JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

غالبا ما تتطور المقاومة العلاج في المرضي الذين يعانون من سرطان البروستاتا المتقدمة ، وفي بعض الحالات ، يتطور السرطان إلى نوع فرعي قاتل يسمي سرطان البروستاتا الغدد الصماء العصبية. ومن شان تقييم التغييرات الجزيئية الصغيرة غير الترميز بوساطة الجيش النيبالي التي تسهل هذا التحول ان يسمح بتحسين التقسيم الطبقي للامراض وتحديد أليات السببية التي تؤدي إلى تطوير سرطان البروستاتا العصبي الهرموني.

Abstract

الاجتثاث من مستقبلات الاندروجين (AR) إشارات الحرمان من الاندروجين هو الهدف من الخط الأول من العلاج لسرطان البروستاتا الذي يؤدي في البداية إلى انحدار السرطان. ومع ذلك ، في عدد كبير من الحالات ، يتطور المرض إلى سرطان البروستاتا المتقدمة ، التي تقاوم التطهير (CRPC) ، والتي لديها خيارات علاجيه محدوده وغالبا ما تكون عدوانيه. ويلاحظ في الغالب الانبثاث البعيد في هذه المرحلة من المرض العدواني. يتم التعامل مع CRPC من قبل الجيل الثاني من مثبطات المسار AR التي تحسن البقاء علي قيد الحياة في البداية ، تليها ظهور المقاومة العلاج. سرطان البروستاتا العصبية (NEPC) هو البديل نادره من سرطان البروستاتا (PCa) التي غالبا ما تتطور نتيجة للمقاومة العلاج عن طريق عمليه التمايز المعروفة باسم التمايز الغدد الصماء (نيد) ، حيث الخلايا PCa الخضوع للتبديل النسب من سرطانات الغدد وإظهار زيادة التعبير عن علامات النسب الغدد الصماء العصبية (NE). بالاضافه إلى التعديلات الجينية التي تدفع التقدم والتمايز إلى NEPC ، وتعتبر العوامل الوراثية والعظة البيئية الصغيرة اللاعبين الأساسيين في القيادة تطور المرض. توفر هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا للتعرف علي المحركات الوراثية (اي RNAs الصغيرة غير الترميز) المرتبطة ب الانيسول الخماسي الكلور المتقدم. باستخدام تنقيه ميكرورناس من formalin-الثابتة البارافين-جزءا لا يتجزا من الانسجه المنتشرة (FFPE) والمقابلة المستمدة من المصل الحويصلات خارج الخلية (المركبات أليفه) ، يصف البروتوكول كيفيه اعداد المكتبات مع مراقبه الجودة المناسبة للتسلسل ميكرورناس من هذه المصادر عينه. عزل الجيش النيبالي الريبي من كل من FFPE والمركبات التي غالبا ما تكون صعبه لان معظمها اما المتدهورة أو محدوده في الكمية. سيتوسع هذا البروتوكول في أساليب مختلفه لتحسين مدخلات الحمض الريبي النيبالي ومكتبات cDNA لإنتاج القراءات الأكثر تحديدا والبيانات عاليه الجودة عند التسلسل.

Introduction

ويقود سرطان البروستاتا الاندروجين التي تعمل عن طريق الإشارات AR. ولذلك ، فان استهداف مسار AR هو العلاج الدعامةالاوليللمرض 1. ومع ذلك ، غالبا ما تستتبع المقاومة نتيجة للعلاجات المستهدفة ويتطور المرض إلى CRPC2المتقدمة المنتشرة. يتم التعامل مع crpc من قبل الجيل الثاني من العلاج AR الذي يتضمن enzalutamide و abiraterone2,3 مما يحسن البقاء علي قيد الحياة في البداية. ومع ذلك ، غالبا ما تظهر المتغيرات المميتة مثل NEPC في 25 − 30 ٪ من حالات CRPC المعالجة التي لديها خيارات العلاج المحدودة ، مما يؤدي إلى زيادة الوفاات3. ينشا nepc عن طريق عمليه التمايز عكسها المعروفة باسم نيد ، حيث الخلايا PCa الخضوع للتبديل النسب من الأورام اللحمية وإظهار انخفاض التعبير عن AR وزيادة التعبير عن علامات النسب NE بما في ذلك اينولاز 2 (ENO2) ، كروموغرانين a (chga) ، و سينابتوفيسين (SYP)4. النظر إلى ان هذه المتغيرات المقاومة تنشا نتيجة للتدخلات العلاجية ، فمن الضروري لفك المسارات التي تؤدي إلى توليد هذا القاتل ، من الصعب معالجه شكل من الانيسول الخماسي الكلور.

وقد فك رموز مؤخرا علم الجينوم من NEPC في دراسة شامله التي قام بها Beltran et al. حيث نسخ التعديلات الرقم ، والطفرات ، وتعدد الاشكال النيوكليوتيد واحد (SNPs) ، وتحليل الحمض النووي من الانسجه المنتشرة المستمدة من المريض وحللت5. علي الرغم من التقدم الكبير في فهم علم الجينوم من هذا الشكل العدواني من الانيسول الخماسي الكلور ، لا يعرف سوي القليل عن العوامل الوراثية ، بما في ذلك الصغيرة غير الترميز RNAs (ميكرورناس) التي تشارك في الانتقال من CRPC-adenسرطاني إلى NEPC. ميكرورناس (miRNAs) هي 22 bp طويلة ، التي تقطعت بها السبل المزدوجة RNAs التي تعمل في المقام الأول عن طريق قمع التعبير الجيني ما بعد الهيستونات عن طريق التفاعلات تسلسل محدده مع 3 '-المناطق غير المترجمة (UTRs) من الهدفين mRNA الأهداف6. وقد تم الآن تحديد العديد من oncomirs والمثبطات الأورام ، ودورها في تنظيم بداية المرض والانبثاثوقد درست بشكل جيد في مختلف أنواعالسرطان 6 ،7. هذه rnas الصغيرة غير الترميز غالبا ما تكون أهدافا هامه جدافي السيطرة علي الوفااتالمرض 6 ،8،9. وقد تركزت البحوث الحديثة أكثر علي فهم الآثار paracrine من miRNAs في الانبثاث السرطان عن طريق نقلها في المركبات الخاصة, مثل exosomes, ان تتدفق في مجري الدم والسماح للخلايا السرطانية لإرسال هذه الرسل الثانوية إلى مواقع المنتشر في بيئة خاليه من النيوداز10,11,12. المركبات التي تحمل miRNAs من الخلايا السرطانية لنقل اثار تحويل من الخلايا المضيفة12. يمكن تحديد المركبات التي الناقلات الثانوية من الخلايا السرطانية التالي تكون مفيده في الكشف عن خطورة المرض غير الغازية.

مير-1246 هو اوبريجولاتيد للغاية في المركبات الخاصة من PCa العدوانية ، ويشير إلى خطورة المرض13. هذه miRNAs المرتبطة EV ليس فقط بمثابه المؤشرات الحيوية غير الغازية للمرض ، ولكن أيضا لعب ادوار مهمة وظيفيا في القيادة tumorigenesis. التالي ، فانه من الضروري فهم اهميه ذخيرة ميرنا التي ترتبط باشكال مقاومه من الانيسول الخماسي الكلور للسماح بتحديد أفضل لمؤشرات الحيوية غير الغازية فضلا عن أهميتها الوظيفية.

وقد قدم ظهور تسلسل الجيل القادم المنصة الأكثر شمولا لدراسة تفاصيل الورم المناظر الطبيعية التي تنطوي علي تعديلات في الجينوم مثل الطفرات ، ونقل الكروموسومات ، chromothripsis ، وميثيل ، وكلها تسهم إلى حد كبير في شكل وطبيعة السرطان14،15،16. المثل ، بل هو أيضا أداه أساسيه لفهم التغيرات الجينية الواسعة التي تحدث في خليه الورم والتي غالبا ما تكون اللاعبين المهمين في شده المرض17. بهدف فهم ذخيرة ميرنا المرتبطة بجيل NEPC ، تم تنفيذ تسلسل الحمض الريبي النيبالي الصغيرة علي الانسجه CRPC المنتشرة FFPE والمركبات الخاصة المقابلة المصل المشتقة. [رنا] يستنتج من اي من هذا اثنان عينه مصادر (1) منخفضه في غله و (2) من نوعيه سيئه واجبه إلى الانحلال ان غالبا يحدث واجبه إلى [فورالين] تثبيت و [ف] عزل. وعلاوة علي ذلك ، إنشاء مكتبات cDNA هو خطوه حرجه ، ولكنها مرهقه ، من تسلسل التشغيل. وهكذا ، أساليب لعزل هذه RNAs واستخدامها لإنشاء مكتبات لتسلسل الحمض الريبي النيبالي الصغيرة تتطلب الأمثل لتوليد بيانات دقيقه وموثوقه.

هناك عده طرق لتعريف التعبير ميرنا في عينات مختلفه ، بما في ذلك RT-PCR ، ميكروصفائف ، والتهجين في الموقع (ISH). وقد نشر مؤخرا بروتوكول باستخدام الحمض الريبي الليفي المشتق من الانسجه FFPE لتقييم التعبير ميرنا من قبل RT-PCR و ISH18. أكثر التكنولوجيات الحديثة تقدم منصات أكثر شمولا وشامله لتنميط التعبير ميرنا في عينه. نانوسترينج nCounter يقدم منصة الكشف عن ميرنا الحساسة19، ولكن غالبا ما يقتصر الكشف عن طريق عدد mirnas التي تتوفر في الصفيف (~ 2,000). وفي مثل هذا السيناريو ، توفر منصة أكثر حساسية وشمولا مثل تسلسل الجيل التالي عمقا أوسع بكثير من تعريف ميرنا والتنميط المتزامن في عينات مختلفه20. وقد استخدمت هذه الطريقة لتحديد التواقيع ميرنا في البول أو البلازما من المرضي PCa21,22,23. في المقالة الحالية ، يتم تقديم بروتوكول لاستخدام منصة تسلسل الجيل القادم لدراسة ملامح ميرنا المرتبطة CRPC العدوانية باستخدام الانسجه FFPE والمستمدة من المصل EV RNAs.

Protocol

وقد أجريت هذه الدراسة وفقا للمبادئ الاخلاقيه للقاعدة المشتركة الامريكيه ووافقت عليها اللجنة المؤسسية للبحوث الانسانيه.

1. التشريح المجهري

ملاحظه: تم الحصول علي الانسجه CRPC المنتشرة FFPE مع ميزات السرطانات اللحمية (CRPC-Adeno) أو التمايز NE (CRPC-NE) من شبكه المستودع البيولوجي للسرطان البروستاتا (PCBN). وقد أعدت أقسام الانيسول الخماسي الكلور بعشره ميكرونات علي الشرائح الزجاجية من أجل التشريح المجهري اليدوي كما نوقش سابقا في18. لتلخيص موجز:

  1. الأقسام الانسجه عن طريق تمرغ الشرائح في اكسيلين (2x ، 10 دقيقه لكل منهما). ثم أعاده ترطيب الأقسام عن طريق احتضان الشرائح لمده 5 دقائق كل في الايثانول متدرج (100 ٪ ، 95 ٪ ، 90 ٪ ، 80 ٪ ، و 70 ٪) ، تليها غسل الماء المقطر وتلطيخ مع الهيوكسيلين (30 ق نقع).
  2. بعد تلطيخ الهيلوكسيلين ، وغسل الأجزاء الانسجه مع الماء. ثم ديهيدرات أقسام الانسجه عن طريق وضعها في الايثانول متدرج (70 ٪ ، 80 ٪ 90 ٪ ، 95 ٪ ، 100 ٪) (5 دقيقه لكل منهما) تليها اكسيلين (5 دقائق).
  3. حلل الشرائح المقابلة للدم واليوزين (H & E) للتعرف علي مناطق الأورام (اي الأورام السرطانية أو نيد) ووضع علامة علي هذه المناطق السرطانية والمناطق الطبيعية المجاورة بمساعده اخصائي امراض معتمد من قبل مجلس الاداره. باستخدام هذه الشرائح H & E كما خرائط الطريق ، وضع علامة علي الانسجه الملطخة بالدم التي تم الحصول عليها في الخطوة أعلاه للتمييز بين الورم والمناطق الطبيعية.
  4. تشريح الشريحة الانسجه ملحوظ بعناية تحت المجهر باستخدام شفره مشرط.
  5. جمع الانسجه تشريح من المناطق الطبيعية والسرطانية في أنابيب منفصلة باستخدام هلام مشحونة بالكهرباء نصائح ماصه التحميل. الطرف المشحون يجذب الانسجه التي تم تشريحها ويسمح بالشفاء الأقصى للانسجه بعد التشريح. بمجرد ان تلتصق الانسجه بالطرف المشحون ، اقطع الطرف إلى أنبوب جمع 2 مل فارغ.

2. عزل مصل المركبات التي تستمد

ملاحظه: عينات المصل المريض المجمدة التي تم جمعها من المرضي مع CRPC المنتشر مع خصائص السرطانات اللحمية (CRPC-adeno) أو التمايز NE (CRPC-NE) تم شراؤها من PCBN باستخدام بروتوكول الهجرة المعتمدة والمخزنة في-80 درجه مئوية قبل استخدامها. تم جمع عينات مصل من نفس المجموعة من المرضي مثل تلك المستخدمة للانسجه المجهرية للسماح المقارنة بين الانسجه المقابلة والمركبات التي تستمد المصل. تم استخدام كاشف العزلة EV المتاحة تجاريا لجمع المركبات التي.

  1. ذوبان عينات مصل المريض المجمد عند درجه حرارة 4 درجات مئوية.
  2. استخدم 110 μL من عينه مصل مذابه وتدور في 2,000 x g لمده 30 دقيقه.
  3. جمع ماده طافي للعزل EV/exosome اللاحقة وتجاهل بيليه الحطام. أضافه 30 μl من كاشف العزلة المصل exosome إلى ماده طافي واحتضان في 4 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
  4. تدور في 10,000 x g لمده 10 دقيقه جمع المصل EV المنضب بعناية دون إزعاج بيليه في أنبوب منفصل 1.5 mL وتخزين في-80 درجه مئوية للتحليل في المستقبل ، إذا لزم الأمر.
  5. أعاده تعليق بيليه EV في 70 μL من الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني) التي أعدت في المياه الخالية من النيوداز. الحفاظ علي قسامه لنظام تحليل تتبع الجسيمات لتقييم نوعيه وعدد الجزيئات. تخزين بقية العينة في-80 درجه مئوية حتى مزيد من التحليل.

3. الحمض الريبي النيبالي العزلة من ميكروتشريح البروستاتا الانسجه والمركبات

ملاحظه: تم عزل الحمض الريبي النيبالي الإجمالي من الانسجه الدقيقة والمركبات الدقيقة المنقية باستخدام مجموعه متاحه تجاريا (جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع بعض التعديلات. وتصف الفروع التالية هذه الإجراءات بإيجاز مع التركيز بوجه خاص علي الخطوات الهامه:

  1. عزل الحمض الريبي النيبالي من الانسجه المجهرية.
    1. أعاده تعليق الانسجه FFPE ميكروتشريح في 150 μL من المخزن المؤقت K بروتيداز. اخلطها بواسطة فورتيكنج والماصة من الانسجه المتبقية من الطرف. تدور في 11,000 x g لمده 1 دقيقه.
    2. أضافه 10 μL من بروتينياز K إلى بيليه. الانتظار لمده 2 دقيقه حتى بيليه يتحول الأبيض. الماصة للأعلى والأسفل عده مرات.
    3. احتضان في 56 درجه مئوية لمده 16 دقيقه. دوامه كل 3 دقائق.
    4. أزاله العينات والسماح للكتلة الحرارة تصل 80 درجه مئوية. احتضان العينات علي كتله لمده 16 دقيقه. دوامه كل 3 دقائق.
    5. احتضان علي الجليد لمده 3 دقائق.
    6. تدور في 20,000 x g لمده 15 دقيقه نقل ماده طافي إلى أنبوب 2 مل جديده.
    7. أضافه 16 μL من العازلة DNase الداعم تليها 10 μL من DNase I. مزيج من خلال عكس الأنبوب بلطف واحتضان في درجه حرارة الغرفة (RT) لمده 15 دقيقه.
    8. أضافه 320 μL من خليه الدم الحمراء (ربك) تحلل العازلة. مزيج من خلال عكس الأنبوب ومن ثم أضافه 1,120 μL من الايثانول 100 ٪. نقل علي الفور علي أعمده تدور المخزنة في 4 ° c. تدور في 8,000 x g لمده 30 ثانيه.
    9. غسل الاعمده 2x مع غسل العازلة وتدور الاعمده في 20,000 x g لمده 5 دقائق لأزاله المتبقية غسل المخزن المؤقت.
    10. السماح للعمود تدور إلى الهواء الجاف لمده 2 − 3 دقيقه ، ثم الوت مع 19 μl من المياه rnase خاليه. ثبت قيمه الحمض الريبي النيبالي المنقي علي مقياس طيفي وتطبيع العينة إلى 40 نانوغرام/μL.
  2. الحمض الريبي النيبالي العزلة من المركبات التي تستمد المصل.
    1. عزل الحمض الريبي النيبالي اللحمية باستخدام مجموعه. أضافه 75 μL من المخزن المؤقت تحلل A و 9.3 μL من تحلل المخزن المؤقت B إلى 50 μL من تعليق EV المنقي.
      ملاحظه: الحفاظ علي خلط العينة عن طريق عكس الأنبوب لمده 10 دقيقه للسماح تحلل كامله من المركبات الخاصة.
    2. أضافه 130 μL من الايثانول 100 ٪ وتخلط فورا عن طريق عكس العينة. نقل علي عمود تدور ثم تدور في 3,300 x g لمده دقيقه واحده.
    3. اغسل العمود 2x مع المخزن المؤقت للغسيل. تدور العمود في 1,300 x g لمده 3 دقائق لأزاله المخزن المؤقت للغسيل تماما.
    4. السماح للعمود إلى الهواء الجاف لمده 2 دقيقه. أضافه 18 μL من المخزن المؤقت الشطف إلى العمود والسماح لها الجلوس لمده 2 دقيقه. تدور في 400 x g لمده 1 دقيقه متبوعا بدوره ثانيه في 5,800 x g لمده 3 دقائق.
    5. كرر الخطوة 3-2 مع المخزن المؤقت الذي تم تضمينه في عده لزيادة العائد من الحمض الريبي النيبالي من العينة.
    6. تحديد كميه العينة علي مقياس طيفي وتطبيعها إلى 40 نانوغرام/μL.

4. اعداد المكتبة لتسلسل الحمض الريبي الصغير

ملاحظه: استعملت [رنا] صغيره مكتبه تحضير طقم (جدول المواد) كان ان يخلق [كدنا] مكتبات من ال يعزل [رنا] عينات. الخطوات اللازمة لإنشاء المكتبات ، وتنقيتها ، والتحقق من جودتها قبل التشغيل علي المنظم أمر حاسم لأي بروتوكول تسلسل لأنها في نهاية المطاف تحديد جوده بيانات الإخراج من التشغيل. لذلك ، المضي قدما بعناية مع كل خطوه. المبادئ التوجيهية من الشركة المصنعة تشير باستخدام الحد الأدنى من 50 ng من RNA. ونظرا لرداءه النوعية والكميات المنخفضة من مجموع الحمض الريبي النيبالي التي يتم الحصول عليها عاده من هذين المصدرين عينه ، يتم تحسين هذا البروتوكول لتركيزات RNA منخفضه كما 100 ng. البروتوكول أدناه للحصول علي عينه واحده من مكتبه.

  1. إنشاء محول-ligated cDNA.
    1. استخدام 5 μL من تطبيع (40 ng/μL) عينه RNA. أضافه 1 μL من 3 ' محول. سخن التدوير الحراري إلى 70 درجه مئوية قبل احتضان العينات. احتضان لمده 2 دقيقه نقل العينات علي الجليد علي الفور قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
    2. في أنبوب منفصل, مزيج 2 μL من العازلة الربط, 1 μL من مثبط RNase, و 1 μL من T4 الجيش النيبالي الريبي Ligase 2, متحولة الحذف. اخلطه بالأنابيب صعودا وهبوطا وأضافه 4 μL من هذا المزيج إلى أنبوب مع الحمض الريبي النيبالي/3 ' محول.
    3. نقل إلى الدورية الحرارية التي تم تسخينها إلى 28 درجه مئوية واحتضان لمده 1 ساعة.
    4. أضافه 1 μL من الحل وقف مع الحفاظ علي العينات علي كتله الحرارية. احتضان في 28 درجه مئوية لمده 15 دقيقه أخرى.
    5. أزاله الأنابيب والحفاظ علي الجليد مباشره بعد هذه الخطوة.
    6. في أنبوب منفصل ، أضافه 1 μL من 5 ' محول.
    7. نقل إلى الدورية الحرارية التي تم مسخن إلى 70 درجه مئوية واحتضان لمده 2 دقيقه.
    8. وضع علي الفور أنبوب علي الجليد لمنع أعاده الصلب من محولات.
    9. أضافه 1 μL من 10 ملم ATP إلى أنبوب محول 5 ' التحريف. امزجها بواسطة الأنابيب وأضف 1 μL من T4 الجيش النيبالي الريبي إلى المزيج. امزجها بواسطة الأنابيب وأضف 3 μL من هذا المزيج إلى الأنبوب الذي يحتوي علي الحمض الريبي الذي تم ربطه بالمحول 3. نقل علي الدورية الحرارية التي تم تسخينها إلى 28 درجه مئوية واحتضان لمده 1 ساعة.
    10. نقل علي الفور إلى الجليد واما المضي قدما في العينات أو تخزين في-20 درجه مئوية لاستخدامها في المستقبل.
    11. لأداء RT-PCR ، استخدم 6 μL من كل محول-الجيش النيبالي الريبي ligated وأضافه 1 μL من الجيش النيبالي الريبي RT التمهيدي اليها. نقل إلى الدورية الحرارية التي تم مسخن إلى 70 درجه مئوية. احتضان لمده 2 دقيقه.
    12. في أنبوب منفصل ، مزيج 2 μL من 5x حبلا العازلة ، 0.5 μL من 12.5 mM dNTPs ، 1 μL من 100 mM DTT ، 1 μL من مثبط RNase ، و 1 μL من النسخ العكسي. أضافه 5.5 μL من هذا المزيج إلى الجيش النيبالي الريبي محول-ligated ونقل إلى الدورية الحرارية التي تم مسخن إلى 50 درجه مئوية. احتضان لمده 1 ساعة.
    13. نقل cDNA محول-ligated علي الفور إلى الجليد.
    14. في أنبوب منفصل ، مزيج 25 μL من مزيج PCR ، 2 μL من التمهيدي الجيش النيبالي الريبي PCR ، 2 μL من الحمض الريبي النيبالي PCR مؤشر التمهيدي ، و 8.5 μL من المياه RNase خاليه. أضافه 37.5 μL من هذا المزيج إلى 12.5 μL من محول-ligated cDNA. نقل إلى الدورية الحرارية التي تم مسخن إلى 98 درجه مئوية. برنامج الدورية الحرارية كما هو مقترح في بروتوكول الشركة المصنعة مع رقم الدورة المعدلة إلى 15 بدلا من 11.
      ملاحظه: يتم سرد تسلسل جميع الإشعال المستخدمة تحت جدول المواد.
    15. الحفاظ علي العينات في 4 درجه مئوية بعد الانتهاء. المضي قدما معهم أو تخزين في-80 درجه مئوية للاستخدام في المستقبل.
  2. تنقيه وأداء مراقبه الجودة لل cDNA ligated.
    ملاحظه: وكان تضخيم cDNA هلام تنقيه باتباع بروتوكول الشركة المصنعة باستثناء بعض التعديلات لتحسين نوعيه والغلة من العينات cDNA تنقيه كما هو موضح أدناه.
    1. استخدام 6 ٪ الهلام polyالاكريلاميد TBE لتنقيه cDNA تضخيمها. تمييع سلم عاليه الدقة (HRL) والعرف سلم RNA (CRL) مع كميات متساوية من صبغ الحمض النووي التحميل.
    2. أضافه 10 μL من صبغ الحمض النووي لتحميل كل عينه cDNA. تشغيل 30 μL من كل عينه في اثنين من الممرات منفصلة المتاخمة لبعضها البعض مع CRL و HRL في المسافة المتوسطة بين عينتين مختلفتين.
    3. تشغيل هلام في 1x العازلة TBE في 145 V لمده 30 − 40 دقيقه تقريبا.
      ملاحظه: تتبع الجبهة الزرقاء السفلي من صبغ التحميل. وقف الكهربائي عندما يقترب من الجزء السفلي من هلام.
    4. نقل هلام في 1x العازلة TBE مع بروميد ايثيديوم (EtBr) في 0.5 ميكروغرام EtBr/1 mL 1x TBE.
      تحذير: EtBr هو مسرطنه معروفه وكل خطوه من هنا حتى الختان من هلام ينبغي ان يؤديها بحذر شديد.
    5. تصور هلام في المصباح وقطع الهلام علي وجه التحديد بين 145 bp و 160 bp علامة.
      ملاحظه: الدمامل محول تشغيل قريبه جدا من علامة bp 145. لذلك ، قطع هلام قليلا فوق علامة bp 145 لتجنب التلوث مع dimer محول.
    6. نقل الهلام إلى أنابيب كسر الحمض النووي الاحتفاظ بها في 2 مل أنابيب جمع. تدور في 20,000 x g لمده 2 دقيقه أضافه 300 μl من المياه RNase خاليه والسماح لها لتدوير بلطف علي الروك بين عشيه وضحيها في RT.
    7. لتنفيذ هطول الامطار الحمض النووي ، في اليوم التالي نقل محتويات الأنبوب إلى أنابيب فلتر 5 μm. تدور في 600 x g ل 10 s.
      ملاحظه: لا تدع أنابيب تدور أطول من 10 s كما هلام يمر من خلال فلتر.
    8. أضافه 2 μL من الجليكوجين, 30 μL من 3 M NaOAc, 2 μL من 0.1 x بيليه الطلاء, و 975 μL من 100% الايثانول إلى الحمض النووي الذي تم التملص منه. تدور في 17,000 x g في 4 درجه مئوية لمده 20 دقيقه.
    9. تجاهل ماده طافي وأضافه 75 ٪ الايثانول لغسل بيليه. تدور في 17,000 x g في 4 درجه مئوية لمده 5 دقيقه. تجاهل ماده طافي واحتضان الأنابيب في 37 درجه مئوية لتتبخر تماما الايثانول.
    10. أعاده تعليق بيليه مع 12 μL من 10 مم تريس-HCl pH 8.5.
    11. اجراء فحص جوده المكتبة عن طريق تمييع cDNA المنقي بواسطة 10x (1:10) واستخدام 1 μL من cDNA المخفف لتشغيل علي محلل الحيوي.
    12. تاكد من ان حجم المنتج cDNA يتوافق مع نطاق RNA الصغيرة (136 − 160 bp) في الكهربية. احسب إجمالي القيمة لكل عينه. تطبيع كل عينه إلى 2 نانومتر باستخدام تريس-HCl pH 8.5.
  3. دياتورا وتسلسل المنقية cDNA.
    1. تجمع المكتبات عن طريق خلط كميات متساوية من كل عينه 2 نانومتر في أنبوب PCR 200 μL واحد. أضافه 10 μL من الطازجة 0.2 N NaOH إلى 10 μL من المكتبة المجمعة.
    2. اخلط فورا بواسطة فورتيكنج ، وتدور في 280 x g لمده 1 دقيقه. احتضان في RT لمده 5 دقائق.
    3. أضافه 10 μL من 200 mM تريس-حمض الهيدروكلوريك pH 7 إلى 20 μL من مكتبه التحريف. اخلطه بواسطة vortexing وتدور في 280 x g لمده 1 دقيقه.
    4. أضافه 970 μL من الحاجز التهجين المبردة مسبقا إلى المكتبة وتخلط جيدا من قبل vortexing. المكتبة في تركيز 20 مساءا. تبقي علي الجليد حتى يتم تخفيفه أخيرا.
      ملاحظه: يتم التخفيف النهائي الحق قبل تشغيل علي المنظم.
    5. أضافه 117 μL من مكتبه التشويه إلى 1,183 μL من المخزن المؤقت التهجين المبردة مسبقا. مزيج من خلال عكس الأنبوب ونبض الطرد المركزي. التركيز النهائي للمكتبة الآن 1.8 م.
    6. أضافه 1.3 μL من فيديس إلى 1.3 mL من المكتبة النهائية. لبدء تشغيل علي المنظم ، اتبع الخطوات التي علي الشاشة علي واجهه البرنامج ، راجع معلمات التشغيل ، بما في ذلك نوع القراءة (قراءه واحده) ، طول القراءة (عدد الدورات لكل قراءه) ، معرف المكتبة ، وحدد Start (بدء).

5. تحليل البيانات

  1. في نهاية تشغيل التسلسل ، يجب الحصول علي بيانات التسلسل الناتجة كملفات fastQ. استخدم البرنامج المناسب لتحليل بيانات التسلسل الناتجة.
  2. افتح تطبيق أدوات fastQ ثم اضغط علي زر التشغيل .
  3. حدد الملفات من قائمه العينات في البرنامج وحدد المكان الذي سيتم حفظ البيانات فيه.
  4. أضافه اسم سلسله الذي ينطبق علي كل تسلسل تم اقتطاعها. الحفاظ علي التقشف إلى 0.9. إدخال تسلسل المحول لتقليم ك "تجاتكتكججتجككاج" من نهاية 3 ' من كل عينه متسلسلة. قم بتوسيع علامة التبويب " تصفيه القراءة " وحدد الحد الأدنى لطول القراءة "5". حدد مربع الاشعار واضغط علي الزر متابعه لبدء التشذيب. سيتم حفظ الملفات التي تم اقتطاعها في مجلد المشروع عند نهاية التحليل.
  5. فتح التطبيق الصغيرة الحمض الريبي النيبالي v1.0 علي البرنامج واضغط علي زر التشغيل .
  6. حدد المشروع حيث سيتم حفظ الملفات وإرسالها بعد التحليل.
  7. حدد mirs الرواية والتفاضلية miRs الدالة في التطبيق. عزل المجموعات ك "التحكم" و "اختبار" للتحليل التفاضلي وأضافه الملفات التي تم اقتطاعها ليتم تحليلها في مجموعاتها الخاصة.
  8. حدد زر التشغيل لبدء التحليل. بعد التحاليل ، قم بتنزيل الملفات الناتجة.

النتائج

أعدت المكتبة كان بعد [رنا] عزل ونوعيه فحص كان أنجزت. ويبين الشكل 1 والشكل 2تنقيه الهلام لمكتبه cdna المضخمة التي أعدت من الحمض الريبي النيبالي المعزول من الانسجه الدقيقة والمركبات التي تستمد من المصل. حجم المنتج ل miRNAs محول-ligated يقابل حوالي 136 − 160 bp لكل عينه.

Discussion

في هذه المقالة ، ونحن وصف بروتوكول لعزل الحمض الريبي النيبالي من الانسجه FFPE والمركبات التي تستمد المصل باستخدام مجموعات التي تم تحسينها لزيادة الغلة وجوده RNAs معزولة. علاوة علي ذلك ، تم استخدام RNAs المنقي لإنشاء مكتبات cDNA لتسلسل RNA الصغير. كل من الخطوات المذكورة ضرورية في تحديد جوده وعمق الت...

Disclosures

ولا يوجد تضارب في المصالح بين صاحبي البلاغ والإعلان عنه.

Acknowledgements

ويدعم هذا العمل من قبل الجيش الأمريكي البحوث الطبية نشاط الاستحواذ (USAMRÅ) من خلال جائزه التنمية فكره الجائزة السفلي لا. W81XWH-18-1-303 و W81XWH-18-2-0013 الاضافه إلى ذلك عن طريق الجائزة لا. W81XWH-18-2-0015 ، W81XWH-18-2-0016 ، W81XWH-18-2-0017 ، W81XWH-18-2-0018 ، و W81XWH-18-2-0019 شبكه المستودع البيولوجي لسرطان البروستاتا (PCBN). ويعترف أيضا بالدعم التمويلي لمختبر المؤلفين الذي يقدمه المعهد الوطني للسرطان في المعاهد الوطنية للصحة (المنحة رقم RO1CA177984). راجفير داهيا هي عالمه أبحاث مهنية أقدم في قسم شؤون المحاربين القدماء ، BX004473 وتمول من UO1CA199694 (RD). الآراء والتفسيرات والاستنتاجات والتوصيات هي تلك الخاصة بالمؤلف ولا تحظي بالضرورة بتاييد وزاره الدفاع أو الجيش الأمريكي. ونحن ممتنون لجودي Shigenaga ، مدير المرافق الاساسيه في سان فرانسيسكو VAMC ، لمساعدتها مع التسلسل التالي 500 المتسلسلة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3 M NaOAc pH 5.5USB Corp.75897 100 mL
5 µm filter tubesIST Engineering Inc.5388-50
6% TBE polyacrylamide gelsNovexEC6265BOX
BaseSpaceIlluminaAnalysis software
Bio-analyzerAgilent
DNA loading dyeNovexLC6678
Eppendorf Thermostat plusEppendorf 1.5 mL
EtBrPierce17898
Ethyl alcohol 200 proofPharmco111000200
Exosomal RNA isolation kitNorgen58000
Gel breaking tubesIST Engineering Inc.3388-100
Glycogen molecular biology gradeThermo ScientifcR0561
Hematoxylin SelectStat labSL401
MicrocentrifugeFisher Scientific13-100-676accuSpin Micro 17R
miRNeasy FFPE kitQiagen217504
NanodropThermo ScientifcNano Drop 1000
Nanosight NTAMalvernLM14
NextSeq 500 SequencerIllumina
NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles)IlluminaFC-404-2001
Pellet paintMillipore70748-3
Superscript II Reverse TranscriptaseInvitogen18064014
T4 RNA Ligase 2 Deletion MutantLucigenLR2D11310K
TBE Running buffer (5x)NovexLC6675
Thermal cyclerMJ ResearchPTC100
Total exosome isolation reagent (from serum)Invitrogen4478360
TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12)IlluminaRS-200-0012
XyleneFisher ScientificX3P- 1GAL
RNA 3' PrimerGUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC
RNA 5' PrimerTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG
Stop OligoGAAUUCCACCACGUUCCCGUGG
RNA RT PrimerGCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
RNA PCR PrimerAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA
RNA PCR Index PrimerCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
---6 bases in adapter
RNA PCR Index Primer 1CGTGAT
RNA PCR Index Primer 2ACATCG
RNA PCR Index Primer 3GCCTAA
RNA PCR Index Primer 4TGGTCA
RNA PCR Index Primer 5CACTGT
RNA PCR Index Primer 6ATTGGC
RNA PCR Index Primer 7GATCTG
RNA PCR Index Primer 8TCAAGT
RNA PCR Index Primer 9CTGATC
RNA PCR Index Primer 10AAGCTA
RNA PCR Index Primer 11GTAGCC
RNA PCR Index Primer 12TACAAG

References

  1. Heinlein, C. A., Chang, C. Androgen receptor in prostate cancer. Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).
  2. Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor. European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).
  3. Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer. Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).
  4. Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).
  5. Beltran, H., et al. Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer. Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).
  6. Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
  7. Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocrine-Related Cancer. 17 (1), 1-17 (2010).
  8. Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Research. 68 (15), 6162-6170 (2008).
  9. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
  10. Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).
  11. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  12. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  13. Bhagirath, D., et al. microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (7), 1833-1844 (2018).
  14. Witte, J. S. Prostate cancer genomics: towards a new understanding. Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).
  15. Kim, J. H., et al. Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer. Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).
  16. Robinson, D., et al. Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer. Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).
  17. Kim, J., Yu, J. Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer. Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).
  18. Bucay, N., et al. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).
  19. Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).
  20. Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).
  21. Rodriguez, M., et al. Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes. Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).
  22. Guelfi, G., et al. Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research. Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).
  23. Daniel, R., et al. A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).
  24. Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges. Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

153exosomesFFPE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved