从卡西甲抗性前列腺癌患者的甲酸固定组织和血清衍生的外源体对小型非编码RNA进行测序

摘要

治疗阻力经常在晚期前列腺癌患者中发展，在某些情况下，癌症进展到一种称为神经内分泌前列腺癌的致命亚型。评估促进这种转变的微小非编码RNA介导的分子变化，将有助于更好地进行疾病分层，并识别导致神经内分泌前列腺癌发展的因果机制。

摘要

雄激素受体（AR）的消融信号通过雄激素剥夺是前列腺癌治疗的第一线，最初导致癌症回归的目标。然而，在大量病例中，该疾病进展于晚期、抗割礼性前列腺癌（CRPC），其治疗选择有限，而且往往具有攻击性。远转移主要观察到在侵略性疾病的这个阶段。CRPC由第二代AR通路抑制剂治疗，最初提高存活率，随后出现治疗阻力。神经内分泌前列腺癌 （NEPC） 是前列腺癌 （PCa） 的罕见变体，通常通过称为神经内分泌分化 （NED） 的变性过程，通过治疗阻力而发展，其中 PCa 细胞经历一个系接开关从腺癌，并显示神经内分泌 （NE） 血统标记的表达增加.除了驱动NEPC进展和分化的基因组变化外，表观遗传因子和微环境线索被认为是推动疾病进展的重要因素。本手稿提供了详细的协议，用于识别与高级 PCa 相关的表观遗传驱动因素（即小型非编码 RNA）。使用来自正式固定石蜡嵌入 （FFPE） 转移组织和相应血清衍生的细胞外囊泡 （EV） 的纯化微RNA，该协议描述了如何为测序准备具有适当质量控制的库来自这些样本来源的微RNA。从FFPE和EV中分离RNA通常具有挑战性，因为大部分RNA要么降解，要么数量有限。该协议将详细阐述优化RNA输入和cDNA库的不同方法，在测序时产生最具体的读取和高质量的数据。

引言

前列腺癌是由雄激素通过AR信号作用的驱动。因此，瞄准AR通路是治疗疾病^{的主要途径1。}然而，由于靶向疗法，抗药性往往随之而来，疾病发展到晚期转移性CRPC^2。CRPC由第二代AR治疗，包括苯甲酰胺和阿比拉^酮2，3，最初提高存活率。然而，致命变种，如NEPC经常出现在25-30%的治疗CRPC病例，有有限的治疗选择，导致死亡率^增加3。NEPC通过称为NED的可逆的分化过程出现，其中PCa细胞经历从腺癌的谱系开关，并显示AR的表达减少和NE系谱标记的表达增加，包括乙烷2（ENO2），色球素A（CHGA）和突触素（SYP）4。鉴于这些抗药性变异是治疗干预的结果，因此必须破译导致产生这种致命、难以治疗的PCa形式的途径。

最近，贝尔特兰等人进行的一项详尽研究破译了NEPC的基因组学，^{其中分析了拷}贝数的改变、突变、单核苷酸多态性（SNPs）和来自患者衍生转移组织的DNA甲基化。尽管在了解这种侵略性形式的PCa的基因组学方面取得了显著进展，但人们对表观遗传因素知之甚少，包括参与CRPC-腺癌向NEPC过渡的小型非编码RNA（微RNA）。微RNA（miRNA）是22bp长的双链RNA，主要通过抑制基因表达，通过序列特异性相互作用与3'未翻译区域（UtRs）的共和mRNA^目标6。现已发现几种肿瘤抑制剂和肿瘤抑制剂，它们在调节疾病发病和转移中的作用已在不同癌症中得到了很好的^研究。这些小型非编码RNA经常作为控制疾病死亡率的非常重要的目标6，8，9。最近的研究集中在了解miRNA在癌症转移中的副体效应，通过它们在EV中的传输，如外生体，在血液中流动，并允许肿瘤细胞发送这些二次信使转移到转移位置在无核酸酶环境10，11，12。EV携带来自肿瘤细胞的miRNA，从宿主^细胞12转移转化效应。因此，将EV识别为肿瘤细胞的二次信使，对于非侵入性疾病严重程度的检测非常有用。

miR-1246在来自腐蚀性PCa的EV中高度调节，它表明疾病严重程度^为13。这些与EV相关的miRNA不仅作为该病的非侵入性生物标志物，而且在推动肿瘤发生方面起着重要的作用。因此，必须了解与抗性形式的PCa相关的miRNA表谱的重要性，以便更好地识别非侵入性生物标志物及其功能意义。

下一代测序的出现为研究肿瘤景观的细节提供了最全面的平台，涉及基因组的改变，如突变、染色体重新定位、染色体分治和甲基化，所有这些都对^{癌症14、15、16}的形式和性质有重大贡献。同样，它也是一个必要的工具，以了解发生在肿瘤细胞的巨大表观基因组变化，往往是疾病严重^程度17的重要参与者。为了了解与NEPC的产生相关的miRNA谱系，对FFPE转移性CRPC组织及其相应的血清衍生EV进行了小RNA测序。从这两个样本源之一衍生的RNA是（1）产量低和（2）质量不良，由于形式固定和EV分离通常发生降解。此外，生成 cDNA 库是测序运行的关键但繁琐的步骤。因此，分离这些RNA并使用它们生成小RNA测序库的方法需要优化才能生成准确可靠的数据。

有几种方法可以分析不同样品中的miRNA表达，包括RT-PCR、微阵列和原位杂交（ISH）。使用FFPE组织衍生RNA评估RT-PCR和ISH的miRNA表达的协议最近发表^于18。较新的技术为在样本中分析 miRNA 表达提供了更详尽和更全面的平台。NanoString nCounter 提供一个敏感的 miRNA 检测平台^19，但检测通常受到阵列中可用的 miRNA 数量的限制（+2，000）。在这种情况下，一个更敏感和详尽的平台，如下一代测序提供了更广泛的深度的miRNA识别和同时分析在不同的^样本20。该方法已用于确定来自PCa^{患者21、22、23}的尿液或血浆中的miRNA特征。在本篇文章中，提出了使用下一代测序平台研究使用FFPE组织和血清衍生EVRNA与腐蚀性CRPC相关的miRNA曲线的协议。

研究方案

这项研究是按照美国共同规则的伦理准则进行的，并经人类研究机构委员会批准。

1. 微解剖

注:FFPE转移CRPC组织具有腺癌特征（CRPC-Adeno）或NE分化（CRPC-NE）从前列腺癌生物储存网络（PCBN）获得。玻璃玻片上的10微米PCa部分为手动微解剖做好准备，如^前18条所述。简要总结:

1. 通过将幻灯片浸泡在二甲苯中（2x，每个10分钟），使组织部分脱胶。然后，在分级乙醇（100%、95%、90%、80%、80%和70%）中，将切片各孵育5分钟，然后用血氧林（30s浸泡）蒸馏水洗涤和染色，使各部分补水。
2. 在血氧林染色后，用水清洗组织部分。然后脱水组织部分，将它们放入分级乙醇（70%，80%90%，95%，100%）（各5分钟），然后是二甲苯（5分钟）。
3. 分析相应的血氧素和欧辛（H&E）幻灯片，以识别肿瘤区域（即腺癌或NED），并在董事会认证病理学家的协助下标记这些肿瘤区域和正常的相邻区域。使用这些 H&E 幻灯片作为路线图，标记在上述步骤中获得的血氧素染色组织，以区分肿瘤和正常区域。
4. 使用手术刀在显微镜下仔细解剖标记的组织幻灯片。
5. 使用静电带电凝胶加载移液器尖端，从正常和癌变区域收集解剖组织。带电的尖端吸引解剖组织，允许在解剖后实现最大的组织恢复。一旦组织粘在带电尖端，将尖端切成空的 2 mL 收集管。

2. 隔离血清衍生的EV

注:从具有腺癌特征（CRPC-adeno）或NE分化（CRPC-NE）的转移性CRPC患者身上采集的冷冻患者血清样本，使用经批准的IRB协议从PCBN采购，并在使用前储存在-80°C。血清样本从与用于微解剖组织的患者组收集，以便比较相应的组织和血清衍生的EV。市售血清EV分离试剂用于收集EV。

1. 在4°C下解冻冷冻患者血清样本。
2. 使用110 μL的解冻血清样品，在2，000 x g下旋转30分钟。
3. 收集上清液以进行后续 EV/外体隔离，并丢弃碎屑颗粒。将30μL血清外体分离试剂加入上清液，在4°C下孵育30分钟。
4. 以10，000 x g旋转10分钟。仔细收集EV耗尽血清，而不会干扰颗粒在单独的1.5 mL管中，并储存在-80°C，以便将来分析（如果需要）。
5. 在无核酸酶水中制备的70μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中重新悬浮EV颗粒。为粒子跟踪分析系统保留等分，以评估粒子的质量和数量。将样品的其余部分储存在-80°C，直到进一步分析。

3. 从微解剖前列腺组织和EV中分离RNA

注:Total RNA是从微解剖组织和纯化EV中分离的，使用市售试剂盒（材料表），根据制造商的说明进行一些修改。以下各节简要描述了这些步骤，特别强调了重要步骤:

1. 从微解剖组织中分离RNA。
   1. 在150μL蛋白酶K缓冲液中重新悬浮微解剖FFPE组织。通过涡旋混合和移液从尖端的残余组织。以 11，000 x g旋转 1 分钟。
   2. 向颗粒中加入10μL蛋白酶K。等待 2 分钟，直到颗粒变白。上下移液几次。
   3. 在56°C孵育16分钟，涡流每3分钟孵育一次。
   4. 取出样品，让热块达到80°C。每3分钟孵育块上的样品16分钟。
   5. 在冰上孵育3分钟。
   6. 以 20，000 x g旋转 15 分钟，将上清液转移到新的 2 mL 管中。
   7. 加入16 μL的DNase增压缓冲液，然后加入10μL的DNase I.混合，轻轻倒置管，在室温（RT）下孵育15分钟。
   8. 加入320μL红血球（RBC）利沙缓冲液。通过反转管混合，然后加入1，120μL的100%乙醇。立即在 4°C 存储的旋转柱上传输。以 8，000 x g旋转 30 s。
   9. 用洗涤缓冲液清洗柱子 2x，在 20，000 x g下旋转柱子 5 分钟，以去除残留洗涤缓冲液。
   10. 让旋转柱干燥2⁄3分钟，然后用19 μL的无RNase水洗空。在分光光度计上定量纯化的RNA，并将样品标准化为40纳克/μL。
2. 从血清衍生的EV中分离RNA。
   1. 使用试剂盒分离外索RNA。加入75μL的莱沙缓冲液A和9.3μL的莱沙缓冲液B至50μL的纯化EV悬浮液。
      注:通过反转管约 10 分钟来保持样品的混合，以便完全对 EV 进行莱沙。
   2. 加入130 μL的100%乙醇，并立即通过反转样品进行混合。在旋转柱上传输，然后在 3，300 x g下旋转 1 分钟。
   3. 使用洗涤缓冲液清洗 2 倍的列。以 1，300 x g旋转柱子 3 分钟，以完全去除洗涤缓冲液。
   4. 让柱子干燥2分钟，向柱子中加入18 μL洗脱缓冲液，让它在400 x g下旋转2分钟，再旋转1分钟，然后以5，800 x g进行第二次旋转3分钟。
   5. 重复步骤3.2.4，将洗脱的缓冲液包含在试剂盒中，以增加样品中RNA的收率。
   6. 在分光光度计上量化样品并将其标准化为 40 纳克/μL。

4. 小RNA测序的库准备

注:一个小型的RNA库准备试剂盒（材料表）用于从分离的RNA样本中生成cDNA库。在序列器上运行之前生成库、纯化和质量的步骤对于任何排序协议都至关重要，因为它们最终决定运行输出数据的质量。因此，请仔细执行每个步骤。制造商的指南建议使用至少50纳克的RNA。鉴于通常从这两个样本来源获得的总RNA质量低且数量少，此方案针对低至100 ng的RNA浓度进行了优化。下面的协议用于库的一个示例。

1. 生成适配器连字 cDNA。
   1. 使用5μL的归一化（40纳克/μL）RNA样品。添加 1 μL 的 3' 适配器。在孵育样品之前，将热循环器预热至 70°C。孵育2分钟，在进入下一步之前立即在冰上转移样品。
   2. 在单独的管中，混合2μL的结扎缓冲液，1μL的RN酶抑制剂，和1μL的T4RNA利加塞2，一个缺失突变体。通过上下移液混合，用RNA/3'适配器将4μL的混合物加入管中。
   3. 转移到已预热至 28°C 的热循环器，孵育 1 小时。
   4. 添加 1 μL 的停止溶液，同时将样品保持在热块上。在28°C孵育15分钟。
   5. 迈出这一步后，立即取出管子并放在冰上。
   6. 在单独的管中，添加 1 μL 的 5' 适配器。
   7. 转移到已预热至 70°C 的热循环器，孵育 2 分钟。
   8. 立即将管子放在冰上，以防止适配器重新退火。
   9. 将 1 μL 的 10 mM ATP 添加到变性 5' 适配器管中。通过移液混合，并在混合物中加入1μL的T4RNA连体。通过移液混合，并将3μL的混合物加入含有3'适配器结扎的RNA的管中。在已预热至 28°C 的热循环器上转移，孵育 1 小时。
   10. 立即转移到冰上，并进一步处理样品或储存在-20°C，以供将来使用。
   11. 要执行RT-PCR，请使用每个适配器结扎的RNA的6μL，并添加1μL的RNART引种。转移到已预热至 70°C 的热循环器。孵育2分钟。
   12. 在单独的管中，混合 2 μL 的 5x 股缓冲液，0.5 μL 的 12.5 mM dNTP，1 μL 的 100 mM DTT，1 μL 的 RNase 抑制剂和 1 μL 的逆转录酶。将5.5 μL的这种混合物加入适配器结扎的RNA中，并转移到已预热至50°C的热循环器中。孵育1小时。
   13. 立即将适配器连结的 cDNA 转移到冰上。
   14. 在单独的管中，混合25μL的PCR混合物、2μL的RNA PCR引体、2μL的RNA PCR引结指数和8.5μL的无RN酶水。将37.5 μL的这种混合物添加到12.5 μL的适配器连结cDNA中。转移到已预热至 98°C 的热循环器。按照制造商协议的建议对热循环器进行编程，将循环号修改为 15 而不是 11。
       注:所有使用的引物序列都列在材料表下。
   15. 完成后，将样品保持在4°C。继续操作或储存在-80°C，以供将来使用。
2. 净化并执行结扎cDNA的质量控制。
   注:通过遵循制造商的协议对扩增的 cDNA 进行凝胶纯化，但经过一些修改以提高纯化 cDNA 样品的质量和产量，如下所述。
   1. 使用6%TBE聚丙烯酰胺凝胶来纯化扩增的cDNA。用同等数量的DNA加载染料稀释高分辨率阶梯（HRL）和定制RNA阶梯（CRL）。
   2. 在每个cDNA样品中加入10μL的DNA加载染料。在两个不同样品之间的中间空间中，用CRL和HRL在两个相邻的两个独立通道中运行每个样品的30μL。
   3. 在 1x TBE 缓冲液中以 145 V 运行凝胶约 30–40 分钟。
      注:跟踪装载染料的下蓝色前部。当电泳接近凝胶底部时，停止电泳。
   4. 将凝胶与溴化铀（EtBr）一起在0.5 μg EtBr/1 mL 1x TBE下转移。
      警告:EtBr 是一种已知的致癌物质，从这里开始的每一步，直到从凝胶的切除应极其小心。
   5. 在透射器中可视化凝胶，并在 145 bp 和 160 bp 标记之间精确切割凝胶。
      注:适配器二聚器运行非常接近 145 bp 标记。因此，将凝胶切至略高于 145 bp 标记，以避免使用适配器二聚器污染。
   6. 将凝胶转移到保存在2 mL收集管中的DNA断裂管。以 20，000 x g旋转 2 分钟。加入 300 μL 无 RNase 水，使其在 RT 上轻轻旋转。
   7. 为了执行DNA沉淀，第二天将管内内容物转移到5μm滤管。以 600 x g旋转 10 s。
      注:当凝胶通过过滤器时，不要让管旋转超过 10 s。
   8. 在洗脱的DNA中加入2μL的糖原、30μL的3M NaOAc、2μL的0.1x颗粒涂料和975μL的100%乙醇。在 4°C 下以 17，000 x g旋转 20 分钟。
   9. 丢弃上清液，加入75%乙醇清洗颗粒。在4°C下以17，000 x g旋转5分钟。丢弃上清液，在37°C下孵育管子，完全蒸发乙醇。
   10. 用 12 μL 的 10 mM Tris-HCl pH H H 8.5 重新悬浮颗粒。
   11. 通过将纯化的 cDNA 稀释 10 倍 （1:10） 并使用 1 μL 稀释的 cDNA 在生物分析仪上运行，执行库质量检查。
   12. 确保 cDNA 产品尺寸与电图中的小 RNA （136×160 bp） 范围相对应。计算每个样本的总摩尔度。使用 Tris-HCl pH 8.5 将每个样品标准化为 2 nM。
3. 变性和序列纯化的cDNA。
   1. 通过将每个 2 nM 样品的相等体积混合在一个 200 μL PCR 管中，将库集中。将 10 μL 新鲜制备的 0.2 N NaOH 添加到 10 μL 的池库中。
   2. 立即通过涡旋混合，在 280 x g下旋转 1 分钟，在 RT 孵育 5 分钟。
   3. 添加 10 μL 的 200 mM Tris-HCl pH H 7 至 20 μL 的变性库。通过涡旋混合，在 280 x g下旋转 1 分钟。
   4. 将 970 μL 的预冷却杂交缓冲液添加到库中，并通过涡旋很好地混合。库的浓度为 20 pM。保持冰上，直到它最终被稀释。
      注:在音序器上运行之前，会直接进行最后的稀释。
   5. 将117 μL的变性库添加到1，183 μL的预冷杂交缓冲液中。通过反转管和脉冲离心机进行混合。库的最终浓度现在是 1.8 pM。
   6. 将 1.3 μL 的 PhiX 添加到最终库的 1.3 mL。要启动在音序器上的运行，请按照软件界面上的屏幕步骤操作，查看运行参数，包括读取类型（单次读取）、读取长度（每次读取的周期数）、库 ID，然后选择"开始"。

5. 数据分析

1. 在音序器运行结束时，获取生成的排序数据作为 fastQ 文件。使用适当的软件分析生成的排序数据。
2. 打开快速Q工具包应用程序，然后按"启动"按钮。
3. 从软件中的示例列表中选择文件，然后选择数据的保存位置。
4. 添加应用于每个修剪序列的字符串名称。保持严格性为 0.9。输入适配器序列以从每个序列样本的 3' 端修剪为"TGGAATTCTCGGGGGCCAAGg"。展开"读取筛选"选项卡并选择最小读取长度为"5"。选择"确认"框，然后按"继续"按钮开始修剪。修剪后的文件将在分析结束时保存在项目文件夹中。
5. 打开软件上的小 RNA v.1.0应用程序，然后按"启动"按钮。
6. 选择将在分析后保存和发送文件的项目。
7. 在应用程序中选择新颖 miRs 和差分 miR函数。将组分隔为"控制"和"测试"进行差分分析，并添加要在其各自组中分析的修剪文件。
8. 选择启动按钮以启动分析。分析后，下载生成的文件。

结果

该库是在RNA分离后制备的，并进行了质量检查。从从微解剖组织和血清衍生的EV中分离出的RNA制备的扩增cDNA库的凝胶纯化如图1和图2所示。适配器连带miRNA的产品尺寸对应于每个样品约136-160 bp。图1A-B被标记为显示应精确切除用于小RNA库制备的凝胶范围。图2A-B显示了微解剖组织和血?...

讨论

在本文中，我们将描述一种使用经过优化以提高分离RNA的产量和质量的试剂盒从FFPE组织和血清衍生EV中分离RNA的协议。此外，纯化RNA用于生成用于小RNA测序的cDNA库。列出的两个步骤对于确定排序读取的质量和深度都至关重要，而排序读取是运行²⁴的最终结果。因此，优化这些关键步骤对于成功的测序运行至关重要。

FFPE衍生RNA分离的一个重要步骤是用蛋白酶K...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 M NaOAc pH 5.5	USB Corp.	75897 100 mL
5 µm filter tubes	IST Engineering Inc.	5388-50
6% TBE polyacrylamide gels	Novex	EC6265BOX
BaseSpace	Illumina		Analysis software
Bio-analyzer	Agilent
DNA loading dye	Novex	LC6678
Eppendorf Thermostat plus	Eppendorf 1.5 mL
EtBr	Pierce	17898
Ethyl alcohol 200 proof	Pharmco	111000200
Exosomal RNA isolation kit	Norgen	58000
Gel breaking tubes	IST Engineering Inc.	3388-100
Glycogen molecular biology grade	Thermo Scientifc	R0561
Hematoxylin Select	Stat lab	SL401
Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-676	accuSpin Micro 17R
miRNeasy FFPE kit	Qiagen	217504
Nanodrop	Thermo Scientifc	Nano Drop 1000
Nanosight NTA	Malvern	LM14
NextSeq 500 Sequencer	Illumina
NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles)	Illumina	FC-404-2001
Pellet paint	Millipore	70748-3
Superscript II Reverse Transcriptase	Invitogen	18064014
T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant	Lucigen	LR2D11310K
TBE Running buffer (5x)	Novex	LC6675
Thermal cycler	MJ Research	PTC100
Total exosome isolation reagent (from serum)	Invitrogen	4478360
TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12)	Illumina	RS-200-0012
Xylene	Fisher Scientific	X3P- 1GAL
RNA 3' Primer			GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC
RNA 5' Primer			TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG
Stop Oligo			GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG
RNA RT Primer			GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
RNA PCR Primer			AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA
RNA PCR Index Primer			CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
-	-	-	6 bases in adapter
RNA PCR Index Primer 1			CGTGAT
RNA PCR Index Primer 2			ACATCG
RNA PCR Index Primer 3			GCCTAA
RNA PCR Index Primer 4			TGGTCA
RNA PCR Index Primer 5			CACTGT
RNA PCR Index Primer 6			ATTGGC
RNA PCR Index Primer 7			GATCTG
RNA PCR Index Primer 8			TCAAGT
RNA PCR Index Primer 9			CTGATC
RNA PCR Index Primer 10			AAGCTA
RNA PCR Index Primer 11			GTAGCC
RNA PCR Index Primer 12			TACAAG