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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare la temperatura per controllare le velocità di flusso dei fluidi attivi tridimensionali. Il vantaggio di questo metodo non solo consente di regolare le velocità di flusso in situ, ma consente anche il controllo dinamico, ad esempio l'ottimizzazione periodica delle velocità di flusso verso l'alto e verso il basso.

Abstract

Presentiamo un metodo per utilizzare la temperatura per ottimizzare le velocità di flusso dei fluidi attivi tridimensionali (3D) basati sulla kinesina e basati su microtubuli. Questo metodo consente di regolare le velocità in situ senza la necessità di produrre nuovi campioni per raggiungere diverse velocità desiderate. Inoltre, questo metodo consente il controllo dinamico della velocità. In bicicletta la temperatura porta i fluidi a fluire veloce e lento, periodicamente. Questa controllabilità si basa sulla caratteristica di Arrhenius della reazione kinesina-microtubule, dimostrando un intervallo di velocità di flusso medio controllato di 4-8 sm/s. Il metodo presentato aprirà la porta alla progettazione di dispositivi microfluidici in cui le portate nel canale sono localmente regolabili senza la necessità di una valvola.

Introduzione

La materia attiva è differenziata dalla materia passiva convenzionale a causa della sua capacità di convertire l'energia chimica in lavoro meccanico. Un materiale che possiede tale capacità può consistere in entità viventi o non viventi come batteri, insetti, colloidi, cereali e filamenti citoscheletrici1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Queste entità materiali interagiscono con i rispettivi vicini. Su scala più ampia, si auto-organizzano in vortici turbolenti (turbolenza attiva) o flussi di materiale11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. La comprensione dell'auto-organizzazione della materia attiva ha portato a varie applicazioni in navette molecolari, dispositivi ottici e calcolo parallelo21,22,23. Per portare le applicazioni al livello successivo richiede un controllo al di là dell'auto-organizzazione. Ad esempio, Palacci e altri hanno sviluppato un colloide incapsulato di ematite che si è autopropulso solo se esposto alla luce blu controllata manualmente, che ha portato alla comparsa di cristalli viventi24. Morin ealtri stabilì il controllo dei colloidi Quincke rotolanti utilizzando un campo elettrico esterno regolabile, con conseguente affollamento colloidale in un canale 25 simile a uncircuito. Questi lavori precedenti dimostrano il ruolo del controllo locale nelle applicazioni e migliorano la base di conoscenze della materia attiva.

In questo articolo, ci concentriamo sulla controllabilità dei fluidi attivi 3D basati su microtubuli (MT) basati sulla kinesina. I fluidi sono costituiti da tre componenti principali: MT, motori molecolari di chinasina e impoveritori. Gli esaurienti inducono una forza di esaurimento per impacchettare le MT, che vengono successivamente colmeggiate da cluster motori. Questi motori camminano lungo l'MTsverso l'estremità più. Quando una coppia di MTsis pontianti antiparallela, i motori corrispondenti camminano in direzioni opposte. Tuttavia, i motori sono legati in un cluster e non sono in grado di camminare a parte, in modo da scivolare in modo cooperativo coppie di MT (interfilamento scorrevole, Figura 1A). Queste dinamiche scorrevoli si accumulano, causando fasci di MT per estendere fino a raggiungere il loro punto di instabilità deformazione e rottura (fasci estensivi, Figura 1B)26. I fasci rotti sono anneriti dalla forza di esaurimento, che successivamente si estende di nuovo, e le dinamiche si ripetono. Durante il processo della dinamica di ripetizione, i movimenti del fascio mescolano il liquido vicino, inducendo flussi che possono essere visualizzati doping con traccianti in scala micron(Figura 1C). Sanchez et al. e Henkin et al. hanno caratterizzato le velocità medi dei traccianti, scoprendo che le velocità erano regolabili variando le concentrazioni di adenosina tripfofoso (ATP), impoverimenti, gruppi motori, e MT19,27. Tuttavia, tale sintunabilità esisteva solo prima della sintesi del fluido attivo. Dopo la sintesi, la sintonificabilità è stata persa e i fluidi si sono auto-organizzati a modo loro. Per controllare l'attività dei fluidi attivi dopo la sintesi, Ross.et al. ha riportato un metodo utilizzando la dimerizzazione attivata dalla luce delle proteine motorie, consentendo di attivare e disattivare l'attività del fluido utilizzando la luce28. Mentre il controllo della luce è conveniente in termini di attivazione locale dei fluidi, il metodo richiede di riprogettare le strutture delle proteine motorie, insieme a modificare i percorsi ottici in un microscopio. Qui, forniamo un metodo facile da usare per controllare localmente i flussi fluidi senza modifica del microscopio, mantenendo intatta la struttura motoria.

Il nostro metodo di sintonizzazione locale del flusso di fluido attivo si basa sulla legge Arrhenius perché la reazione kinesin-MT è stata segnalata per aumentare con temperatura29,30,31,32. I nostri studi precedenti hanno dimostrato che la dipendenza dalla temperatura della velocità media di un flusso di fluido attivo ha seguito l'equazione di Arrhenius: v - A exp(-Ea/RT), dove A è un fattore pre-esponenziale, R è la costante di gas, Ea è l'energia di attivazione e T è la temperatura del sistema33. Pertanto, l'attività del fluido è sensibile all'ambiente di temperatura e la temperatura del sistema deve essere costante per stabilizzare le prestazioni del motore e, di conseguenza, la velocità di flusso del fluido34. In questo articolo, dimostriamo l'uso della dipendenza dalla temperatura del motore per ottimizzare continuamente le velocità di flusso dei fluidi attivi regolando la temperatura del sistema. Dimostriamo anche la preparazione di un campione di fluido attivo, seguito dal montaggio del campione in una fase del microscopio la cui temperatura è controllata tramite software per computer. L'aumento della temperatura da 16 a 36 gradi centigradi accelera la velocità media di flusso da 4 a 8 m/s. Inoltre, la sintonabilità è reversibile: aumentando ripetutamente e diminuendo la temperatura in sequenza accelera e decelera il flusso. Il metodo dimostrato è applicabile a una vasta gamma di sistemi in cui le principali reazioni obbediscono alla legge Arrhenius, come l'analisi MT che scivola29,30,31,32.

Protocollo

1. Preparazione delle MT

AVVISO: In questo passaggio purifichiamo le tubuline dal tessuto cerebrale bovino. Cervello bovino può causare variante malattia di Creutzfeldt-Jakob (vCJD)35. Pertanto, i rifiuti cerebrali e le relative soluzioni, bottiglie e punte di pipette dovrebbero essere raccolti in un sacchetto di rifiuti organici e smaltiti come rifiuti biopericolosi secondo le regole dell'istituzione.

  1. Purificare le tubuline dal cervello bovino (modificato da Castoldi et al.36).
    1. Trasportare circa 1,5 kg di cervelli bovini freschi da un macello locale a una cella frigorifera universitaria. Durante il trasporto, conservare su ghiaccio i cervelli nel buffer di fosfato (20 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.2).
      NOTA: Per massimizzare la resa finale della tubulina, la quantità iniziale di tubulina funzionale nel tessuto cerebrale fresco è fondamentale. Cervelli più freschi contengono tubulina più funzionale. Per ottenere i cervelli più freschi dal macello, si consiglia di chiedere al macellaio di fornire cervelli dalle mucche macellaite più di recente. I cervelli non dovrebbero essere più vecchi di 3 h all'avvio della procedura, perché ridurre il tempo tra la macellazione e l'inizio della procedura produrrà rese migliori.
    2. Omogeneizzare e chiarire il cervello.
      1. Pulire il cervello utilizzando bisturi per tagliare i vasi sanguigni e tessuto connettivo in pezzi più piccoli e rimuoverli dal cervello a mano.
        NOTA: I cervelli puliti devono essere rosa.
      2. Immergere il tessuto cerebrale pulito in 1 L del buffer di depolimerizzazione (DB: 50 mM 2-(N-morpholino) acido etanonico, 1 mM CaCl2, pH 6,6) per chilogrammo di cervello.
      3. Omogeneizzare il cervello con un frullatore da cucina.
      4. Centrifugare la soluzione cerebrale omogeneizzata a 10.000 x g e 4 gradi centigradi per 150 min.
    3. Polimerizzare gli MT (prima polimerizzazione).
      1. Raccogliere e mescolare il supernatante con volumi uguali delle seguenti soluzioni a 37 : glicerolo, ad alta molarità PIPES buffer (HMPB: 1 M PIPES, 10 mM MgCl2, 20 mM etilene glycol-bis(-aminoehyl etere)-N,N,N',N'-----acido tenacetico [EGTA], pH 6.9)
      2. Aggiungere 1,5 mM ATP e 0,5 mM guanosine triposfato (GTP) alla miscela.
      3. Incubare il composto a 37 gradi centigradi per 1 h.
    4. Depolimerizzare gli MT (prima depolimerizzazione MT).
      1. Pellet MT centrifugando a 151.000 x g e 37 gradi centigradi per 30 min.
      2. Scartare supernatante e risospendere ogni pellet MT in 10 mL di 4 c.
      3. Incubare sul ghiaccio per 30 min.
      4. Agitare la miscela ogni 5 min con una punta di pipetta per evitare la sedimentazione MT.
        NOTA: La miscela deve essere libera in 30 min, indicando il completamento della depolimerizzazione MT.
    5. Polimerizzare gli MT (seconda polimerizzazione MT).
      1. Chiarire la soluzione centrifugando a 70.000 x g e 4 gradi centigradi per 30 min.
      2. Raccogliere e mescolare il supernatante con volumi uguali di 37 .C glicerol e HMPB.
      3. Aggiungere 1,5 mM ATP e 0,5 mM GTP alla miscela.
      4. Incubare la miscela a 37 gradi centigradi per 30 min.
    6. Ripetere il passaggio 1.1.4, sostituendo HMPB con Brinkley reassembly buffer (BRB) 80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8), seguito da chiarire la miscela deselezionata scanaverla a 79.000 x g e 4 gradi centigradi per 30 min.
    7. Raccogli il super-natante. Misura l'assorbimento di 280 nm con uno spettrometro. Determinare la concentrazione di tubulina utilizzando la legge Birra-Lambert (coefficiente di estinzione della tubulina: 1,15 (mg/mL)-1cm-1)37,38.
    8. Conservare la proteina a -80 gradi centigradi.
  2. Riciclare le tubuline (modificate da Castoldi et al.36).
    NOTA: Per migliorare la purezza della tubulina, la tubulina purificata viene polimerizzata e depolimerata di nuovo.
    1. Polimerizzare le MT mescolando la tubulina purificata (passaggio 1.1,7) con 500 m dithiothreitol (DTT) e 20 -M GTP, seguiti da 30 min di incubazione a 37 .
    2. Pellet le MT.
      1. Caricare 1 mL di cuscino glicerolo (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v/v glicerol, pH 6,8) nella parte inferiore di un tubo di centrifuga.
      2. Posare le MT polimerizzate sopra il cuscino.
      3. Centrifuga a 172.000 x g per 90 min a 37 gradi centigradi.
    3. Depolerare le MT.
      1. Rimuovere il supernatante e il cuscino.
      2. Risospendere ogni pellet MT in 150 : L di buffer 4 MT (M2B: 80 mM PIPES, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8).
      3. Incubare la miscela sul ghiaccio per 30 min.
      4. Agitare il composto con una punta di pipetta ogni 5 min. La miscela dovrebbe diventare chiara.
    4. Chiarire la miscela centrifugando a 172.000 x g e 4 gradi centigradi per 30 min.
    5. Raccogli il super-natante. Misurare la concentrazione proteica. Conservare a -80 gradi centigradi.
  3. Etichettare la tubulina con la tintura fluorescente39.
    1. Polimerizza le MT. Mescolare la tubulina purificata (passaggio 1.1.7) con 500 SM DTT e 16,7 -M GTP, e incubare la miscela a 37 gradi centigradi per 30 min.
    2. Pellet le MT.
      1. Collocare 1 mL di 37 gradi centigradi di cuscino ad alto pH (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v/v glicerolo, pH 8,6) in un tubo di centrifuga.
      2. Posare le MT polimerizzate sul cuscino.
      3. Centrifuga a 327.000 x g per 50 min a 37 gradi centigradi.
    3. Etichetta tubulina.
      1. Risospendere ogni pellet MT con 700 l un buffer di etichettatura di 37 M (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 40% v/v glicerol, pH 8,6).
      2. Mescolare le sospensioni con un eccesso di 10-20 molari di coloraria fluorescente di gran lunga rossa funzionalizzato con un ester succinimidyl.
      3. Incubare la miscela a 37 gradi centigradi per 30 min al buio per consentire alle MT di reagire con l'ester del coloranti fluorescente.
      4. Fermare la reazione di etichettatura saturando l'estere del colorante di sospensione con 50 mM K-glutammato, incubando per 5 min a 37 gradi centigradi.
    4. Pellet i MT etichettati: Ripetere la fase 1.3.2, sostituendo il cuscino ad alto pH con cuscino a basso pH (80 mM di tubi, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v/v glicerol, pH 6.8).
    5. Depolimerizzare le MT.
      1. Scartare il supernatante e il cuscino.
      2. Risospendere il pellet a 700 gradi l.l di 4 gradi centigradi M2B.
      3. Incubare le sospensioni sul ghiaccio.
      4. Agitare ogni 5 min con una punta di pipetta fino a quando la soluzione è chiara.
    6. Chiarire la soluzione chiarita con la centrifuga a 184.000 x g e 4 gradi centigradi per 35 min.
    7. Migliorare la purezza della soluzione di tubulina etichettata ripetendo i passaggi 1.2.1–1.2.4.
    8. Misurare la concentrazione di proteine e tinture fluorescenti. Utilizzare queste misurazioni per determinare la concentrazione di tubulina e le frazioni di tubulina etichettata, definite come il rapporto tra le concentrazioni di tintura fluorescente e la tubulina.
    9. Conservare la soluzione di tubulina etichettata a -80 gradi centigradi.
  4. Polimerizzare le MT (adottato da Sanchez et al.19):
    1. Mescolare la tubulina riciclata (passaggio 1.2.5) con la tubulina etichettata (passaggio 1.3.9) in un rapporto che produce una frazione di tubulina etichettata del 3%.
    2. Mescolare la miscela di tubulina 8 mg/mL con 1 mM DTT e 0,6 mM di guanosina-5'[(z, z)-metilino]trifosfato (GMPCPP), seguito da 30 min di incubazione a 37 gradi centigradi.
    3. Dopo l'incubazione, anneal le MTs a temperatura ambiente al buio per 6 h.
    4. Aliquota e conservare a -80 gradi centigradi.

2. Sintetizzare gli ammassi di kinesin

NOTA: I batteri esistono onnipresenti e possono crescere nei media e contaminare il processo di preparazione. Per prevenire la contaminazione, le azioni che coinvolgono il contatto con le colture cellulari (ad esempio, il pipettaggio) DEVONO essere eseguite vicino a una fiamma. Utensili come flaconi, pipette, punte di pipette, supporti e piastre DEVONO essere autoclaved prima dell'uso.

  1. Esprimere i motori kinesin in Escherichia coli40.
    1. Trasforma le celle.
      1. Pipetta 1 - L del plasmide K401-BCCP-H6 in 10 - L di cellule competenti.
      2. Incubare sul ghiaccio per 5 min.
      3. Scossa di calore a 42,5 gradi centigradi per 45 s.
      4. Incubare le cellule sul ghiaccio per 2 min per consentire il recupero.
      5. Mescolare le cellule con 300 litri di 2XYT senza antibiotici (5 g/L NaCl, 10 g/L di estratto di lievito, 16 g/L di tryptone).
      6. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi per 1 h.
        NOTA: se non specificato, il monitoraggio della crescita cellulare non è necessario durante l'incubazione.
    2. Supporti piastra inoculata.
      1. Stendere la coltura cellulare su una piastra 2XYT (10 g/L NaCl, 5 g/l di lievito, 10 g/L tryptone, 15 g/l di agar, 100 ampicillina g/mL, 25 g/mL di clautoramenico).
      2. Incubare la piastra a testa in giù a 37 gradi durante la notte.
    3. Inoculare i supporti liquidi.
      1. Dalla piastra notturna, raccogliere una colonia isolata con una punta di pipetta.
      2. Espellere la punta in un flacone contenente 50 mL di 2XYT.
      3. Incubare e scuotere i mezzi di coltura a 37 e 200 giri/min per 12-16 h.
    4. Espandere le celle.
      1. Mescolare 2,5 mL della coltura cellulare in 500 mL di 2XYT.
      2. Incubare e scuotere la coltura di 500 mL a 37 e 250 giri/mm per 3-6 h.
    5. Indurre l'espressione proteica.
      1. Durante l'incubazione, monitorare la crescita delle cellule misurando l'assorbimento a 600 nm, utilizzando 2XYT come riferimento. Misurare l'assorbimento ogni 60 min, fino a raggiungere OD600 - 0.3. Quindi misurare l'assorbimento ogni 30 min fino a raggiungere 0,5–0,6.
      2. Lasciare che le cellule crescano fino a raggiungere l'assorbimento600 - 0,5–0,6
      3. Aggiungete alla coltura cellulare 24 biotina g/mL e 1 mM di isopropile -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).
        NOTA: IPTG viene utilizzato per indurre l'espressione proteica dei motori della kinesina, che sono etichettati con proteina portaborse a biotina (BCCP) e sei istidine (H6). Il tag H6 viene utilizzato nel processo di purificazione (fase 2.2), mentre il BCCP si lega alle molecole di biotina aggiunte per biotinyilare i motori della cinesia espressi.
      4. Incubare e scuotere la coltura cellulare a 20 e 250 rpm per 12-20 h.
    6. Raccogliere le cellule centrifundo a 5.000 x g e 4 gradi centigradi per 10 min. Conservare i pellet cellulari a -80 gradi centigradi.
  2. Purificare la proteina motoria della cinesia (modificata da Spriestersbach et al.41):
    1. Sospendere il pellet cellulare (passaggio 2.1.6) con un volume uguale di buffer di lisi (50 mM PIPE, 4 mM MgCl2, 50 s ATP, 10 mM 2-mercaptoetanolo (-ME), 20 mM imidazole, pH 7.2), seguito dall'aggiunta di una compressa di inibitore proteasi, 2 mg di fluoruro fenilmethyl (PMSF) e 2 mg di lisita.
    2. Lisciviazione delle cellule con congelamento lampo in azoto liquido (LN) 3x e scongelare la miscela cellulare.
      NOTA: Dopo il lising, la miscela dovrebbe diventare viscosa.
    3. Chiarire la miscela di cellule lised centrifugando a 230.000 x g e 4 gradi centigradi per 30 min.
    4. Raccogliere il supernatante e fluire attraverso una colonna di gravità, seguito da lavare la colonna con 10 mL di lisi tampone.
      NOTA: Le proteine con tag H6, come kinesin K401-BCCP-H6, devono rimanere nella colonna.
    5. Eluare la proteina marcata con 5 mL di tampone di eluizione (50 mM PIPES, 4 mM MgCl2, 50 ATP, 500 mM imidazole, pH 7.2). Raccogliere il flow-through in sequenza in frazioni da 1 mL. Per determinare le frazioni contenenti proteine, mescolare 3 l di ogni frazione con 100 -L di colorante tripenylmethane. Le frazioni contenenti proteine dovrebbero diventare blu. Combinare queste frazioni e diluire di 5x con buffer di lisi.
    6. Concentrare la soluzione proteica.
      1. Caricare la soluzione in un tubo filtrante centrifugo.
      2. Centrifuga a 3.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
      3. Agitare delicatamente il tubo e centrifugare di nuovo fino a quando il volume della soluzione è di <3 mL.
    7. Misurare la concentrazione proteica con uno spettrometro (coefficiente di estinzione: 0,549 (mg/mL)-1cm-1)42,43. Diluire la proteina a 1 mg/mL aggiungendo il 35% di saccarosio w/v.
    8. Conservare a -80 gradi centigradi.
  3. Misurare le concentrazioni di kinesin con un gel di elettroforesi (modificato da Taylor et al.44).
    NOTA: Per misurare la concentrazione di cinesina con un gel di elettroforesi, la tubulina è una scala di concentrazione ideale a causa della sua elevata purezza e della sua concentrazione misurabile tramite uno spettrometro (Figura 2A)36.
    1. Preparare campioni di tubulina con concentrazioni di 0,25, 0,5, 0,75, 1,00 e 1,25 mg/mL. Mescolare 15 l di ogni campione di tubulina e di kinesina (passaggio 2.2,8) separatamente con 5 l di buffer campione (200 mM Tris-HCl, 8% solfato di solfato di sodio di sodio (SDS), 400 mM DTT, 0,2% blu bromofenolo, 40% glicerolo, pH 6,8) e incubare a 90 s C per 3 min.
    2. Preparare l'elettroforesi.
      1. Bloccare un gel per l'elettroforesi nella scatola del gel.
      2. Riempire la scatola con buffer in esecuzione (50 mM MOPS, 50 mM Tris base, 0.1% SDS, 1 mM di acido etilenediaminetraceacetica (EDTA), pH 7.7).
        NOTA: Assicurarsi che il livello del buffer sia superiore all'apertura superiore del gel.
    3. Caricare 10 L di proteine standard ladder, campioni di tubulina, e il campione di kinesina in pozzi separati e applicare 200 V attraverso il gel per 45 min.
    4. Colorazione del gel.
      1. Incubare e cullare il gel con una soluzione di macchia bollita (circa 95 gradi centigradi) con una soluzione di colorazione A (0,5 g/L di triphenylmethane, 10% v/v di acido acetico, 25% isopropanolo) per 5 min, quindi sciacquare il gel con acqua deionizzata (DI).
      2. Ripetere con le soluzioni di colorazione B (0,05 g/L di tripenylmethane, 10% v/v acetic acito acetico, 10% isopropanol), C (0,02 g/L triphenylmethane dye, 10% v acetica) e D (10% v/v acetica), in sequenza. Incubare e scuotere il gel in acqua DI durante la notte.
    5. Scansionare il gel. Convertire l'immagine gel in un'immagine in scala di grigi, seguita da un'inversione in bianco e nero e miglioramento del contrasto per rivelare bande proteiche luminose sullo sfondo nero.
    6. Misurare la luminosità di ogni banda sommando i valori dei pixel. Applicare l'adattamento lineare C , aB , dove B è la luminosità di una banda di tubulina, C è la concentrazione corrispondente e a e b sono parametri di raccordo. Determinare la concentrazione di kinesin Ck utilizzando la luminosità della banda kinesinB kper calcolare l'equazione lineare: Ck
  4. Ammassare i motori kinesin.
    1. Mescolare la kinesina 1,5 M (passaggio 2,2,8) con 120 M DTT e 120 nM streptavidin. Incubare sul ghiaccio per 30 min.
    2. Conservare a -80 gradi centigradi.

3. Preparare vetrini e copricapi in vetro rivestiti in poliacrilammide (modificati da Lau et al.45)

  1. Caricare nuovi vetrini di vetro e coperture di vetrolips in contenitori corrispondenti. Immergere i vetrini e i copriletti in detersivo v/v dell'acqua DI e quindi far bollire l'acqua in un forno a microonde.
  2. Sonicare i vetrini e coprilabbra per 5 min e poi risciacquare con acqua DI per rimuovere il detersivo.
  3. Immergere e sonicare i vetrini e coprilabbra in etanolo per 5 min.
  4. Immergere e sonicare i vetrini e copriletti in idrossido di potassio 100 mM (KOH) per 5 min.
  5. Incubare i vetrini e i copriletti in una soluzione silane (1% di acido acetico e 0,5% 3-(trimethoxylyl)propyl methacrylate in etanolo) per 15 min e poi risciacquare con acqua DI.
  6. Incubare i vetrini e i copricapi in soluzione acrilamide (2% w/w acrilamide, 0,7 mg/mL persodatore di ammonio e 0,0035% v/v tetramethylelelediamine in acqua DI) per 3 h.
  7. Conservare i vetrini e i copricapi nella soluzione acrilammide.

4. Preparare fluidi attivi basati su MT guidati dalla kinesina

  1. Preparare i fluidi attivi (modificati da Sanchez et al.19).
    NOTA: i passaggi seguenti illustrano il processo di preparazione di 100 l-l di un fluido attivo utilizzando supporti di esempio. Il volume finale è scalabile e le concentrazioni degli stock di esempio possono essere rettificate fino a quando viene mantenuta la concentrazione finale di ciascun componente.
    1. Mescolare 16,7 L di 8 mg/mL Di MT (passaggio 1,4,4) con 6,7 -L di 1,8 M di cluster di motori di kinesina (passaggio 2.4.2) e 1,1 L di 500 mM DTT in M2B ad alto sale (M2B - 3,9 m MgCl2).
    2. Inbundle MT con l'aggiunta di 11,4 L del 7% w/w polietilene glicole (PEG).
    3. Attivare i motori kinesin sommando 2,8 litri di 50 mM ATP.
    4. Mantenere le concentrazioni di ATP aggiungendo 2,8 l- di dehydrogenasi/lacrate di pisofato di pisello (PEP) e 13,3 - L di 200 mM di piratrae fosfenolo (PEP).
    5. Riduci l'effetto fotosbiancante aggiungendo 10 -L di 20 mM Trolox, 1,1 litri di catalasi da 3,5 mg/mL, 1,1 l di 20 mg/mL di glucosio ossidase e 1,1 l di 300 mg/mL di glucosio.
    6. Tracciare il movimento del fluido aggiungendo 1,6 - L di 0,025% di particelle tracciante v/v.
    7. Aggiungere M2B ad alto sale per ottenere un volume totale di 100 l.
      NOTA: gli ordini di miscelazione nei passaggi da 4.1.1 a 4.1.6 sono intercambiabili. Tuttavia, una volta che ATP, MT e motori sono mescolati, i motori iniziano a consumare ATP mentre passo lungo le MT. Il campione viene attivato con una durata limitata a causa dei combustibili limitati (ATP e PEP), quindi l'esperimento deve essere avviato prontamente. Il fluido attivo finale deve contenere 1,3 mg/mL MT, 120 nM kinesin cluster motori, 5,5 mM DTT, 0.8% w/w PEG, 1,4 mM ATP, 2.8% v/v PK/LDH, 27 mM PEP, 2 mM Trolox, 0.038 mg/mL catalasi, 0.22 mg/mL di ossidasi di glucosio, 3,3 mg/mL di glucosio e 0,0004% v/v colloid in-mB.
  2. Preparare un campione in un canale di flusso (modificato da Chandrakar et al.46):
    1. Sciacquare uno scivolo in vetro rivestito in poliacrilammide e un coperchio (passaggio 3.7) con acqua DI. Asciugare i bicchieri con aria pressurizzata. Posizionare su una superficie pulita e piana.
    2. Tagliare due strisce di pellicole di cera con una larghezza di 3 mm e la stessa lunghezza della vetrina di vetro (20 mm). Inserire le strisce tra la diapositiva e coverslip come distanziali dei canali.
    3. Aderire il vetro alla pellicola di cera mettendo il complesso di cera di vetro su una piastra calda di 80 gradi centigradi per sciogliere la cera. Durante la fusione, premere delicatamente il coperchio della copertina con una punta di pipetta per aderire uniformemente la pellicola di cera alle superfici vetrate. Dopo l'adesione, raffreddare il complesso di vetro a temperatura ambiente.
    4. Caricare i fluidi attivi (passaggio 4.1) sul canale di flusso. Sigillare il canale con colla UV.

5. Controllare la temperatura del campione

  1. Costruire un setup di controllo della temperatura (modificato da disegni in Lowensohn et al. e Wu et al.47,48,49).
    1. Preparare un blocco di raffreddamento in alluminio.
      1. Fresa una piastra di alluminio con dimensioni di circa 30 mm , 30 mm e 5 mm.
      2. Forare un canale interno attraverso la piastra (Figura 3A) e installare i raccordi del tubo flessibile alle estremità del canale.
      3. Agganciare ogni raccordo a un tubo dell'acqua.
      4. Collegare un tubo a una pompa di serbatoio di pesce in un serbatoio d'acqua mentre si estende l'altro tubo al serbatoio.
        NOTA: La pompa farà circolare l'acqua del serbatoio attraverso i canali interni in alluminio per mantenere la temperatura del blocco a temperatura approssimativamente ambiente.
    2. Collegare un dispositivo di raffreddamento termoelettrico (TEC) e un termosensore a un regolatore di temperatura. Collegare il controller a un computer utilizzando una porta USB (Figura 3B).
    3. Collegare il controller di temperatura a un alimentatore a corrente diretta (DC). Accendere il controller collegando l'alimentatore a una presa elettrica.
    4. Eseguire la configurazione iniziale del TEC seguendo la guida del produttore del controller. Testare l'output TEC. Si raccomanda di controllare il controller di temperatura tramite il software fornito dal produttore, consentendo la registrazione dei dati termosensoriali e una più facile manipolazione del controller di temperatura.
    5. Identificare i lati di riscaldamento e raffreddamento del TEC.
    6. Fissare il lato di raffreddamento del TEC sul blocco di raffreddamento (passaggio 5.1.1) utilizzando la pasta termica.
    7. Collegare un disco zaffiro al lato riscaldante del TEC utilizzando la pasta termica.
    8. La configurazione è completa. La superficie zaffiro e il termosensore possono contattare un campione per raffreddare e riscaldare il campione in base alla temperatura e alla temperatura di destinazione.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare il TEC e il blocco di raffreddamento per l'imaging dei campioni mediante microscopia a campo luminoso (Figura 3C).
  2. Utilizzare la configurazione del controllo della temperatura per controllare la temperatura del campione33.
    1. Montare il campione nella configurazione.
      1. Posizionare il campione di fluido attivo (passaggio 4.2.4) sulla superficie dello zaffiro con il lato scorrevole che contatta la superficie.
      2. Fissare lo scivolo di vetro con nastro adesivo.
      3. Attaccare il termosensore alla superficie dello scivolo di copertura utilizzando nastro adesivo di rame.
    2. Montare l'impostazione su uno stadio al microscopio con il lato coverslip rivolto verso gli obiettivi. Ad esempio, su un microscopio invertito, il lato coverslip dovrebbe essere rivolto verso il basso. Fissare l'installazione con nastro di carta e i morsetti aghi al microscopio, se applicabile.
      NOTA: La fase di temperatura presentata dovrebbe funzionare con microscopi comuni invertiti o verticali. Per garantire che la fase di temperatura non venga spostata durante l'esperimento, è meglio fissare la fase di temperatura allo stadio del microscopio con nastro adesivo.
    3. Controllare la temperatura del campione.
      1. Accendere il controller di temperatura e la pompa del serbatoio del pesce.
      2. Seguire la guida del produttore per impostare la temperatura di destinazione e attivare il controllo della temperatura. Il controller regolerà la potenza di riscaldamento o di raffreddamento in base alla temperatura di destinazione e alla temperatura del campione, come valutato dal termosensore.
    4. Registrare le temperature del campione.
      1. Seguire la guida del produttore per registrare i dati sulla temperatura del termosensore durante l'esperimento.
        NOTA: la temperatura del campione deve ora essere controllata dal controllore e registrata dal computer(Figura 3D).

6. Caratterizzare l'attività del fluido attivo (modificata dai metodi di Henkin et al. e Wu et al.20,27)

NOTA: le sezioni precedenti vengono utilizzate per preparare campioni di fluidi attivi (sezioni 1–4) e controllarne la temperatura (sezione 5). Per dimostrare l'uso della temperatura per controllare l'attività del fluido attivo, osservare i comportamenti dei fluidi, analizzare le loro attività e caratterizzare la loro risposta alla temperatura.

  1. Monitorare i traccianti.
    1. Immagine del campione con un intervallo costanteche usa la fluorescenza della proteina fluorescente verde (GFP) per catturare il movimento delle particelle traccianti.
      NOTA: è necessario scegliere l'opzioneT per consentire la tracciazione del movimento del tracciante. Valorit di grandi dimensioni, come 100 s, comportano la perdita delle traiettorie del tracciante, mentre brevi valoridi t, come 0,1 s, impediscono all'algoritmo di tracciamento di rilevare il movimento del tracciante tra i fotogrammi. Unvalore t di lavoro deve consentire allo spostamento del tracciante tra i fotogrammi di essere compreso tra 9 pixel. Per i traccianti di imaging che si muovono a 10 m/s utilizzando un obiettivo 4x, si consiglia di utilizzare lat di 1-5 s.
    2. Salvare le immagini come file TIFF, assegnare un nome ai file in base al numero di fotogramma e memorizzarle in una cartella separata. Questi processi sono necessari per garantire che le immagini acquisite vengano analizzate correttamente con lo script MATLAB fornito (passaggio 6.2.2).
  2. Traccia traccia che adottano il software di tracciamento sviluppato da Ouellette et al.50,51):
    1. Scarica il software di monitoraggio dall'Environmental Complexity Laboratory, Stanford University (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml). Assicurarsi che ogni file MATLAB si trova nella stessa cartella.
    2. Tracciare i traccianti utilizzando uno script MATLAB personalizzato: particle_tracking.m. Lo script legge le immagini del tracciante (passaggio 6.1) e tiene traccia del movimento dei traccianti utilizzando il software di Ouellette et al.50,51. Restituisce due file: 1) background.tif, che rappresenta lo sfondo dell'immagine, e 2) Tracking.mat, contenente le traiettorie e le velocità delle particelle in ogni fotogramma (Figura 4A).
  3. Analizzare le velocità medi di tracciamento utilizzando uno script MATLAB personalizzato: analysis.m. Lo script legge il file di rilevamento (Tracking.mat) e restituisce la velocità media dei traccianti rispetto al tempo, insieme a una velocità media media con le finestre medie specificate (Figura 4B)33.
  4. Registrare la velocità media media media del tempo.
  5. Misurare la velocità media media ripetendo l'esperimento (passaggi 4, 5.2 e 6,1–6,4) a 10-40 gradi centigradi. Utilizzare le velocità mediche registrate per tracciare la velocità media rispetto alla temperatura (Figura 4C)33.

Risultati

La preparazione dei fluidi attivi basati sulla kinesina e basati su MT richiede sia kinesin che MT. Le MT sono state polimerizzate dalle tubuline etichettate (passaggi 1.3 e 1.4) che sono state purificate dai cervelli bovini (passaggio 1.1, Figura 2A), seguiti dal riciclaggio per migliorare la purezza (passaggio 1.2, Figura 2B). Le proteine motorie della cinesia sono state espresse e purificate da E. coli (passaggi 2.1 ...

Discussione

Il controllo della materia attiva in situ apre la porta all'auto-organizzazione diretta della materia attiva4,5,24,28,54. In questo articolo, presentiamo un protocollo per l'utilizzo della temperatura per controllare i fluidi attivi guidati dalla chinesina, basati su MT in situ, in base alla caratteristica di Arrhenius del sistema29

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Plasmid K401-BCCP-H6 è stato un dono del Dr. Svonimir Dogic. Questa ricerca è stata sostenuta dal fondo start-up del Dr. Kun-Ta Wu nel Worcester Polytechnic Institute. Ringraziamo il Dr. vonimir Dogic per i protocolli per purificare ed etichettare la tubulina e per sintetizzare i fluidi attivi. Siamo grati al Dr. Marc Ridilla per la sua esperienza nell'espressione e purificazione delle proteine. Ringraziamo il dottor William Benjamin Roger per averci aiutato a costruire il palco a temperatura controllata. Riconosciamo Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) per l'uso dello strumento dei materiali biologici (BMF). Riconosciamo la Royal Society of Chemistry per l'adattamento delle figure di Bate et al. su Soft Matter33.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acidSigma-Aldrich238813Trolox
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603HACH2074038Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, sapphire windowEdmund Optics43-637Sapphire disc
3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551R.S. HUGHES054007-27551Copper tape
Acetic AcidSigma-AldrichA6283
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1402-1
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrateSigma-AldrichA8937ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)Thermo Fisher ScientificA20006Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter UnitSigma-AldrichUFC801024Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa
Ammonium Persulfate, 100g, MP BiomedicalsFisher ScientificICN802829APS
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1760Ampicillin
Antivibration TableNikon63-7590S
Avanti J-E CentrifugeBeckman Coulter369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD DiagnosticsVWR90000-760Agar
BiotinAlfa AesarA14207
Bucket-plastic white - 2 gallonBon84-715Water bucket
Calcium ChlorideSigma-Aldrich746495CaCl2
Catalase from bovine liverSigma-AldrichC40
CFI Plan Apo Lambda 4x ObjNikonMRD000454x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero ShiftNikon96372GFP filter cube
CH-109-1.4-1.5TE TechnologyCH-109-1.4-1.5Thermoelectric Cooler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS OrganicsFisher ScientificC0378
Cooling blockN/AN/ACustom milled aluminum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400Bio-Rad1610400Triphenylmethane dye
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7528
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificD128DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS OrganicsFisher ScientificAC165680050DTT
DOWSIL 340 Heat Sink CompoundDow1446622Thermal paste
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBEPharmco by Greenfield Global111000200CB05Ethanol
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acidSigma-AldrichE3889EGTA
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-Aldrich798681EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: TryptoneFisher ScientificBP1421Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast ExtractFisher ScientificBP1422Yeast extract
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µmPolysciences18861Tracer particles
Glucose Oxidase from Aspergillus nigerSigma-AldrichG2133
GlycerolSigma-AldrichG5516
GpCppJena BioscienceNU-405LGuanosine-5'[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home TheaterAmazonB07428NBCWCopper wire
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrateSigma-AldrichG8877GTP
Hellmanex IIISigma-AldrichZ805939Detergent
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP410NaHEPES
High performance blender machineAIMORESAS-UP1250Blender
His GraviTrapGE Healthcare11003399Gravity Column
ImidazoleSigma-AldrichI5513
IPTGSigma-AldrichI6758Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Isopropyl Alcohol 99%Pharmco by Greenfield Global231000099Isopropanol
JA-10 rotorBeckman Coulter369687
L-Glutamic acid potassium salt monohydrateSigma-AldrichG1501K-Glutamate
Lysozyme from chicken egg whiteSigma-AldrichL6876
Magnesium chloride hexahydrateSigma-AldrichM2670MgCl2•6H2O
MES sodium saltSigma-AldrichM50572-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt
MOPSSigma-AldrichM12543-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MP-3022TE TechnologyMP-3022Thermocouple
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC138450500TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS SpectrophotometerThermo Fisher ScientificE112352Spectrometer
Nikon Ti2-E Nikon Inverted MicroscopeNikonMEA54000
Norland Optical Adhesive 81Norland ProductsNOA81UV glue
Novex Sharp Pre-stained Protein StandardThermo Fisher ScientificLC5800Protein standard ladder
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-wellThermo Fisher ScientificNP0335BOXSDS gel
Optima L-90K UltracentrifugeBeckman Coulter365672
Parafilm PM996 Wrap , 4" Wide; 125 Ft/RollCole-ParmerEW-06720-40Wax film
Pe 300 ultra Illumination System Single
Band , 3mm Light Guide control Pod
power supply		NikonPE-300-UT-L-SB-40Cool LED Illuminator
Phenylmethanesulfonyl fluorideSigma-Aldrich78830PMSF
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99%BeanTown Chemical129745PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23200
Pierce Protease Inhibitor Mini TabletsThermo Fisher ScientificA32953
PIPESSigma-AldrichP67571,4-Piperazinediethanesulfonic acid
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443
Poly(ethylene glycol)Sigma-Aldrich81300PEG. Average molecular weight 20,000 Da
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificP250-500KOH
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC)ThermoFisher ScientificPS0300DC power supply of the gel box
PS-12-8.4ATE TechnologyPS-12-8.4ADC power supply of the temperature controller
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscleSigma-AldrichP-0294PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per HourAmazonB005JWA612Fish tank pump
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - NovagenMillipore Sigma71403Competent cells
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless SteelAmazonB01MT6JZMRMicrowave for boiling the water
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificS271-500NaCl
Sodium dodecyl sulfateSigma-AldrichL3771SDS
Sodium phosphate monobasicSigma-AldrichS8282NaH2PO4
Streptavidin ProteinThermo Fisher Scientific21122
SucroseSigma-AldrichS7903
TC-720TE TechnologyTC-720Temperature controller
Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - CalbiochemSigma-Aldrich648310Tris-HCL
Type 45 Ti rotorBeckman Coulter339160
Type 70 Ti rotorBeckman Coulter337922
Type 70.1 Ti rotorBeckman Coulter342184
VWR General-Purpose Laboratory Labeling TapeVWR89097-916Paper tapes
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2VWR48366-227Glass coverslips
VWR Plain and Frosted Micro Slides, PremiumVWR75799-268Glass slides
XCell SureLock Mini-CellThermoFisher ScientificEI0001Gel box
ZYLA 5.5 USB3.0 CameraNikonZYLA5.5-USB3Monochrome CCD camera

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