قم بتوصيل وحده التحكم بالكمبيوتر باستخدام منفذ USB (الشكل 3B).
    3. سلك وحده تحكم درجه الحرارة إلى تيار مباشر (DC) إمدادات الطاقة. تشغيل وحده التحكم عن طريق توصيل إمدادات الطاقة إلى ماخذ كهربائيه.
    4. قم باجراء الاعداد الاولي للمجلس التنفيذي الانتقالي بعد دليل الشركة المصنعة لوحده التحكم. اختبار الإخراج TEC. فمن المستحسن للسيطرة علي وحده تحكم درجه الحرارة عن طريق البرمجيات المقدمة من قبل الشركة المصنعة ، مما يسمح بتسجيل البيانات thermosensor وأسهل التلاعب من وحده تحكم درجه الحرارة.
    5. تحديد جوانب التدفئة والتبريد للمجلس التنفيذي الانتقالي.
    6. قم بتوصيل جانب التبريد الخاص ب TEC علي كتله التبريد (الخطوة 5.1.1) باستخدام المعجون الحراري.
    7. قم بتوصيل قرص زفير إلى جانب التسخين الخاص ب TEC باستخدام عجينه حراريه.
    8. اكتمل الاعداد. سطح الياقوت و thermosensor يمكن الاتصال عينه لتبريد وتسخين العينة علي أساس درجه الحرارة ودرجه الحرارة المستهدفة.
      ملاحظه: من المستحسن ان اللجنة التنفيذية وكتله التبريد لديها ثقب مركزي الانحياز للتصوير العينات باستخدام المجهر الميداني الساطع (الشكل 3ج).
  2. استخدم اعداد التحكم في درجه الحرارة للتحكم في درجه حرارة العينة33.
    1. تحميل العينة إلى الاعداد.
      1. ضع عينه السائل النشطة (الخطوة 4.2.4) علي سطح الزفير مع الجانب المنزلق الاتصال بالسطح.
      2. تامين الشريحة الزجاجية مع الشريط الورقي.
      3. إرفاق thermosensor إلى سطح كوفيرسليب باستخدام الشريط النحاسي.
    2. جبل الاعداد علي مرحله المجهر مع الجانب كوفيرسليب التي تواجه نحو الأهداف. علي سبيل المثال ، علي المجهر المقلوب ، يجب ان الجانب كوفيرسليب الوجه إلى أسفل. تامين الاعداد مع شريط الورق والمشابك ابره مرحله المجهر إذا كان ذلك ممكنا.
      ملاحظه: يجب ان المرحلة درجه الحرارة المقدمة العمل مع المجاهر المشتركة التي اما مقلوبه أو تستقيم. لضمان عدم نقل مرحله درجه الحرارة اثناء التجربة ، فمن الأفضل لتامين مرحله درجه الحرارة إلى مرحله المجهر مع الشريط.
    3. التحكم في درجه حرارة العينة.
      1. بدوره علي وحده تحكم درجه الحرارة ومضخة خزان الأسماك.
      2. اتبع دليل الشركة المصنعة لتعيين درجه الحرارة المستهدفة وتمكين التحكم في درجه الحرارة. فان وحده تحكم ضبط التدفئة أو التبريد السلطة علي أساس درجه الحرارة المستهدفة ودرجه حرارة العينة ، كما تقييمها من قبل thermosensor.
    4. سجل درجات حرارة العينة.
      1. اتبع دليل الشركة المصنعة لتسجيل بيانات درجه الحرارة الحرارية اثناء التجربة.
        ملاحظه: يجب الآن ان يتم التحكم في درجه حرارة العينة من قبل وحده التحكم وتسجيلها من قبل الكمبيوتر (الشكل 3د).

6. تميز نشاط السوائل النشطة (المعدلة من الأساليب من قبل henkin et al. وو et al.20,27)

ملاحظه: يتم استخدام المقاطع السابقة لاعداد عينات السوائل النشطة (الأقسام 1 – 4) والتحكم في درجه حرارتها (القسم 5). لإثبات استخدام درجه الحرارة للسيطرة علي نشاط السوائل النشطة ، ومراقبه السلوكيات السوائل ، وتحليل أنشطتها ، وتميز استجابتها لدرجه الحرارة.

  1. مراقبه المتتبعين.
    1. صوره العينة مع فاصل ثابت Δt باستخدام البروتين الفلوري الأخضر (gfp) الفلورية للتقاط حركه جزيئات التتبع.
      ملاحظه: يجب اختيار Δt للسماح بتعقب حركه التتبع. القيم Δt كبيره ، مثل 100 s ، يؤدي إلى فقدان مسارات التتبع ، في حين ان القيم Δt قصيرة ، مثل 0.1 s ، منع خوارزميه تتبع من الكشف عن حركه التتبع بين الإطارات. وينبغي ان العمل Δt تسمح الازاحه المقتفي بين الإطارات لتكون داخل ~ 9 بكسل. بالنسبة لمتتبعي التصوير المتحركين بمعدل 10 ميكرومتر/ثانيه باستخدام هدف 4x ، يوصي بان تكون Δt 1 – 5 ثانيه.
    2. حفظ الصور كملفات TIFF ، اسم الملفات استنادا إلى رقم الإطار ، وتخزينها في مجلد منفصل. هذه العمليات ضرورية لضمان ان الصور المكتسبة سيتم تحليلها بشكل صحيح مع البرنامج النصي MATLAB المقدمة (الخطوة 6.2.2).
  2. تتبع المتتبعين اعتماد برنامج التتبع التي وضعتها ouellette et al.50,51):
    1. قم بتنزيل برنامج التتبع من مختبر التعقيدات البيئية ، جامعه ستانفورد (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml). تاكد من ان كل ملف MATLAB في نفس المجلد.
    2. تتبع متتبعي المسارات باستخدام برنامج نصي MATLAB مخصص: particle_tracking. يقرا البرنامج النصي صور التتبع (الخطوة 6.1) ويتتبع حركه التتبع باستخدام برنامج ouellette et al.50,51. فانه إخراج ملفين: 1) الخلفية. tif ، والتي تمثل خلفيه الصورة ، و 2) تتبع. حصيره ، التي تحتوي علي مسارات الجسيمات والسرعات في كل اطار (الشكل 4ا).
  3. تحليل متوسط التتبع سرعات باستخدام النصي MATLAB مخصصه: تحليل. م. يقرا البرنامج النصي ملف التتبع (تتبع حصيره) والمخرجات متوسط سرعه القصبات مقابل الوقت ، جنبا إلى جنب مع متوسط الوقت يعني سرعه مع المتوسط المحدد ويندوز (الشكل 4ب)33.
  4. تسجيل سرعه متوسط متوسط الوقت.
  5. قياس المتوسط الزمني متوسط السرعة عن طريق تكرار التجربة (الخطوات 4 ، 5.2 و 6.1-6.4) في 10-40 درجه مئوية. استخدم السرعات المتوسطة المسجلة لرسم متوسط السرعة مقابل درجه الحرارة (الشكل 4ج)33.

النتائج

ويتطلب اعداد السوائل النشطة المستندة إلى المحركات التي تعتمد علي الطن المتري كلا من كينيسن و MTs. تم بلمره MTs من الأنابيب المسمية (الخطوات 1.3 و 1.4) التي تم تنقيتها من أدمغه الأبقار (الخطوة 1.1 ، الشكل 2ا) ، تليها أعاده التدوير لتعزيز النقاء (الخطوة 1.2 ، الشكل 2

Discussion

السيطرة علي المادة النشطة في الموقع يفتح الباب لتنظيم الذاتي الموجهة من المواد النشطة4,5,24,28,54. في هذه المقالة ، ونحن نقدم بروتوكول لاستخدام درجه الحرارة للسيطرة علي kinesin يحركها ، والسوائل النشطة القا?...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

Plasmid K401-BCCP-H6 كان هديه من الدكتور Zvonimir Dogic. تم دعم هذا البحث من قبل الدكتور كون-تا وو صندوق البدء في معهد البوليتكنيك وستر. نشكر الدكتور Zvonimir Dogic علي البروتوكولات لتنقيه وتسميه الأنابيب وتوليف السوائل النشطة. نحن ممتنون للدكتور مارك ريدلا علي خبرته في التعبير عن البروتين وتنقيته. نشكر الدكتور وليام بنيامين روجر لمساعدتنا في بناء المرحلة التي تسيطر عليها درجه الحرارة. ونحن نعترف برديس MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) لاستخدام مرفق المواد البيولوجية (BMF). ونحن نعترف الجمعية الملكية للكيمياء لتكييف الأرقام من بات وآخرون علي لينه المسالة33.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acidSigma-Aldrich238813Trolox
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603HACH2074038Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, sapphire windowEdmund Optics43-637Sapphire disc
3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551R.S. HUGHES054007-27551Copper tape
Acetic AcidSigma-AldrichA6283
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1402-1
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrateSigma-AldrichA8937ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)Thermo Fisher ScientificA20006Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter UnitSigma-AldrichUFC801024Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa
Ammonium Persulfate, 100g, MP BiomedicalsFisher ScientificICN802829APS
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1760Ampicillin
Antivibration TableNikon63-7590S
Avanti J-E CentrifugeBeckman Coulter369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD DiagnosticsVWR90000-760Agar
BiotinAlfa AesarA14207
Bucket-plastic white - 2 gallonBon84-715Water bucket
Calcium ChlorideSigma-Aldrich746495CaCl2
Catalase from bovine liverSigma-AldrichC40
CFI Plan Apo Lambda 4x ObjNikonMRD000454x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero ShiftNikon96372GFP filter cube
CH-109-1.4-1.5TE TechnologyCH-109-1.4-1.5Thermoelectric Cooler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS OrganicsFisher ScientificC0378
Cooling blockN/AN/ACustom milled aluminum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400Bio-Rad1610400Triphenylmethane dye
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7528
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificD128DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS OrganicsFisher ScientificAC165680050DTT
DOWSIL 340 Heat Sink CompoundDow1446622Thermal paste
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBEPharmco by Greenfield Global111000200CB05Ethanol
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acidSigma-AldrichE3889EGTA
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-Aldrich798681EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: TryptoneFisher ScientificBP1421Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast ExtractFisher ScientificBP1422Yeast extract
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µmPolysciences18861Tracer particles
Glucose Oxidase from Aspergillus nigerSigma-AldrichG2133
GlycerolSigma-AldrichG5516
GpCppJena BioscienceNU-405LGuanosine-5'[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home TheaterAmazonB07428NBCWCopper wire
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrateSigma-AldrichG8877GTP
Hellmanex IIISigma-AldrichZ805939Detergent
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP410NaHEPES
High performance blender machineAIMORESAS-UP1250Blender
His GraviTrapGE Healthcare11003399Gravity Column
ImidazoleSigma-AldrichI5513
IPTGSigma-AldrichI6758Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Isopropyl Alcohol 99%Pharmco by Greenfield Global231000099Isopropanol
JA-10 rotorBeckman Coulter369687
L-Glutamic acid potassium salt monohydrateSigma-AldrichG1501K-Glutamate
Lysozyme from chicken egg whiteSigma-AldrichL6876
Magnesium chloride hexahydrateSigma-AldrichM2670MgCl2•6H2O
MES sodium saltSigma-AldrichM50572-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt
MOPSSigma-AldrichM12543-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MP-3022TE TechnologyMP-3022Thermocouple
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC138450500TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS SpectrophotometerThermo Fisher ScientificE112352Spectrometer
Nikon Ti2-E Nikon Inverted MicroscopeNikonMEA54000
Norland Optical Adhesive 81Norland ProductsNOA81UV glue
Novex Sharp Pre-stained Protein StandardThermo Fisher ScientificLC5800Protein standard ladder
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-wellThermo Fisher ScientificNP0335BOXSDS gel
Optima L-90K UltracentrifugeBeckman Coulter365672
Parafilm PM996 Wrap , 4" Wide; 125 Ft/RollCole-ParmerEW-06720-40Wax film
Pe 300 ultra Illumination System Single
Band , 3mm Light Guide control Pod
power supply		NikonPE-300-UT-L-SB-40Cool LED Illuminator
Phenylmethanesulfonyl fluorideSigma-Aldrich78830PMSF
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99%BeanTown Chemical129745PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23200
Pierce Protease Inhibitor Mini TabletsThermo Fisher ScientificA32953
PIPESSigma-AldrichP67571,4-Piperazinediethanesulfonic acid
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443
Poly(ethylene glycol)Sigma-Aldrich81300PEG. Average molecular weight 20,000 Da
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificP250-500KOH
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC)ThermoFisher ScientificPS0300DC power supply of the gel box
PS-12-8.4ATE TechnologyPS-12-8.4ADC power supply of the temperature controller
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscleSigma-AldrichP-0294PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per HourAmazonB005JWA612Fish tank pump
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - NovagenMillipore Sigma71403Competent cells
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless SteelAmazonB01MT6JZMRMicrowave for boiling the water
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificS271-500NaCl
Sodium dodecyl sulfateSigma-AldrichL3771SDS
Sodium phosphate monobasicSigma-AldrichS8282NaH2PO4
Streptavidin ProteinThermo Fisher Scientific21122
SucroseSigma-AldrichS7903
TC-720TE TechnologyTC-720Temperature controller
Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - CalbiochemSigma-Aldrich648310Tris-HCL
Type 45 Ti rotorBeckman Coulter339160
Type 70 Ti rotorBeckman Coulter337922
Type 70.1 Ti rotorBeckman Coulter342184
VWR General-Purpose Laboratory Labeling TapeVWR89097-916Paper tapes
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2VWR48366-227Glass coverslips
VWR Plain and Frosted Micro Slides, PremiumVWR75799-268Glass slides
XCell SureLock Mini-CellThermoFisher ScientificEI0001Gel box
ZYLA 5.5 USB3.0 CameraNikonZYLA5.5-USB3Monochrome CCD camera

References

  1. Wioland, H., Lushi, E., Goldstein, R. E. Directed Collective Motion of Bacteria under Channel Confinement. New Journal of Physics. 18 (7), 075002 (2016).
  2. Wioland, H., Woodhouse, F. G., Dunkel, J., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Confinement Stabilizes a Bacterial Suspension into a Spiral Vortex. Physical Review Letters. 110 (26), 268102 (2013).
  3. Buhl, J., et al. From Disorder to Order in Marching Locusts. Science. 312 (5778), 1402-1406 (2006).
  4. Aubret, A., Youssef, M., Sacanna, S., Palacci, J. Targeted Assembly and Synchronization of Self-Spinning Microgears. Nature Physics. 14, 1114 (2018).
  5. Driscoll, M., et al. Unstable Fronts and Motile Structures Formed by Microrollers. Nature Physics. 13 (4), 375 (2017).
  6. Bricard, A., et al. Emergent Vortices in Populations of Colloidal Rollers. Nature Communications. 6, 7470 (2015).
  7. Kumar, N., Soni, H., Ramaswamy, S., Sood, A. K. Flocking at a Distance in Active Granular Matter. Nature Communications. 5, 4688 (2014).
  8. Farhadi, L., Fermino Do Rosario, C., Debold, E. P., Baskaran, A., Ross, J. L. Active Self-Organization of Actin-Microtubule Composite Self-Propelled Rods. Frontiers in Physics. 6 (75), 1 (2018).
  9. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar Patterns of Driven Filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  10. Keber, F. C., et al. Topology and Dynamics of Active Nematic Vesicles. Science. 345 (6201), 1135-1139 (2014).
  11. Doostmohammadi, A., Ignés-Mullol, J., Yeomans, J. M., Sagués, F. Active Nematics. Nature Communications. 9 (1), 3246 (2018).
  12. Wensink, H. H., et al. Meso-Scale Turbulence in Living Fluids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14308-14313 (2012).
  13. Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Coherent Motion of Dense Active Matter. The European Physical Journal Special Topics. 227 (17), 2401-2411 (2019).
  14. Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8 (1), 564 (2017).
  15. Maryshev, I., Goryachev, A. B., Marenduzzo, D., Morozov, A. Dry active turbulence in microtubule-motor mixtures. arXiv preprint. , (2018).
  16. Nishiguchi, D., Aranson, I. S., Snezhko, A., Sokolov, A. Engineering bacterial vortex lattice via direct laser lithography. Nature Communications. 9 (1), 4486 (2018).
  17. Shendruk, T. N., Thijssen, K., Yeomans, J. M., Doostmohammadi, A. Twist-induced crossover from two-dimensional to three-dimensional turbulence in active nematics. Physical Review E. 98 (1), 010601 (2018).
  18. Urzay, J., Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Multi-scale statistics of turbulence motorized by active matter. Journal of Fluid Mechanics. 822, 762-773 (2017).
  19. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous Motion in Hierarchically Assembled Active Matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  20. Wu, K. T., et al. Transition from Turbulent to Coherent Flows in Confined Three-Dimensional Active Fluids. Science. 355 (6331), (2017).
  21. Hess, H., et al. Molecular shuttles operating undercover: A new photolithographic approach for the fabrication of structured surfaces supporting directed motility. Nano Letters. 3 (12), 1651-1655 (2003).
  22. Aoyama, S., Shimoike, M., Hiratsuka, Y. Self-organized optical device driven by motor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16408-16413 (2013).
  23. Nicolau, D. V., et al. Parallel computation with molecular-motor-propelled agents in nanofabricated networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2591-2596 (2016).
  24. Palacci, J., Sacanna, S., Steinberg, A. P., Pine, D. J., Chaikin, P. M. Living Crystals of Light-Activated Colloidal Surfers. Science. 339 (6122), 936-940 (2013).
  25. Morin, A., Bartolo, D. Flowing Active Liquids in a Pipe: Hysteretic Response of Polar Flocks to External Fields. Physical Review X. 8 (2), 021037 (2018).
  26. Lakkaraju, S. K., Hwang, W. Critical Buckling Length versus Persistence Length: What Governs Biofilament Conformation. Physical Review Letters. 102 (11), 118102 (2009).
  27. Henkin, G., DeCamp, S. J., Chen, D. T. N., Sanchez, T., Dogic, Z. Tunable Dynamics of Microtubule-Based Active Isotropic Gels. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences. 372 (2029), 20140142 (2014).
  28. Ross, T. D., et al. Controlling Organization and Forces in Active Matter through Optically-Defined Boundaries. arXiv:1812.09418. , (2018).
  29. Böhm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466 (1), 59-62 (2000).
  30. Anson, M. Temperature dependence and arrhenius activation energy of F-actin velocity generated in vitro by skeletal myosin. Journal of Molecular Biology. 224 (4), 1029-1038 (1992).
  31. Hong, W., Takshak, A., Osunbayo, O., Kunwar, A., Vershinin, M. The Effect of Temperature on Microtubule-Based Transport by Cytoplasmic Dynein and Kinesin-1 Motors. Biophysical Journal. 111 (6), 1287-1294 (2016).
  32. Kawaguchi, K., Ishiwata, S. I. Thermal activation of single kinesin molecules with temperature pulse microscopy. Cell Motility. 49 (1), 41-47 (2001).
  33. Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Collective Dynamics of Microtubule-Based 3D Active Fluids from Single Microtubules. Soft Matter. 15 (25), 5006-5016 (2019).
  34. Tucker, R., et al. Temperature Compensation for Hybrid Devices: Kinesin's Km is Temperature Independent. Small. 5 (11), 1279-1282 (2009).
  35. Collee, J. G., Bradley, R., Liberski, P. P. Variant CJD (vCJD) and bovine spongiform encephalopathy (BSE): 10 and 20 years on: part 2. Folia Neuropathologica. 44 (2), 102 (2006).
  36. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  37. Swinehart, D. The Beer-Lambert law. Journal of Chemical Education. 39 (7), 333 (1962).
  38. Ashford, A. J., Andersen, S. S., Hyman, A. A. Preparation of tubulin from bovine brain. Cell biology: A laboratory handbook. 2, 205-212 (1998).
  39. Hyman, A., et al. . Methods in Enzymology. 196, 478-485 (1999).
  40. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  41. Spriestersbach, A., Kubicek, J., Schäfer, F., Block, H., Maertens, B., Lorsch, J. R. . Methods in enzymology. 559, 1-15 (2015).
  42. Subramanian, R., Gelles, J. Two Distinct Modes of Processive Kinesin Movement in Mixtures of ATP and AMP-PNP. The Journal of General Physiology. 130 (5), 445-455 (2007).
  43. Gasteiger, E., et al. . The proteomics protocols handbook. , 571-607 (2005).
  44. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
  45. Lau, A. W. C., Prasad, A., Dogic, Z. Condensation of isolated semi-flexible filaments driven by depletion interactions. Europhysics Letters. 87 (4), 48006 (2009).
  46. Chandrakar, P., et al. Microtubule-Based Active Fluids with Improved Lifetime, Temporal Stability and Miscibility with Passive Soft Materials. arXiv:1811.05026. , (2018).
  47. Lowensohn, J., Oyarzún, B., Paliza, G. N., Mognetti, B. M., Rogers, W. B. Linker-mediated phase behavior of DNA-coated colloids. arXiv:1902.08883. , (2019).
  48. Wu, K. T., et al. Polygamous Particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18731-18736 (2012).
  49. Wu, K. T., et al. Kinetics of DNA-Coated Sticky Particles. Physical Review E. 88 (2), 022304 (2013).
  50. Ouellette, N. T., Xu, H., Bodenschatz, E. A quantitative study of three-dimensional Lagrangian particle tracking algorithms. Experiments in Fluids. 40 (2), 301-313 (2005).
  51. Kelley, D. H., Ouellette, N. T. Using particle tracking to measure flow instabilities in an undergraduate laboratory experiment. American Journal of Physics. 79 (3), 267-273 (2011).
  52. Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit Interactions in Dimeric Kinesin Heavy Chain Derivatives That Lack the Kinesin Rod. Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
  53. Aström, K. J., Murray, R. M. . Feedback systems: an introduction for scientists and engineers. , (2011).
  54. Soni, V., et al. The free surface of a colloidal chiral fluid: waves and instabilities from odd stress and Hall viscosity. arXiv:1812.09990. , (2018).
  55. Harvey, M. Precision Temperature-Controlled Water Bath. Review of Scientific Instruments. 39 (1), 13-18 (1968).
  56. Beuchat, L. R. Influence of Water Activity on Growth, Metabolic Activities and Survival of Yeasts and Molds. Journal of Food Protection. 46 (2), 135-141 (1983).
  57. Block, S. S. . Disinnfection, sterilization, annd preservation. , (2001).
  58. Schumb, W. C., Satterfield, C. N., Wentworth, R. L. . Hydrogen peroxide. , (1955).
  59. Simmons, G. F., Smilanick, J. L., John, S., Margosan, D. A. Reduction of Microbial Populations on Prunes by Vapor-Phase Hydrogen Peroxide. Journal of Food Protection. 60 (2), 188-191 (1997).
  60. Shimoboji, T., Larenas, E., Fowler, T., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Temperature-induced switching of enzyme activity with smart polymer-enzyme conjugates. Bioconjugate chemistry. 14 (3), 517-525 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

153 kinesin Arrhenius

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved