JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نقدم بروتوكول لاختبار فعالية العلاجات المستهدفة المختارة على أساس التركيبة الجينومية للورم. ويصف البروتوكول تحديد وإعادة التحقق من إعادة ترتيب الحمض النووي الهيكلي، وgragraftment من أورام المرضى في الفئران واختبار الاستجابات للأدوية المقابلة.

Abstract

نقدم هنا نهجا تكامليا لاختبار فعالية العلاجات المستهدفة التي تجمع بين الجيل القادم من التسلسل technolo - gies ، والتحليلات العلاجية المستهدفة ورصد استجابة الدواء باستخدام xenografts المستمدة من المريض (PDX). تم التحقق من صحة هذه الاستراتيجية باستخدام أورام المبيض كمثال. تم استخدام بروتوكول تسلسل الجيل التالي (MPseq) لتحديد التعديلات الهيكلية وتبعه تحليل للتعديلات التي يمكن استهدافها. تم علاج الأورام البشرية التي تزرع في الفئران المناعية بأدوية تم اختيارها استنادًا إلى التحليلات الجينومية. أظهرت النتائج وجود ارتباط جيد بين الاستجابات المتوقعة والاستجابات الملاحظة في نموذج PDX. يمكن استخدام النهج المقدم لاختبار فعالية العلاجات المركبة والمساعدة في العلاج الشخصي للمرضى الذين يعانون من السرطان المتكرر ، وتحديدا في الحالات التي يفشل فيها العلاج القياسي وهناك حاجة لاستخدام الأدوية خارج التسمية.

Introduction

ظهرت xenografts المستمدة من المريض (PDXs) ، والتي يتم إنشاؤها من زرع قطع الورم المريض في الفئران المناعية ، كنموذج قوي قبل الظهر للمساعدة في الرعاية الشخصية المضادة للسرطان. وقد تم تطوير نماذج PDX بنجاح لمجموعة متنوعة من الأورام الخبيثة البشرية. وتشمل هذه سرطانات الثدي والمبيض، سرطان الجلد الخبيث، سرطان القولون والمستقيم، وسرطان غدية البنكرياس، وسرطان الرئة غير صغيرالخلية 1،2،3،4،5. يمكن زرع أنسجة الورم بشكل متقوي أو غير متغاير. الأول، يعتبر أكثر دقة ولكن من الصعب من الناحية الفنية، ينطوي على زرع مباشرة في الجهاز من أصل الورم. ويعتقد أن هذه الأنواع من النماذج لتقليد الأنسجة بالضبط من الورم الأصلي بسبب البيئة الدقيقة "الطبيعية" للورم6,7. على سبيل المثال، زرع العظام في الجراب من المبيض الماوس أدى إلى نشر الورم في تجويف البريتوني وإنتاج استسقاء، نموذجية من سرطان المبيض8. وبالمثل، حقن أورام الثدي في الصدر بدلا من الغدة الثديية في البطن أثرت على معدل النجاح PDX والسلوك9. ومع ذلك، تتطلب نماذج تقويم العظام أنظمة تصوير متطورة لمراقبة نمو الورم. وعادة ما يتم إجراء زرع غير تقليدية للورم الصلب عن طريق زرع الأنسجة في الجناح تحت الجلد من الماوس الذي يسمح لمراقبة أسهل لنمو الورم وأقل تكلفة وتستغرق وقتا طويلا7. ومع ذلك، الأورام التي نمت تحت الجلد نادرا ما تنتشر على عكس ما لوحظ في حالة زرع العظام10.

وقد تبين أن معدل نجاح engraftment تختلف وتعتمد بشكل كبير على نوع الورم. وأفادت التقارير الأورام أكثر عدوانية وعينات الأنسجة التي تحتوي على نسبة أعلى من الخلايا السرطانية أن يكون أفضل معدلات النجاح12,13. واتساقا مع هذا، تبين الأورام المستمدة من المواقع النقيلي لengraft في ترددات من 50-80٪، في حين أن تلك من المواقع الأولية engraft في ترددات منخفضة 14٪12. في المقابل، الأنسجة التي تحتوي على الخلايا النخرية وأقل الخلايا السرطانية القابلة للحياة تغر بشكل سيئ. ويمكن أيضا أن تعزز نمو الورم بإضافة البروتينات مصفوفة غشاء الطابق السفلي في مزيج الأنسجة في وقت الحقن في الفئران14 دون المساس خصائص الورم الأصلي. كما وجد أن حجم وعدد قطع الأنسجة المعدة للزرع تؤثر على معدل نجاح النقش. تم الإبلاغ عن أكبر من الأورام اتخاذ معدلات لزرع في كبسولة تحت الكلى مقارنة زرع تحت الجلد بسبب قدرة كبسولة دون كلوي للحفاظ على الورم الأصلي stroma وتوفير الخلايا القوية المضيفة وكذلك15.

معظم الدراسات استخدام NOD / SCID الفئران المناعية، والتي تفتقر إلى الخلايا القاتلة الطبيعية16 وقد ثبت أن زيادة الورم النقش والنمو والنتلال مقارنة مع سلالات أخرى14. ومع ذلك، هناك حاجة إلى رصد إضافي لأنها قد تتطور الأورام اللمفاوية الزعترة في وقت مبكر من 3-4 شهر من العمر13. في زراعة أورام المبيض التي تزرع في الفئران SCID، تم بنجاح منع نمو الخلايا B من قبل rituximab، ومنع تطور الأورام اللمفاوية ولكن دون التأثير على graftment من أورام المبيض17.

وفي الآونة الأخيرة، NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJl) الفئران, تحمل طفرة فارغة في ترميز الجين سلسلة غاما مستقبلات 2 إنترلوكين2, أصبح سلالة تستخدم في كثير من الأحيان لتوليد نماذج PDX. الأورام من نماذج PDX المنشأة التي تم تمريرها إلى الأجيال القادمة من الفئران وأفيد أن تحتفظ الخصائص النسيجية والجزيئية ل 3 إلى 6 أجيال19,20. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن نتائج العلاج في نماذج PDX تحاكي تلك من المرضى المقابلةلها 2,3,4,21,22,23. وكان معدل الاستجابة للعلاج الكيميائي في نماذج PDX لسرطان الرئة غير الصغيرة وسرطان القولون والمستقيم مماثلة لتلك التي في التجارب السريرية لنفس الأدوية24,25. أظهرت الدراسات التي أجريت في نماذج PDX ، وضعت للمرضى المسجلين في التجارب السريرية ، الاستجابات لاختبار الأدوية المماثلة لتلك التي لوحظت سريريا في المرضى المقابلة2،3،4.

توفر التحليلات الجينية عالية الإنتاجية للورم المريض بالاقتران مع نماذج PDX أداة قوية لدراسة الارتباطات بين التعديلات الجينومية المحددة والاستجابة العلاجية. وقد وصفت هذه في عدد قليل من المنشورات26,27. على سبيل المثال، الاستجابات العلاجية لمثبطات EGFR cetuximab في مجموعة من نماذج PDX القولون والمستقيم تحمل التضخيم EGFR، والاستجابات السريرية الموازية لcexceimab في المرضى28.

هناك بعض التحديات المرتبطة بتطوير وتطبيق نماذج PDX. ومن بين تلك هي عدم تجانس الورم29,30 التي قد تهدد دقة تفسير استجابة العلاج كما استنساخ خلية واحدة مع قدرة تكاثرية أعلى داخل PDX يمكن أن تتفوق على تلك الأخرى31, مما يؤدي إلى فقدان عدم التجانس. بالإضافة إلى ذلك، عندما يتم استخدام الخزعات ورم واحد لتطوير PDX، قد غاب عن بعض مجموعات الخلايا ولن تكون ممثلة في الكسب غير المشروع النهائي. يوصى بأخذ عينات متعددة من نفس الورم للزرع لحل هذه المشكلة. على الرغم من أن أورام PDX تميل إلى احتواء جميع أنواع الخلايا من الورم المانح الأصلي ، يتم استبدال هذه الخلايا تدريجيا من قبل تلك المنشأ مورين3. التفاعل بين مورين ستروما والخلايا السرطانية البشرية في نماذج PDX غير مفهومة جيدا. ومع ذلك, وقد تبين أن الخلايا الهمية لخياب اخصائية الأورام microenvironment33.

على الرغم من هذه القيود، لا تزال نماذج PDX من بين الأدوات الأكثر قيمة للبحث الترجمي بالإضافة إلى الطب الشخصي لاختيار علاجات المرضى. وتشمل التطبيقات الرئيسية لـ PDXs اكتشاف العلامات البيولوجية واختبار المخدرات. كما تستخدم نماذج PDX بنجاح لدراسة آليات مقاومة الأدوية وتحديد استراتيجيات للتغلب على مقاومة الأدوية34,35. النهج الموصوف في هذه المخطوطة يسمح للباحث لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة في الأورام البشرية وتقييم فعالية الأدوية المقابلة في الجسم الحي، في الفئران التي تؤوي الأورام التي تم تصنيفها في البداية بشكل جيني. البروتوكول يستخدم أورام المبيض engrafted intraperitoneally ولكن ينطبق على أي نوع من الورم العدوانية بما فيه الكفاية لتنمو في الفئران2,3,12.

Protocol

تم جمع الأنسجة الطازجة من المرضى الذين يعانون من سرطان المبيض بالتراضي في وقت إجراء جراحة إزالة الbulking وفقًا لبروتوكول وافق عليه مجلس المراجعة المؤسسية لـ Mayo Clinic (IRB). تمت الموافقة على جميع الإجراءات والعلاجات الحيوانية المستخدمة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها (IACUC) في Mayo Clinic (مايو كلينك) واتبعت إرشادات رعاية الحيوان.

1. ماتي تسلسل الزوج والتحليلات

ملاحظة: يجب استخدام الأنسجة المجمدة الطازجة أو الفلاش لتسلسل زوج (MPseq). مادة البارافين غير مناسبة لأنها تحتوي على الحمض النووي المجزأ.

  1. عزل الحمض النووي من أنسجة الورم المجمدة. استخدام عينة الإنسان الأصلي التي تم الحصول عليها من المواد الجراحية أوخزعة 36.
  2. استخدام 1000 نانوغرام من الحمض النووي لجعل المكتبات MPseq وتسلسل 2 عينات في حارة على الجيل التالي التسلسل (انظر جدول المواد)36.
  3. تحليل البيانات باستخدام مجموعة من الخوارزميات للكشف عن انحرافات الكروموسومات الكبيرة (الحذف، والإدراجات، والتضخيم، والانعكاسات والتواقل) كما هو موضح سابقا36،37.

2- اختيار الأهداف العلاجية

  1. استخدم أداة "باندا الوصول المفتوح" (المسار والتعليق التوضيحي) أو أداة مشابهة لتحديد التعديلات المستهدفة (http://bioinformaticstools.mayo.edu/Panda).
    1. إعداد قائمة بالجينات التي تم تحديدها من قبل MSeq على أنها معدلة، كملف بسيط محدد بعلامات جدولة، باستخدام رموز جينية قياسية مقبولة.
      ملاحظة: المثال المتضمن ميزات تحليل التضخيم والمكاسب.
    2. إضافة علامة "#" إلى سطر الرأس من القائمة للتأكد من نقل رأس الجدول إلى طريقة عرض مستوى المسار للبرنامج.
    3. تحميل الملف بالنقر فوق علامة التبويب "تحميل مجموعة التعليق التوضيحي" للتنقل.
    4. تعيين رمز واحد من القائمة لتمثيل البيانات الأساسية بالنقر فوق رمز الاختيار ثم النقر فوق علامة التبويب إنهاء.
    5. بعد تحميل ملفات التعليقات التوضيحية، حدد عمودًا يعرض عدد الجينات المشروحة لكل مسار. هذا هو العمود الأخير على اليمين.
    6. استخدم فلتر المسار في الجزء العلوي الأيسر من النافذة الرئيسية لإظهار المسارات التي تحتوي على جينات ذات أهمية.
    7. تحديد المسارات التي لديها جينات مشروحة أكثر مما هو متوقع عن طريق الصدفة. استخدم الدالة الموجودة تحت علامة التبويب إثراء.
    8. حدد قاعدة بيانات لعرض الجينات القابلة للتخريد المحتملة من التعليق المسبق المسبق عن طريق التحقق من رمز مناسب على يسار النافذة الرئيسية (على سبيل المثال، DGIdb، PharmGKB).
    9. حدد مسارًا للتصور عن طريق النقر على اسمه المعروض في صفحة عارض المسار.
      ملاحظة: تظهر الرموز التي تمثل كل مجموعة تعليقات توضيحية بجوار الجين المقترن. انقر على الجين من الفائدة لفتح صفحة الويب الخاصة بـ GeneCards.
    10. حدد المسارات التي أظهرت الجينات المشروحة ذات الاهتمام (أي، التي تم تغييرها في ورم معين) و "يضرب" للأدوية المحتملة لمزيد من التحليل.
  2. استخدام قاعدة بيانات تحتوي على أدوية معتمدة للاستخدام السريري (https://clinicaltrials.gov/) للإشارة إلى الأهداف المحددة.
  3. تحديد أولويات التعديلات المستهدفة لإجراء مزيد من الاختبارات في نماذج PDX عن طريق إجراء مراجعة للمؤلفات (مثل PubMed) لتأكيد مدى ارتباطها ببيولوجيا نوع معين من الأورام.

3- التحقق من إعادة ترتيب الجينومات عن طريق تسلسل PCR وSanger

  1. تصميم التمهيدي باستخدام قراءات التسلسل التي تم الحصول عليها من بيانات MPseq.
    1. حدد ملتقى الاهتمام للتحقق من الصحة (أي الهدف العلاجي المحتمل) استنادًا إلى تحليلات MPseq.
    2. تصميم التمهيديات اتجاه بحيث أمبيركون يحتوي على تقاطع. تصميم 2 التمهيدي على كل جانب من تقاطع، ما مجموعه 4، لزيادة فرص تضخيم تقاطع.
      ملاحظة: اسم التمهيدي وفقا للحالة وموقع الكروموسوم.
    3. استخدم معلمات PCR القياسية لتصميم التمهيدي والبرامج المفضلة. حدد درجة حرارة الذوبان (60-62 درجة مئوية) ومحتوى GC (40-60٪). تأكد من أن تسلسل التمهيدي لا تشكل الخافتات التمهيدية أو palindromes أو حلقات دبوس الشعر.
    4. تأكد من أن تسلسل التمهيدي يفتقر إلى علم الهمولوجيا إلى مناطق أخرى من الجينوم البشري عن طريق التحقق منه باستخدام BLAT (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start).
  2. تشغيل PCR لتضخيم تقاطع المصالح.
    1. تمييع التمهيدي مع الماء إلى 10 mM والجمع بين 10 مل من كل التمهيدي بحيث يتم إقران كل التمهيدي إلى الأمام مع كل التمهيدي العكسي في مزيج التمهيدي.
      ملاحظة: يتم عرض تسلسلات التمهيدية المثال المحدد في الجدول 1.
    2. تسمية 0.2 مل أنابيب الشريط كما: C1، T1، C2، T2، C3، T3، C4 و T4 حيث C = السيطرة على الحمض النووي الجينومي البشري (التجارية)، T = الورم DNA، معزولة عن المريض أو الورم PDX، والرقم يشير إلى مزيج التمهيدي.
    3. إضافة 1 مل من كل مزيج التمهيدي في أنابيب لها المسمى.
    4. إعداد ماسترميكX Taq عن طريق الجمع بين الكواشف المدرجة في الجدول 2، وترك الانزيم في الثلاجة حتى الحاجة ، مضيفا إلى مزيج في نهاية جدا.
    5. جعل 2 يمزج الرئيسي، واحد لكل قالب الحمض النووي، والسيطرة على الحمض النووي البشري والحمض النووي الورم. أضف 24 مل من كل مزيج طق ماجستير إلى أنبوب الشريط الخاص بها. حجم التفاعل الكلي هو 25 مل. دوامة لفترة وجيزة جدا ثم تدور أنبوب الشريط إلى أسفل.
    6. تشغيل PCR في ثيرموساير. استخدم المعلمات الموضحة في الجدول 3. ضبط درجة حرارة الصلب بحيث يكون على الأقل 1 درجة مئوية أكثر برودة من درجة حرارة ذوبان التمهيديات.
    7. تخزين المنتج PCR الانتهاء في -20 درجة مئوية (على المدى الطويل) أو المبردة في 4 درجة مئوية (على المدى القصير) حتى الحاجة.
    8. إجراء الكهرباء في 1-5 V/cm لتصور المنتج PCR باستخدام هلام agarose 1.5٪. ترك 2 مل aliquot من المنتج لاستخدامها في تسلسل سانجر.
  3. تنفيذ تسلسل سانجر لتأكيد تقاطع وتحديد نقطة التوقف الدقيقة38.
    1. استخدام المنتج PCR إذا كان PCR إنشاء منتج واحد (الفرقة). بدلا من ذلك، وقطع الفرقة من هلام، وتنقية وتقديم لتسلسل سانجر جنبا إلى جنب مع التمهيدي المستخدمة للتضخيم.
      ملاحظة: يتم استخدام الأورام التي أجريت من أجلها التحاليل الجينومية للزرع في الفئران.

4. الورم وصيانة

  1. إعداد الاستعدادات لgragraft الأورام في نماذج الماوس PDX. حدد للأورام التي سيتم إجراء التحليلات الجينومية أو التي تم إجراؤها.
    1. التأكد من وجود بنية تحتية داعمة في وقت بدء تطوير أي نماذج PDX، بما في ذلك مرافق مختبرية وحيوانية مخصصة، والموظفين التقنيين المهرة وإجراءات التشغيل القياسية التفصيلية.
    2. ضمان النقل السريع وتجهيز العينات والسرعة أمر حاسم لقابلية الخلية وengraftment ناجحة.
    3. استخدام بيئة معقمة للحد من التلوث البكتيرية والفطرية لتجهيز العينات وgrafting.
    4. التعامل مع العينات البشرية بحذر، وفقا للسياسات المؤسسية المتعلقة بمواد الخطر البيولوجي المحتملة، لأنها قد تؤوي مسببات الأمراض المنقولة بالدم.
    5. إعداد الأنسجة (0.5-0.7 سم3 في الحجم) لengraftment عن طريق وضع العينة الجراحية في أنبوب 50 مل قبل المبردة مع 20 مل من وسائل الإعلام ثقافة الأنسجة.
      ملاحظة: يمكن أن تكون الأنسجة الورم جديدة أو تعافى من المواد التي تم تقديمها في وقت سابق5.
    6. تأكيد محتوى الورم في العينة عن طريق استشارة أخصائي علم الأمراض.
    7. ضع أنسجة الورم في طبق يحتوي على 10-15 مل من PBS البارد ، أو وسائل الإعلام ثقافة الأنسجة مثل RPMI 1640 أو DMEM التي تحتوي على المضادات الحيوية (1٪ البنسلين وstreptomycin).
    8. تحديد وعزل مواد الورم القابلة للحياة من الأنسجة الطبيعية والمخروخة المجاورة بمساعدة من أخصائي علم الأمراض. استخدام ملقط معقمة ومشرط لإزالة المواد النخرية التي أشار إليها أخصائي علم الأمراض.
      ملاحظة: يمكن زرع الورم إما داخل الصفاق أو تحت الجلد في الفئران. اتبع الخطوة 4.2 لإجراء عملية زرع داخل الصفاق أو تخطي إلى الخطوة 4.3 لإجراء عملية تجميل تحت الجلد. في هذه الدراسة، تم اختبار العلاجات المستهدفة المختارة استنادًا إلى التحليلات الجينومية في سلسلة من نماذج PDX لسرطان المبيض المصلي عالي الجودة مع زراعة داخل الصف.
  2. إعداد الأنسجة لزرع داخل الصفاق (IP) مفروم الأنسجة مع ملقط معقم ومشرط على الجليد لجعل القطع ما يقرب من 1-1.5 ملم3 في الحجم والاختلاط مع ثقافة الباردة المتوسطة. حقن 0.3-0.5 مل من الطين الورم باستخدام إبرة قياس 16-17.
    ملاحظة: يتم تنفيذ جميع العمليات الجراحية باستخدام تقنيات معقمة. تم استخدام القفازات المعقمة والأدوات المعقمة والإمدادات والمواد المزروعة لتقليل احتمال الإصابة بالعدوى.
    1. خلط القطع 1:1 مع الجليد الباردة ثقافة المتوسطة وحقن 100 مل intraperitoneally في ما لا يقل عن ثلاث فئران SCID الإناث.
  3. قطع أنسجة الورم لgraftment تحت الجلد باستخدام ملقط العقيمة، مشرط، أو مقص الجراحية إلى شظايا صغيرة، ما يقرب من 2 × 2 × 2 ملم في الحجم، ونقل الأنسجة المجزأة إلى طبق بيتري المبردة مسبقا على الجليد.
    1. إضافة مصفوفة غشاء الطابق السفلي الباردة في الطبق مع الأنسجة المجزأة (ما يقرب من 200 مل لكل 10 قطعة من الأنسجة)، اخلط جيدا، والسماح لشظايا الأنسجة نقع في مصفوفة غشاء الطابق السفلي الباردة لمدة 10 دقيقة.
    2. تخدير 5 أنثى NOD / SCID الفئران لإعدادهم لengraftment.
    3. حقن كل فأر intraperitoneally مع الكيتامين (150 ملغ / كغ) و xylazine (10 ملغ / كغ) مزيج.
    4. تأكد من تخدير الماوس بشكل صحيح عن طريق قرص طرف الذيل باستخدام ملقط أضاءة.
    5. إزالة الماوس تخديرا بالكامل بلطف من الغرفة ووضع على الماوس مخروط الأنف الذي لديه مدخلات من المبخر والإخراج من نظام الكسح الغاز النفايات.
    6. وضع مرهم الطبيب البيطري على عيون الماوس لمنع جفاف أثناء التخدير. قم بإعداد المنطقة التي سيتم إجراء الجراحة فيها. استخدام تقنية معقمة لإجراء الجراحة.
    7. تأكد من أن السطح الذي ستأخذه الجراحة غير مسامية ومختومة ويتم تطهيره قبل الجراحة.
    8. بدء عملية جراحية مع معقمة (عن طريق الأوتوكلاف، الغاز أو التعقيم الكيميائي) الأدوات.
    9. استخدام قفازات للتعامل مع الأدوات والحفاظ على عقم نصائح الصك طوال العملية عن طريق غمر لهم في الإيثانول بين خطوات الجراحة.
  4. تعقيم موقع الجراحة عن طريق تطبيق 3 الدعك بالتناوب من اليود والكحول. استخدم مقصًا جراحيًا معقمة وملقطًا لإجراء شق جلدي عمودي من 5 إلى 10 مم على كلا الجناحين من الماوس.
    1. إدراج ملقط مستقيم بلطف في الفضاء تحت الجلد لإنشاء جيب كبير بما يكفي لشظايا الورم ليتم وضعها تحت وسادة الدهون.
    2. استخدام ملقط مستقيمة العقيمة لإدراج شظايا الورم في جيب أعدت سابقا في كل من 5 فئران.
      ملاحظة: ضع 3-4 قطع من أنسجة الورم في جيب واحد.
    3. أغلق شقوق الجلد باستخدام الغراء الأنسجة.
    4. حقن intraperitoneally كل فأر مع 100 مل من Rituximab بعد زرع لمنع انتشار الخلايا الليمفاوية.
  5. ضع الفأر في قفص تحت مصباح حراري لمدة 20 دقيقة تقريبًا حتى يتم استرداده من التخدير. مراقبة الماوس علامات حيوية وضمان الترطيب كافية.
  6. عودة الماوس إلى الشركة من الفئران الأخرى بعد أن تعافى من التخدير وبدأ في الحصول على الطعام والماء. توفير الرعاية والمراقبة بعد الجراحة وفقاً للمبادئ التوجيهية المؤسسية. تحقق من علامات الألم والضيق يوميًا لمدة 3 أيام متتالية بعد الجراحة.
    ملاحظة: معايير الألم أو الضيق تشمل النخر أو التقرح، وفقدان الوزن / تسجيل حالة الجسم، والعلامات السلوكية مثل مستوى النشاط، وظيفة المحرك والموقف.
  7. تحقق بشكل روتيني من الفئران للبحث عن تكوين الورم مرتين في الأسبوع حتى تصل الأورام إلى حجم 0.5 سم في القطر كما يقاس من قبل الفرجار.
  8. تقييم درجة صحة كل فأرة على النحو المستمدة من المظهر والسلوك وحالة الجسم39. استخدام عشرات ≤ 6 كمعايير للفئران المحتضرة التي يجب التضحية بها عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون.

5- اختبار الاستجابات للأهداف المحددة جينياً في نماذج PDX

  1. ابدأ العلاجات المستهدفة المختارة عندما تكون الأورام واضحة وتصل إلى 0.5 سم3 كما تم قياسها بواسطة الفحص بالموجات فوق الصوتية.
    1. قبل إجراء فحص بالموجات فوق الصوتية للبطن إزالة الفراء البطن الماوس وتطبيق مواد التشحيم هلام معقمة.
    2. استخدم جهاز الموجات فوق الصوتية مع محول للحصول على صور مع الورم في القسم المقطعي. إجراء 3 قياسات لكل جلسة لكل ومتوسط القيمة لتقييم أكثر دقة لحجم الورم.
    3. تحليل الصور باستخدام البرمجيات المتاحة40.
  2. إدارة العلاج الكيميائي تتكون من خليط من كاربوبلاتين في 51 ملغ / كغ وpaclitaxel في 15 ملغ / كغ intraperitoneally (الملكية الفكرية) مرة واحدة في الأسبوع لمدة العلاج الكلي من 4-6 أسابيع. تأكد من أن الحجم الإجمالي للحقن لا يتجاوز 0.2 مل.
  3. جعل MK-220641 حل الأسهم في 30٪ cyclodextrin (على سبيل المثال، كابتيسول) وتسليم عن طريق غافاج عن طريق الفم في 120 ملغم / كغم يوميا لمدة 4 أسابيع متتالية.
  4. إعداد الماوس لgavage عن طريق الفم عن طريق عقد ذلك عن طريق معسر الجلد من الظهر وتعلق عليه مرة أخرى، بحيث يتم شل الرأس وأطراف الماوس.
    1. أدخل مسبار الزلاجة أسفل الجزء الخلفي من حنجرة الماوس حتى يصل المسبار إلى المريء. تأكد من عدم إدراج المسبار بعيداً جداً، حيث قد تثقب رئتا الماوس، مما يسبب الوفاة.
  5. جعل MK-866942 حل الأسهم في الإيثانول في 25 ملغ / مل. تميّع في سيارة تحتوي على 5.2٪ توين 80، 5.2٪ PEG400 في الماء المعقم لحقن IP في 10 ملغم / كجم لمدة 5 أيام كل أسبوعين، مع إجمالي مدة العلاج من 4 أسابيع.
    ملاحظة: يجب أن يكون حجم حقن في الفئران 50-120 مل، اعتمادا على وزن الحيوان.
  6. استخدام 7-8 الفئران لكل مجموعة العلاج لديها ما يكفي من القوة الإحصائية للكشف عن الاختلافات43،44.
  7. تقييم وزن الجسم والحالة العامة للفئران في العلاج يوميا. حجب الأدوية إذا انخفض وزن الحيوان 20٪ أو أكثر من وزنه الأولي.
  8. قيّم حجم الورم أسبوعيًا باستخدام المسح بالموجات فوق الصوتية. تأكد من أن الفرد أداء رصد نمو الورم أعمى للعلاج لضمان تسجيل غير متحيز من الاستجابات.
    ملاحظة: قد توظف المختبرات الأصغر شخصين مختلفين لإدارة العلاج ومراقبة الموجات فوق الصوتية.

النتائج

تم جمع الأنسجة من أورام المبيض التي تم استئصالها في وقت عمليات استئصال الاستئصال وفقا لتوجيهات IRB واستخدمت ل1) التوصيف الجينومي و 2) التجمهر في الفئران المثبطة للمناعة(الشكل 1). تم استخدام بروتوكول تسلسل زوج mate-pair36،37 لتحديد التعديلات الهيكلية...

Discussion

نحن وصف النهج والبروتوكولات التي استخدمناها لإجراء "تجربة سريرية" في نماذج PDX التي تستفيد من الخصائص الجزيئية للورم كما تم الحصول عليها من خلال التنميط الجينومي لتحديد أفضل خيار للأدوية للاختبار. وتستخدم حاليا منصات تسلسل متعددة لتوصيف الجينوم للأورام الأولية بما في ذلك تسلسل الجينوم كل?...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس هناك تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر أعضاء مركز مايو كلينك للطب الفردي (CIM) الدكتور لين يانغ وفاي ر. هاريس، MS، على المساعدة في إجراء التجارب. وقد دعم هذا العمل السيد والسيدة نيل إي إيكلز هدية إلى مركز Mayo Clinic للطب الفردي (CIM).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3M Vetbond3M, Co.1469SB
anti-AKT antibodyCell Signaling Technologies, Inc.9272
Anti-GAPDH antibody(G-9)Santa Cruz Biotech. Inc.sc-365062
Anti-MAPK antibodyCell Signaling Technologies, Inc.9926
Anti-phospho-AKT antibodyCell Signaling Technologies, Inc.9271
Anti-mTOR antibodyCell Signaling Technologies, Inc.2972
Anti-Phospho-mTOR antibodyCell Signaling Technologies, Inc.2971
Anti-Phospho-S6 antibodyCell Signaling Technologies, Inc.4858
Anti-Rictor antibodyCell Signaling Technologies, Inc.2114
Anti-S6 antibodyCell Signaling Technologies, Inc.2217
CaptisolChemScene, Inc.cs-0731
CarboplatinNOVAPLUS, Inc.61703-360-18
DMEMMediatech, Inc.10-013-CV
Easy-A Hi-Fi PCR Cloning EnzymeAgilent, Inc.600404-51
LubricantCardinal Healthcare82-280
MatrigelCorning, Inc.356234
McCoy's mediaMediatech, Inc.10-050-CV
MK-2206ApexBio, Inc.A3010
MK-8669ARIAD Pharmaceuticals, Inc.AP23573
Nair Sensitive SkinChurch & Dwight Co.Nair Hair Remover Shower Power Sensitive
NOD/SCID miceCharles River, Inc.NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl
PaclitaxelNOVAPLUS, Inc.55390-304-05
PEG400Millipore Sigma, Inc.88440-250ML-F
PerjetaGenetech, Co.Pertuzumab
RituximabGenetech, Co.Rituxan
RPMI1640Mediatech, Inc.10-040-CV
SCID miceHarlan Laboratories, Inc.C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg
SLAx 13-6MHz linear transducerFUJIFILM SonoSite, IncHFL38xp
SonoSite S-series Ultrasound machineFUJIFILM SonoSite, IncSonoSite SII
Tween 80Millipore Sigma, Inc.P4780-100ML

References

  1. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
  2. Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, 3989-3998 (2007).
  3. Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73, 4885-4897 (2013).
  4. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
  5. Weroha, S. J., et al. Tumorgrafts as in vivo surrogates for women with ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 20, 1288-1297 (2014).
  6. Rubio-Viqueira, B., et al. Optimizing the development of targeted agents in pancreatic cancer: tumor fine-needle aspiration biopsy as a platform for novel prospective ex vivo drug sensitivity assays. Molecular Cancer Therapeutics. 6, 1079-1088 (2007).
  7. Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
  8. Ricci, F., et al. Patient-derived ovarian tumor xenografts recapitulate human clinicopathology and genetic alterations. Cancer Research. 74, 6980-6990 (2014).
  9. Fleming, J. M., et al. Local regulation of human breast xenograft models. Journal of Cellular Physiology. 224, 795-806 (2010).
  10. Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, 451-452 (2015).
  11. Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50, 1-10 (2018).
  12. Sivanand, S., et al. A validated tumorgraft model reveals activity of dovitinib against renal cell carcinoma. Science Translational Medicine. 4, 137-152 (2012).
  13. Pavía-Jiménez, A., Tcheuyap, V. T., Brugarolas, J. Establishing a human renal cell carcinoma tumorgraft platform for preclinical drug testing. Nature Protocols. 9, 1848-1859 (2014).
  14. Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nature Protocols. 7, 1138-1144 (2012).
  15. Cutz, J. C., et al. Establishment in severe combined immunodeficiency mice of subrenal capsule xenografts and transplantable tumor lines from a variety of primary human lung cancers: potential models for studying tumor progression-related changes. Clinical Cancer Research. 12, 4043-4054 (2006).
  16. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73, 5315-5319 (2013).
  17. Butler, K. A., et al. Prevention of Human Lymphoproliferative Tumor Formation in Ovarian Cancer Patient-Derived Xenografts. Neoplasia. 19, 628-636 (2017).
  18. Cao, X., et al. Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain. Immunity. 2, 223-238 (1995).
  19. Dobbin, Z. C., et al. Using heterogeneity of the patient-derived xenograft model to identify the chemoresistant population in ovarian cancer. Oncotarget. 5, 8750-8764 (2014).
  20. Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
  21. Malaney, P., Nicosia, S. V., Davé, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344, 1-12 (2014).
  22. Rosfjord, E., Lucas, J., Li, G., Gerber, H. P. Advances in patient-derived tumor xenografts: from target identification to predicting clinical response rates in oncology. Biochemical Pharmacology. 91, 135-143 (2014).
  23. Braekeveldt, N., Bexell, D. Patient-derived xenografts as preclinical neuroblastoma models. Cell and Tissue Research. 372, 233-243 (2018).
  24. 'Perez-Soler, R., et al. Response and determinants of sensitivity to paclitaxel in human non-small cell lung cancer tumors heterotransplanted in nude mice. Clinical Cancer Research. 6, 4932-4938 (2000).
  25. Fichtner, I., et al. Anticancer drug response and expression of molecular markers in early-passage xenotransplanted colon carcinomas. European Journal of Cancer. 40, 298-307 (2004).
  26. Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21, 1318-1325 (2015).
  27. Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28, 2595-2605 (2017).
  28. Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
  29. Mengelbier, L. H., et al. Intratumoral genome diversity parallels progression and predicts outcome in pediatric cancer. Nature Communications. 27, 6125 (2015).
  30. McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168, 613-628 (2017).
  31. Marusyk, A., et al. Non-cell-autonomous driving of tumour growth supports sub-clonal heterogeneity. Nature. 514, 54-58 (2014).
  32. Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts reflect the microenvironmental hallmarks of aggressive patient tumours. Cancer Letters. 375, 384-389 (2016).
  33. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
  34. Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494, 251-255 (2013).
  35. Girotti, M. R., et al. Application of Sequencing, Liquid Biopsies, and Patient-Derived Xenografts for Personalized Medicine in Melanoma. Cancer Discovery. 6, 286-299 (2016).
  36. Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA Research. 19, 395-406 (2012).
  37. Smadbeck, J. B., et al. Copy number variant analysis using genome-wide mate-pair sequencing. Genes Chromosomes and Cancer. 57, 459-470 (2018).
  38. Kovtun, I. V., et al. Lineage relationship of Gleason patterns in Gleason score 7 prostate cancer. Cancer Research. 73, 3275-3284 (2013).
  39. Paster, E. V., Villines, K. A., Hickman, D. L. Endpoints for mouse abdominal tumor models: refinement of current criteria. Comparative Medicine. 59, 234-241 (2009).
  40. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
  41. Cheng, Y., et al. MK-2206, a novel allosteric inhibitor of Akt, synergizes with gefitinib against malignant glioma via modulating both autophagy and apoptosis. Molecular Cancer Therapeutics. 11, 154-164 (2012).
  42. Rivera, V. M., et al. Ridaforolimus (AP23573; MK-8669), a potent mTOR inhibitor, has broad antitumor activity and can be optimally administered using intermittent dosing regimens. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 1059-1071 (2011).
  43. Heitjan, D. F., Manni, A., Santen, R. J. Statistical analysis of in vivo tumor growth experiments. Cancer Research. 53, 6042-6050 (1993).
  44. Vargas, R., et al. Case study: patient-derived clear cell adenocarcinoma xenograft model longitudinally predicts treatment response. NPJ Precision Oncology. 2, 14 (2018).
  45. Harris, F. R., et al. Targeting HER2 in patient-derived xenograft ovarian cancer models sensitizes tumors to chemotherapy. Molecular Oncology. 13, 132-152 (2019).
  46. Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer and Metastasis Reviews. 13, 209-222 (1994).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

161 xenografts engraftment

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved