JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يطور البروتوكول نموذج ثلاثي الأبعاد (3D) لشريحة تشعبية مع العمود الفقري المتجّن لنمسم اللدونة المتشابكة. شبكة شيدت يمكن استخدامها لنم نمسترات حسابية من AMPA مستقبلات الاتجار في اللدونة متشابك على المدى الطويل باستخدام برنامج خلاط مع CellBlender و MCell.

Abstract

النمذجة الحاسوبية لنشر ورد فعل الأنواع الكيميائية في هندسة ثلاثية الأبعاد (3D) هو وسيلة أساسية لفهم آليات اللدونة متشابك في العمود الفقري التشعب. في هذا البروتوكول ، يتم تصميم بنية 3D مفصلة من التشعبات والعمود الفقري التشعب مع شبكات على برنامج خلاط مع CellBlender. يتم تعريف المناطق متشابك و extrasynaptic على شبكة. بعد ذلك ، يتم تعريف مستقبلات متشابك وجزيئات المرساة متشابك مع ثوابت انتشارها. وأخيرا، يتم تضمين التفاعلات الكيميائية بين مستقبلات متشابك والمراسي متشابك ويتم حل النموذج الحسابي رقميا مع MCell البرمجيات. تصف هذه الطريقة المسار الزماني الزقتي لكل جزيء في بنية هندسية ثلاثية الأبعاد. وهكذا ، فمن المفيد جدا لدراسة الاتجار بمستقبلات متشابك داخل وخارج العمود الفقري المتججر أثناء حدوث اللدونة متشابك. ومن القيود المفروضة على هذه الطريقة أن ارتفاع عدد الجزيئات يبطئ سرعة المحاكاة. النمذجة من الأشواك المتجهّد مع هذا الأسلوب يسمح لدراسة التقوية homosynaptic والاكتئاب داخل العمود الفقري واحد واللدونة غير المتغايرة بين العمود الفقري المتسخة الجار.

Introduction

وقد ارتبطت اللدونة متشابك مع التعلم والذاكرة1. ترتبط اللدونة متشابك، مثل التقوية طويلة الأجل (LTP) والاكتئاب على المدى الطويل (LTD)، على التوالي مع إدراج وإزالة مستقبلات AMPA (AMPA) داخل وخارج الغشاء متشابك2. تقع نقاط الاشتباك العصبي AMPAR على رأس هياكل حجم صغير يسمى العمود الفقري التشعب3. يحتوي كل عمود فقري على منطقة كثيفة البروتين في الغشاء ما بعد المينابك يسمى الكثافة ما بعد المينابك (PSD). البروتينات مرساة في PSD فخ AMPARs في المنطقة متشابك. هناك عدد قليل من نسخ من AMPARs داخل المشبك واحد والاتجار ورد فعل AMPARs مع الأنواع الأخرى في العمود الفقري التشعب هو عملية عشوائية2،4. هناك العديد من النماذج المجزأة من الاتجار مستقبلات متشابك في العمود الفقري التشعب5,6,7,8. ومع ذلك، هناك نقص في النماذج الحسابية العشوائية للاتجار AMPARs المرتبطة باللدونة متشابك في الهياكل ثلاثية الأبعاد من dendrites والعمود الفقري التشعب.

النمذجة الحاسوبية هي أداة مفيدة للتحقيق في الآليات الكامنة في ديناميات النظم المعقدة مثل رد فعل نشر AMPARs في العمود الفقري التشعب خلال حدوث اللدونة متشابك9،10،11،12. ويمكن استخدام النموذج لتصور سيناريوهات معقدة، وتختلف المعلمات الحساسة وجعل التنبؤات الهامة في الظروف العلمية التي تنطوي على العديد من المتغيرات التي يصعب أو من المستحيل السيطرة التجريبية12،13. إن تحديد مستوى التفاصيل لنموذج حسابي هو خطوة أساسية في الحصول على معلومات دقيقة حول الظاهرة على غرار. النموذج الحسابي المثالي هو توازن دقيق بين التعقيد والبساطة لالتقاط الخصائص الأساسية للظواهر الطبيعية دون أن تكون باهظة حسابيًا. يمكن أن تكون النماذج الحسابية المفصلة جدًا مكلفة للحوسبة. ومن ناحية أخرى، فإن النظم التي لا تُفصَّل بشكل جيد يمكن أن تفتقر إلى العناصر الأساسية الضرورية لالتقاط ديناميات هذه الظاهرة. على الرغم من أن النمذجة ثلاثية الأبعاد للعمود الفقري التشعبي هي أغلى من 2D و 1D ، هناك شروط ، كما هو الحال في الأنظمة المعقدة مع العديد من المتغيرات غير الخطية تتفاعل وتنتشر في الوقت والمساحة ثلاثية الأبعاد ، والتي النمذجة على مستوى 3D ضرورية للحصول على رؤى حول أداء النظام. علاوة على ذلك، يمكن تقليل التعقيد بعناية للحفاظ على الخصائص الأساسية لنموذج أقل بعدا.

في نظام العشوائية مع عدد قليل من نسخ من الأنواع في حجم صغير، وديناميات المتوسط للنظام ينحرف عن متوسط ديناميات عدد كبير من السكان. في هذه الحالة، مطلوب النمذجة الحسابية العشوائية من جزيئات التفاعل نشر. هذا العمل يقدم طريقة النمذجة العشوائية رد فعل نشر بضع نسخ من AMPARs في العمود الفقري 3D dendritic. والغرض من هذه الطريقة هو تطوير نموذج حسابي ثلاثي الأبعاد لشريحة تشعبية ذات عمود فقري متشعب وتشابكها لنمس اللدونة المتشابكة.

الأسلوب يستخدم MCell البرمجيات لحل نموذج رقميا، خلاط لبناء شبكات 3D، وScellBlender لإنشاء وتصور المحاكاة MCell، بما في ذلك التفاعل الزقتية نشر الجزيئات في 3D الشبكات14،15،16. Blender هو جناح لإنشاء شبكات وSs.blender هو إضافة على للقاعدة خلاط البرمجيات. MCell هو محاكاة مونتي كارلو لتفاعل نشر جزيئات واحدة17.

يتكون الأساس المنطقي وراء استخدام هذه الطريقة من النمذجة اللدونة متشابك لتحقيق فهم أفضل لهذه الظاهرة في البيئة الدقيقة فيزيائية من العمود الفقري التشعب14. لا سيما, هذا الأسلوب يسمح محاكاة التقوية homosynaptic, الاكتئاب homosynaptic, واللدونة غير المتغايرة بين العمود الفقري التشعب14.

وتشمل ملامح هذه الطريقة نمّس الهيكل الهندسي ثلاثي الأبعاد للدّينة وتشابكها، وانتشارها عن طريق المشي العشوائي، والتفاعلات الكيميائية للجزيئات المُشَكّلة في اللدونة المشبكة. يوفر هذا الأسلوب ميزة إنشاء بيئات غنية لاختبار الفرضيات وإجراء تنبؤات حول عمل نظام غير خطي معقد مع عدد كبير من المتغيرات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذه الطريقة ليس فقط لدراسة اللدونة متشابك ولكن أيضا لدراسة التفاعل العشوائي نشر الجزيئات في هياكل شبكة 3D بشكل عام.

بدلا من ذلك، يمكن بناء شبكات 3D من الهياكل التشعب مباشرة في خلاط من المجهر الإلكتروني إعادة بناء المسلسل18. على الرغم من أن الشبكات القائمة على عمليات إعادة البناء التسلسلية توفر هياكل ثلاثية الأبعاد، فإن الوصول إلى البيانات التجريبية ليس متاحًا دائمًا. وبالتالي، فإن بناء الشبكات المتكيفة من الهياكل الهندسية الأساسية، كما هو موضح في هذا البروتوكول، يوفر المرونة لتطوير أجزاء تشعب مخصصة مع العمود الفقري التشعبي.

طريقة أخرى حسابية بديلة هي محاكاة الكميات الكبيرة من ردود الفعل المختلطة في مجلد منتظم9،10،11،19،20،21،22. المحاكاة السائبة هي فعالة جدا في حل ردود فعل العديد من الأنواع داخل مجلد واحد مختلطةجيدا 23، ولكن النهج السائبة بطيئة للغاية لحل التفاعل نشر الجزيئات داخل العديد من voxels مختلطة جيدا في شبكة عالية الدقة 3D. من ناحية أخرى ، فإن الأسلوب الحالي باستخدام محاكاة MCell من انتشار رد الفعل للجسيمات الفردية يعمل بكفاءة في الشبكات ثلاثية الأبعاد عالية الدقة15.

قبل استخدام هذه الطريقة، ينبغي للمرء أن يتساءل عما إذا كانت الظاهرة التي تمت دراستها تتطلب نهجًا للانتشار والتفاعل العشوائي في شبكة ثلاثية الأبعاد. إذا كانت الظاهرة لديها نسخ قليلة (أقل من 1000) من واحد على الأقل من الأنواع تتفاعل تنتشر في بنية هندسية معقدة مع مقصورات صغيرة الحجم مثل العمود الفقري dendri، ثم النمذجة العشوائية من نشر رد فعل في شبكات 3D هو مناسب للتطبيق.

هناك عدة خطوات مطلوبة لبناء نموذج حسابي ثلاثي الأبعاد لشريحة شريغورية تحتوي على العمود الفقري المتجّن مع اللدونة المتشابكة. الخطوات الرئيسية هي تركيب البرنامج المناسب لبناء النموذج ، وبناء عمود فقري واحد التشعب لاستخدامها كقالب لإنشاء العمود الفقري متعددة ، وخلق قطعة التشعب التي ترتبط مع العمود الفقري التشعب متعددة. الخطوة لنمجة اللدونة متشابك يتكون من إدراج المراسي في منطقة PSD و AMPARs في الجزء التشعب والعمود الفقري التشعب. ثم يتم تعريف التفاعلات الحركية بين المراسي الموجودة في PSD و AMPARs لإنتاج أنواع معقدة من المرساة AMPAR التي تحبس AMPARs في المنطقة المتشابكة. على التوالي ، وزيادة وانخفاض التقارب بين المراسي و AMPARs متشابك خلق عملية LTP و LTD.

Protocol

ملاحظة: الرجاء مراجعة الملف التكميلي 1 للحصول على مسرد المصطلحات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. تثبيت خلاط، CellBlender، و MCell

ملاحظة: يتطلب هذا البروتوكول تثبيت الخلية و Blender و خلاط الخلية.

  1. قم بتنزيل البرنامج وتثبيته على الصفحة الرئيسية لـ MCell (https://mcell.org/tutorials_iframe.html). انتقل إلى التنزيلات في أعلى الصفحة ثم اتبع التعليمات خطوة بخطوة لتنزيل وتثبيت البرنامج في البيئة المفضلة (مثل لينكس أو Mac OSX أو Windows).
    ملاحظة: تم اختبار جميع النماذج الحاسوبية والمحاكاة الموصوفة في هذا البروتوكول على حزمة CellBlender 1.1 التي تتضمن Blender 2.78 مع MCell 3.4 و CellBlender 1.1. هو عمل أيضا على خلاط 2.79b. كل هذه البرامج هي الوصول المفتوح ولا تتطلب إعادة طبع إذن لاستخدامها. تعليمات البناء والمحاكاة للنموذج يمكن أن تتغير قليلا من إصدار واحد إلى آخر. وقد تم تكييف أجزاء من هذا البروتوكول من التشيكية وآخرون16.

2. إنشاء عمود فقري واحد التشعب

ملاحظة: هذا الإجراء يخلق شبكة من العمود الفقري التشعب واحد مع رئيس العمود الفقري والعنق العمود الفقري باستخدام كرة معدلة.

  1. قم بإعداد عرض Blender 3D في اللوحة الرئيسية.
    1. فتح خلاط مع CellBlender مثبتة بالفعل. اضغط 5 على لوحة المفاتيح للتغيير من المنظور إلى العرض المتعامد واضغط على 1 للتغيير إلى طريقة العرض الأمامية. وجهة نظر المنظور لديها عمق، ولكن هذا ليس مطلوبا الآن. يسمح التغيير من المنظور إلى عرض متعامد أفضل التصور من شبكة. اضغط على Shift+ C لتوسيط المؤشر(الشكل 1A).
  2. إنشاء رأس العمود الفقري.
    1. اضغط على Shift+ A لفتح لوحة الشبكة. حدد شبكة ثم حدد الأشعة فوق البنفسجية المجال. كرة الأشعة فوق البنفسجية هي شبكة مرسومة على السطح ثلاثي الأبعاد من الكرة. يمثل مجال الأشعة فوق البنفسجية الرأس الكروي للعمود الفقري التشعبي الفطر. البرنامج يفترض وحدات من مجال الأشعة فوق البنفسجية هي ميكرومتر.
    2. تغيير المعلمات على لوحة إضافة الأشعة فوق البنفسجية اسفير. تغيير الحجم إلى 0.25 وخواتم إلى 32 (الشكل 1B). اضغط + أو - على لوحة المفاتيح على التوالي لتكبير وتصغير التصور من شبكة. بدلا من ذلك، استخدم زر التمرير في الماوس للتكبير والتصغير(الشكل 1C).
      ملاحظة: حجم المعلمة حجم المجال الأصلي و حلقات المعلمة تعريف دقة شبكة.
  3. جعل الجزء العلوي من الرأس شقة.
    1. اضغط على Tab للتبديل بين Blender من وضع الكائن، وضع التفاعل القياسي للكائن، إلى وضع التحرير. العمل في "وضع التحرير" لتعديل مكونات شبكة موجودة.
    2. بمجرد تحديد الشبكة التي تم إنشاؤها تلقائيا، اضغط على لإلغاء تحديد الشبكة التي تم إنشاؤها. اضغط على z لجعل الشبكة شفافة ، مما يساعد في تصور الأجزاء التي سيتم تحريرها. تكبير الشبكة. اضغط ب لتحديد أعلى 3/4 من الكرة مع الماوس (الشكل 2A). اضغط على حذف، حدد القمم، وأدخل لإزالة القمم (الشكل 2B).
    3. اضغط ب وحدد الجزء العلوي. اضغط على eو sو 0، وأدخل لختم الجزء العلوي مع تحديد القمم. نقل السهم الأزرق إلى الأسفل لمحاذاة إلى أعلى رئيس العمود الفقري (الشكل 2C). اضغط على z للتغيير إلى عرض صلب ( الشكل3A). اضغط على 7 للتغيير إلى العرض العلوي.
      ملاحظة: يتم إجراء الجزء العلوي من الكرة مسطحًا لـ نموذج منطقة PSD في رأس العمود الفقري.
  4. لزيادة دقة الشبكة في الجزء العلوي من العمود الفقري حدد أولا أداة وسكين. قطع دائرة مع سكين حول مركز من أعلى (الشكل 3B). حدد أداة وحلقة قص وشريحة. كرر هذه الخطوة أربع مرات لإنشاء أربع دوائر متحدة المركز حول مركز الأعلى(الشكل 3C).
    ملاحظة: يتم استخدام الدوائر متحدة المركز لإضافة voxels جديدة من شأنها زيادة دقة PSD.
  5. إنشاء الرقبة العمود الفقري.
    1. اضغط على a لإلغاء تحديد الشبكة. اضغط على 1 للتغيير إلى طريقة العرض الأمامية. اضغط على z لجعل الشبكة شفافة. اضغط ب ثم حدد الجزء السفلي من شبكة (الشكل 4A). اضغط على حذف و vertices (الشكل 4B). اضغط ب وحدد الجزء السفلي من شبكة (الشكل 4C). اضغط على e و z، -0.45 لإنشاء بثق (الشكل 4D).
      ملاحظة: هذا ينشئ قذف إلى موضع المحور z عند -0.45 ميكرومتر. اضغط على a لإلغاء تحديد الشبكة بالكامل.
    2. اضغط على b وحدد الجزء السفلي من الرقبة. اضغط على eو sو 0 لختم القاع(الشكل 4E). اضغط على a لتحديد الشبكة بالكامل.
  6. اجعل الشبكة متوافقة مع MCell.
    1. اضغط على Crtl + T لتثليث الشبكة. يتم تحويل شبكة إلى مجموعة من مثلثات مترابطة. هذا هو إجراء مطلوب لجعل شبكة متوافقة مع الخلية. حدد أداة وإزالة الزوجي. استخدم أدوات إزالة الزوجي لإزالة الرؤوس المكررة، إن وجدت، التي لها نفس الإحداثيات أو قريبة جداً من بعضها البعض، لجعل الشبكة متوافقة مع MCell.
      ملاحظة: قد يكون تم إنشاء الرؤوس الفائقة المزدوجة بطريق الخطأ أثناء عملية إنشاء شبكة والتحرير.
    2. حدد كائنات الطراز على لوحة CellBlender. تغيير اسم الكائن النشط إلى العمود الفقري واضغط على + لإنشاء العمود الفقري للكائن. على لوحة CellBlender، حدد تحليل شبكة ثم انقر على تحليل شبكة (الشكل 4F). سيقوم هذا الإجراء بتحليل خصائص الشبكة التي تم إنشاؤها، بما في ذلك عدد الرؤوس، الحواف، الوجوه، مساحة السطح، الحجم، وطبولوجيا الشبكة.
      ملاحظة: سوف التحليل طباعة المعلومات في لوحة تحليل شبكة وينبغي أن يكون ماء، المتشعب، والخارج التي تواجه Normals. هذه الخطوة مطلوبة للتأكد من أن شبكة ستعمل على الخلية. وإلا فإن خطوة ربما فاتت. في هذه الحالة، حذف شبكة والبدء من الخطوة 2.1 مرة أخرى.
    3. اضغط على z لتصور عرض صلب للعمود الفقري. اضغط على ملف وحفظ للحصول على نسخة من ملف الخلاط الخاص بك مع العمود الفقري على القرص.
      ملاحظة: أبعاد (أي الطول، القطر، الحجم) من الشبكات هي في ميكرومتر. راجع المسرد لمعنى كل اختصار لوحة المفاتيح.

3. إنشاء dendrite مع العمود الفقري متعددة

  1. إنشاء عمود فقري كما هو موضح سابقا في الأقسام 2.1-2.6. اضغط على a لإلغاء تحديد العمود الفقري. اكتب Shift +C لتوسيط المؤشر.
  2. إنشاء dendrite. اضغط على Shift+ A لفتح لوحة الشبكة. حدد شبكة ثم أسطوانة. تغيير المعلمات في القائمة إضافة اسطوانة: نصف قطر = 0.3 μm، العمق = 2 μm. اضغط على Enter.
    ملاحظة: يتم تعريف نصف قطر المعلمات وعمقها وفقاً للخصائص الهندسية للدغة.
  3. أدخل عمود فقري في التشعب.
    1. الصحافة R واكتب 90 لتدوير الأسطوانة 90 درجة (الشكل 5A). استخدام السهم الأزرق لسحب الاسطوانة إلى أسفل العمود الفقري. اضغط على 3 على لوحة المفاتيح للحصول على عرض أمامي للأسطوانة.
    2. اضغط على z لجعل الشبكة شفافة. استخدام الماوس لتحريك السهم العادي الأزرق من اسطوانة إلى أسفل لنقل قاعدة العمود الفقري إلى المناطق الداخلية من الاسطوانة (الشكل 5B). اضغط على a لإلغاء تحديد كافة الكائنات.
    3. استخدام الزر الأيمن من الماوس لتحديد dendrite (الشكل 5C). حدد معدل على لوحة خلاط (الشكل 5D) ، حدد إضافة معدل. ثم حدد منطقية، وحدد عملية الاتحاد، وحدد العمود الفقري للكائن. اضغط على تطبيق لإنشاء شبكة مشتركة من التشعب والعمود الفقري ( الشكل5E). هذه العملية بإنشاء شبكة جديدة دمج اثنين من الشبكات في واحد واحد.
      ملاحظة: ستكون الشبكة الجديدة هي التشعب والعمود الفقري. يختفي التشعب المعزول عندما يتم الجمع بين الشبكات المختلفة ، ولكن شبكة العمود الفقري المعزولة تظل متداخلة مع الشبكة الجديدة وتستخدم لتوليد نسخ متعددة من نفس العمود الفقري. حذف جميع العمود الفقري المعزول بعد الانتهاء من شبكة. من المهم أن يكون هناك تداخل تام بين رقبة العمود الفقري والتشعب ، وإلا ، لن تكون الشبكة محكمة.
  4. تعيين الكائن dendrite في بيئة CellBlender.
    1. اضغط على a لإلغاء تحديد الشبكات. انقر بزر الماوس الأيمن فوق في dendrite مع الماوس لتحديد dendrite فقط. حدد CellBlender، كائنات طراز، ثم قم بتغيير كائن نشط إلى Dendrite واضغط على + لإنشاء الكائن Dendrite.
  5. أدخل العمود الفقري الجديد في التشعب.
    1. اضغط 1 للتغيير إلى طريقة العرض الجانبية للاسطوانة. استخدام الماوس لتحديد شبكة من العمود الفقري المعزول. لإدراج المزيد من العمود الفقري، اتبع الخطوة 3.3، وتغيير الموضع والزاوية لإدراج كل واحد للحصول على توزيع فسيولوجي.
  6. اجعل الشبكة متوافقة مع MCell. للقيام بذلك، اضغط Tab للانتقال إلى وضع التحرير. اضغط على a لتحديد الشبكة بالكامل. اضغط على Crtl + T لتثليث الشبكة. حدد أداة على لوحة Blender وحدد إزالة الزوجي.
  7. منمنمة الشبكات.
    1. سلاسة شبكة. اضغط على Tab لتغيير وضع الكائن. حدد أداة على لوحة Blender وحدد Smooth. حدد CellBlender، كائنات نموذجية، وحدد إضافة مادة.
    2. جعل شبكة شفافة عن طريق تحديد كائن شفاف و شفاف المادة. تغيير ألفا إلى 0.5 وأدخل لجعل شبكة شفافة جزئيا. اضغط على z للتغيير إلى طريقة العرض الصلبة.
  8. تأكد من ما إذا كانت الشبكة لا تزال متوافقة مع MCell. للقيام بذلك، حدد تحليل شبكة على لوحة CellBlender للتأكد من أن شبكة لا تزال ماء، شبكة متعددة، و الخارج التي تواجه العادي.
  9. حفظ ملف الخلاط dendrite_with_spines.blend.

4. تحديد المناطق السطحية

ملاحظة: ينشئ هذا الإجراء المناطق السطحية للشبكة التي سيتم استخدامها لاحقًا لإعداد كيفية تفاعل المناطق مع الجزيئات.

  1. افتح dendrite_with_spines الملف في بيئة خلاط. للقيام بذلك، حدد ملف، فتح، dendrite_with_spines.blend، وفتح ملف الخلاط.
  2. إعداد الشبكة لتحديد المناطق السطحية. للقيام بذلك، اضغط Tab لتغيير إلى وضع التحرير. اضغط على z للتغيير إلى طريقة العرض الشفافة(تظليل منفذ العرض، الإطار السلكي). اضغط على لتحديد شبكة كاملة من dendrite مع العمود الفقري. حدد كائنات الطراز. حدد Dendrite. اضغط على t لإخفاء لوحة CellBlender وتصور أفضل شبكة كاملة في اللوحة الرئيسية.
    1. استخدم + و – على لوحة المفاتيح للتكبير والتصغير أو التمرير باستخدام الماوس. هذا مطلوب من أجل تصور أفضل من الجزء العلوي من العمود الفقري لتحديد وتحديد المناطق السطحية. اضغط على a لإلغاء تحديد الكائن. اضغط على Tab للتغيير إلى وضع التحرير. اضغط على t لإظهار لوحة CellBlender مرة أخرى.
  3. حدد منطقة سطح PSD. للقيام بذلك، اضغط ب وحدد الجزء العلوي من العمود الفقري التشعب مع الماوس(الشكل 6A, 6B). اضغط على + على مناطق سطحية محددة. تغيير اسم المنطقة إلى PSD1 ثم انقر فوق تعيين (الشكل 6C). اضغط على a لإلغاء تحديد الكائن.
  4. تعريف منطقة السطح الإضافات. للقيام بذلك، اضغط ب وحدد المنطقة المحيطة بأعلى العمود الفقري التشعبي مع الماوس (الشكل 6D). كرر الخطوة 4.3 اسم المنطقة إلى Extra_syn1. كرر الخطوة 4.3 للعمود الفقري الأخرى لتحديد المناطق الأخرى من شبكة (PSD2, PSD3, PSD4, Extra_syn2, Extra_syn3, و Extra_syn4) (الشكل 6F). اضغط على a لإلغاء تحديد الكائن.
  5. تحديد المناطق السطحية لانتهاء التشعب. للقيام بذلك، اضغط b وحدد الطرف الأيسر من dendrite. قم بتغيير اسم المنطقة إلى Left_end وانقر فوق تعيين. اضغط على a لإلغاء تحديد الكائن. اضغط ب وحدد الطرف الأيمن من dendrite (الشكل 6E). قم بتغيير اسم المنطقة إلى Right_end وانقر فوق تعيين.
    ملاحظة: نقل شبكة للبحث عن أفضل موضع لتحديد كل منطقة المعرفة.

5. إنشاء جزيئات

  1. إنشاء AMPARs. للقيام بذلك، حدد الجزيئات على لوحة CellBlender. حدد + على الجزيئات المعرفة لإدراج جزيء جديد وتغيير الاسم إلى AMPAR. تغيير نوع الجزيء إلى جزيء السطح وانتشار ثابت إلى 0.05e-8 سم2/ ثانية14 لتحديد ثابت انتشار AMPARs في الغشاء (الشكل 7A).
  2. إنشاء المراسي. للقيام بذلك، حدد الجزيئات على لوحة CellBlender. حدد + على الجزيئات المعرفة لإدراج جزيء جديد وتغيير الاسم للارتزاء. تغيير نوع الجزيء إلى جزيء السطح وتغيير نشر ثابت إلى 0.001e-8 سم2/ ثانية14 لتحديد ثابت انتشار المراسي في الغشاء (الشكل 7A).
  3. لإنشاء مراسي منضمة إلى AMPARs، حدد الجزيئات على لوحة CellBlender. حدد + على الجزيئات المعرفة لإدراج جزيء جديد. تغيير الاسم إلى anchor_AMPAR. تغيير نوع الجزيء إلى جزيء السطح. تغيير نشر ثابت إلى 0.001e-8 سم2/s14.
  4. إنشاء anchor_LTP و anchor_AMPAR_LTP. للقيام بذلك، كرر الخطوة 5.2. اسم جزيء anchor_LTP. كرر الخطوة 5.3. اسم جزيء anchor_AMPAR_LTP.
    ملاحظة: anchor_LTP له تقارب عالية لـ AMPAR; وهكذا، زيادة AMPARs في المناطق متشابك.
  5. إنشاء anchor_LTD و anchor_AMPAR_LTD. لإنشاء _LTDارتساء،كرر الخطوة 5.2., اسم جزيء anchor_LTD. كرر الخطوة 5.3. اسم جزيء anchor_AMPAR_LTD.
    ملاحظة: anchor_LTD له تقارب منخفض لـ AMPAR; وهكذا، تنخفض AMPARs في المنطقة متشابك.

6. تعريف الطبقات السطحية

ملاحظة: هذا الإجراء تعريف الفئات مع الخصائص المقترنة مع مناطق السطح. وتعكس المناطق الإضافية المراسي والمراسي الحرة المرتبطة بـ AMPAR. النهايات الجانبيه للدنجر تعكس جميع الجزيئات

  1. تعريف خصائص المناطق extrasynaptic.
    1. اضغط على Tab لتغيير وضع الكائن. حدد فئات السطح على لوحة CellBlender. اضغط + على + على السطح فئة لتعريف فئة سطح جديدة.
    2. جعل المنطقة extrasynaptic تعكس AMPAR منضمة إلى جزيئات المرساة.
      ملاحظة: هذا الإجراء سيتم اعتراض المرساة و كل شيء منضمة لهم داخل منطقة متشابك.
      1. تغيير اسم فئة السطح إلى reflective_extra_syn. اضغط على + على reflective_extra_syn خصائص لربطه مع جزيء. حدد الجزيئات | جزيء واحد. حدد anchor_AMPAR. تحديد الاتجاه = تجاهل. حدد النوع = العاكسة لجعل المنطقة تظهر جزيئات anchor_AMPAR.
      2. كرر الخطوة 6.1.2.1 anchor_AMPAR_LTP و anchor_AMPAR_LTD.
    3. جعل المنطقة extrasynaptic تعكس المراسي.
      1. اضغط على + على reflective_extra_syn خصائص لربطه مع جزيء. حدد الجزيئات | جزيء واحد. حدد الارتساء. تحديد الاتجاه = تجاهل. حدد النوع = العاكسة لجعل المنطقة تعكس جزيئات المرساة.
      2. كرر الخطوة 6.1.3.1 anchor_LTP و anchor_LTD.
  2. تعريف خصائص ينتهي dendrite. للقيام بذلك، اضغط + على سطح الفئة لتعريف فئة سطح جديدة. تغيير اسم فئة السطح إلى reflective_ends. اضغط على + على خصائص لربطه مع جزيء. حدد الجزيئات | جميع الجزيئات السطحية. تحديد الاتجاه | تجاهل. اختر النوع | عاكسة لجعلها تعكس جميع الجزيئات السطحية.

7. تعيين الفئات التي تم إنشاؤها لكل منطقة سطحية

ملاحظة: هذه الخطوة بتعيين الفئات السطحية إلى المناطق السطحية.

  1. تعيين خصائص نهايات dendrite.
    1. اضغط على + لتعيين فئة سطحية ذات منطقة. حدد reflective_ends لاسم فئة السطح ( الشكل7C). حدد Dendrite لاسم الكائن. حدد المنطقة المحددة لتحديد المنطقة. حدد Left_end لاسم المنطقة.
    2. كرر الخطوة 7.1.1 Right_end (الشكل 7D).
  2. تعيين خصائص المناطق extrasynaptic.
    1. اضغط على + لتعيين فئة سطحية ذات منطقة. حدد reflective_extra_syn لاسم فئة Surface. حدد Dendrite لاسم الكائن. حدد المنطقة المحددة لتحديد المنطقة. حدد Extra_syn1 لاسم المنطقة.
    2. كرر الخطوة 7.2.1 Extra_syn2 و Extra_syn3و Extra_syn4.

8. مكان الجزيئات على شبكة

ملاحظة: هذه الخطوة يضع AMPARs، المراسي، و AMPAR منضمة إلى المراسي على شبكة.

  1. لوضع جزيئات AMPAR على شبكة، حدد موضع الجزيء على لوحة CellBlender. اضغط على + على مواقع الإصدار/التنسيب لإنشاء موقع إصدار جديد. تغيير اسم الموقع إلى relAMPAR (الشكل 7B). حدد 1,000 جزيء = أمبير. الكائن / المنطقة = Dendrite [ALL]-(Dendrite [Left_end] + Dendrite [Right_end]). Quantity to Release
  2. ضع جزيئات المرساة على شبكة.
    1. حدد وضع الجزيء على لوحة CellBlender. اضغط على + على مواقع الإصدار/التنسيب لإنشاء موقع إصدار جديد. تغيير اسم الموقع إلى rel_anchor_PSD1. حدد جزيء المرساة. الكائن /المنطقة = Dendrite [PSD1]. الكمية إلى الإفراج = 200.
    2. كرر الخطوة 8.2.1 PSD2و PSD3و PSD4.
  3. ضع جزيئات anchor_LTP على شبكة. للقيام بذلك، حدد وضع الجزيء على لوحة CellBlender. اضغط على + على مواقع الإصدار/التنسيب لإنشاء موقع إصدار جديد. تغيير اسم الموقع إلى rel_anchor_LTP_PSD1. حدد جزيء = anchor_LTP. الكائن / المنطقة = Dendrite [PSD1]. الكمية إلى الإصدار = 0.
    ملاحظة: anchor_LTP هو ارتساء مع تقارب الربط عالية AMPARs.
  4. ضع جزيئات anchor_LTD على شبكة بتكرار الخطوة 8.3 anchor_LTD.
    ملاحظة: anchor_LTD هو ارتساء مع تقارب الربط المنخفض لـ AMPARs.

9. إنشاء التفاعلات الكيميائية

  1. خلق رد فعل بين المرساة و AMPARs.
    1. حدد ردود الفعل ( الشكل7D) لإنشاء ردود الفعل. اضغط على + لتضمين رد فعل جديد. reactants = مرساة ' + AMPAR '. رد فعل نوع = <->. وهذا يحدد رد فعل ثنائي الاتجاه. المنتجات = anchor_AMPAR'. معدل التقدم = 0.03. معدل التراجع = 0.05.
  2. إنشاء رد فعل بين ANCHOR_LTP و AMPARs. للقيام بذلك، كرر الخطوة 9.1، ولكن استبدال المرساة مع anchor_LTP، واستخدام معدل للخلف = 0.005 لزيادة التقارب بين reactants.
  3. إنشاء رد فعل بين anchor_LTD و AMPARs وحفظ الملف. للقيام بذلك، كرر الخطوة 9.2، ولكن استبدال الارتساء مع anchor_LTD، واستخدام معدل للخلف = 0.5 لتقليل التقارب بين المتفاعلين. ثم احفظ الملف.

10. رسم إخراج النموذج

  1. المراسي مؤامرة ملزمة AMPARs في PSD1 خلال الحالة القاعدية. للقيام بذلك، حدد إعدادات إخراج الرسم. اضغط على + لتحديد الجزيئات. حدد anchor_AMPAR على جزيء. حدد التشعب على الكائن. حدد PSD1 في المنطقة. كرر الخطوة 10.1 لكافة مناطق PSD.
    ملاحظة: من المفيد ملاحظة العدد القاعدي لـ AMPARs المحاصرين إلى PSD لكل عمود فقري متشعب. عدد المراسي المرتبطة AMPARs يمكن أن تزيد أو تنخفض بالمقارنة مع الظروف القاعدية خلال LTP و LTD.
  2. المراسي مؤامرة ملزمة AMPARs في PSD1 خلال LTP. القيام بذلك بتكرار الخطوة 10.1. استبدال anchor_AMPAR مع anchor_AMPAR_LTP، ثم ربط المراسي مؤامرة إلى AMPARs في PSD1 خلال المحدودة وأخيرا تكرار الخطوة 10.1، ولكن استبدال anchor_AMPAR_LTP مع anchor_AMPAR_LTD.

11. تشغيل المحاكاة

  1. لتشغيل الشرط القاعدي، حدد تشغيل المحاكاة. حدد التكرار = 30,000. تعيين الوقت خطوة = 1e-3 s. اضغط على التصدير وتشغيل. انتظر حتى تنتهي المحاكاة. قد يستغرق من دقائق إلى ساعات.
    ملاحظة: في الحالة القاعدية، لا يوجد إطلاق anchor_LTP وجزيئات rel_anchor_LTD. وفيما يتعلق ببارامترات المحاكاة، فإن عدد التكرارات يجب أن يكون طويلاً بما يكفي لكي يتمكن من ملاحظة انتشار الـ AMPARs من التشعبات ورسوها في PSD. خطوات الوقت الصغيرة هي أكثر دقة ولكن أبطأ لإكمال المحاكاة.
  2. حدد إعادة تحميل بيانات المرئيات. حدد الرسوم المتحركة اللعب لتصور النتائج الزمانية ارقاء ( الشكل8). حدد إعدادات إخراج الرسم. اضغط على قطعة الأرض.
    ملاحظة: الرسوم البيانية التي تم إنشاؤها بواسطة CellBlender هي سلسلة زمنية معزولة من الأنواع الكيميائية المختارة. يمكن استخدام برامج الجهات الخارجية لاستيراد البيانات المحفوظة من عمليات محاكاة متعددة لإنشاء مخططات متراكبة من عدة شروط (على سبيل المثال، القاعدية، LTP، LTD؛ انظر الشكل 8).
  3. تشغيل شرط التقوية homosynaptic (أي، LTP؛ انظر الشكل 8). للقيام بذلك، حدد وضع الجزيء على لوحة CellBlender. حدد rel_anchor_LTP_PSD1 على مواقع الإصدار/الموضع.
  4. تغيير الكمية إلى إصدار = 200. حدد rel_anchor_LTD_PSD1 على مواقع الإصدار/الموضع. تغيير الكمية إلى الإصدار = 0. حدد rel_anchor _PSD1 على مواقع الإصدار/التنسيب. تغيير الكمية إلى الإصدار = 0. كرر الخطوات 11.1-11.2.
  5. تشغيل حالة الاكتئاب homosynaptic (أي، LTD؛ انظر الشكل 8). للقيام بذلك، الإصدار 200 rel_anchor_LTD_PSD1 بدلاً من rel_ANCHOR_LTP_PSD1. قم بتعيين rel_anchor rel_anchor_LTP_PSD1 إلى صفر. كرر الخطوات 11.1-11.2.

النتائج

هذه النتائج توفر الخطوات لبناء شبكة 3D التي تحاكي العمود الفقري التشعب مع الرأس العمود الفقري والعنق(الشكل 1 إلى الشكل 4). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إدراج العمود الفقري متعددة التشعب في جزء واحد التشعب(الشكل 5) لدراسة اللدونة غير المغايرة من AMPARs...

Discussion

تقدم هذه المقالة طريقة لبناء شبكات ثلاثية الأبعاد لـ نمسترات عمليات اللدونة المتشابكة في جزء من التشعب مع العمود الفقري المتجّن. النموذج المطور يحتوي على قطعة التشعب مع عدد قليل من الأشواك التشعب. انتشار الجانبي ورد فعل AMPARs مع المراسي متشابك تسمح محاكاة الديناميات القاعدية. الخطوات الحا?...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل جزئياً من خلال منحة مؤسسة ساو باولو للعلوم (FAPESP) #2015/50122-0 و IRTG-GRTK 1740/2، ومنحة IBM/FAPESP #2016/18825-4، ومنحة FAPESP #2018/06504-4.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BlenderBlender Foundationhttps://www.blender.org/
CellBlenderUniversity of Pittsburghhttps://mcell.org/
McellUniversity of Pittsburghhttps://mcell.org/

References

  1. Sweatt, J. D. Neural plasticity and behavior - sixty years of conceptual advances. Journal of Neurochemistry. 139, 179-199 (2016).
  2. Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320 (5873), 201-205 (2008).
  3. Buonarati, O. R., Hammes, E. A., Watson, J. F., Greger, I. H., Hell, J. W. Mechanisms of postsynaptic localization of AMPA-type glutamate receptors and their regulation during long-term potentiation. Science Signaling. 12 (562), 6889 (2019).
  4. Nair, D., et al. Super-Resolution Imaging Reveals That AMPA Receptors Inside Synapses Are Dynamically Organized in Nanodomains Regulated by PSD95. Journal of Neuroscience. 33 (32), 13204-13224 (2013).
  5. Czöndör, K., et al. Unified quantitative model of AMPA receptor trafficking at synapses. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (9), 3522-3527 (2012).
  6. Triesch, J., Vo, A. D., Hafner, A. S. Competition for synaptic building blocks shapes synaptic plasticity. eLife. 7, 37836 (2018).
  7. Earnshaw, B. A., Bressloff, P. C. Biophysical model of AMPA receptor trafficking and its regulation during long-term potentiation/long-term depression. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12362-12373 (2006).
  8. Earnshaw, B. A., Bressloff, P. C. Modeling the role of lateral membrane diffusion in AMPA receptor trafficking along a spiny dendrite. Journal of Computational Neuroscience. 25 (2), 366-389 (2008).
  9. Antunes, G., Roque, A. C., Simoes-de-Souza, F. M. Stochastic Induction of Long-Term Potentiation and Long-Term Depression. Scientific Reports. 6, 30899 (2016).
  10. Kotaleski, J. H., Blackwell, K. T. Modelling the molecular mechanisms of synaptic plasticity using systems biology approaches. Nature Reviews Neuroscience. 11 (4), 239-251 (2010).
  11. Bhalla, U. S. Molecular computation in neurons: a modeling perspective. Current Opinion in Neurobiology. 25, 31-37 (2014).
  12. Czöndör, K., Thoumine, O. Biophysical mechanisms regulating AMPA receptor accumulation at synapses. Brain Research Bulletin. 93, 57-68 (2013).
  13. Bromer, C., et al. Long-term potentiation expands information content of hippocampal dentate gyrus synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2410-2418 (2018).
  14. Antunes, G., Simoes-de-Souza, F. M. AMPA receptor trafficking and its role in heterosynaptic plasticity. Scientific Reports. 8 (1), 10349 (2018).
  15. Kerr, R. A., et al. Fast monte carlo simulation methods for biological reaction-diffusion systems in solution and on surfaces. SIAM Journal on Scientific Computing. 30 (6), 3126 (2008).
  16. Czech, J., Dittrich, M., Stiles, J. R. Rapid Creation, Monte Carlo Simulation, and Visualization of Realistic 3D Cell Models. Systems Biology. 500, 237-287 (2009).
  17. Stiles, J., Bartol, T., De Schutter, Monte Carlo Methods for Simulating Realistic Synaptic Microphysiology Using MCell. Computational Neuroscience. , (2000).
  18. Jorstad, A., et al. NeuroMorph: A Toolset for the Morphometric Analysis and Visualization of 3D Models Derived from Electron Microscopy Image Stacks. Neuroinformatics. 13 (1), 83-92 (2015).
  19. Antunes, G., Roque, A. C., Simoes de Souza, F. M. Modelling intracellular competition for calcium: kinetic and thermodynamic control of different molecular modes of signal decoding. Scientific Reports. 6, 23730 (2016).
  20. Antunes, G., Roque, A. C., Simoes-de-Souza, F. M. Molecular mechanisms of detection and discrimination of dynamic signals. Scientific Reports. 8 (1), 2480 (2018).
  21. Hoops, S., et al. COPASI--a COmplex PAthway SImulator. Bioinformatics. 22 (24), 3067-3074 (2006).
  22. Faeder, J. R., Blinov, M. L., Hlavacek, W. S. Rule-based modeling of biochemical systems with BioNetGen. Methods in Molecular Biology. 500, 113-167 (2009).
  23. Gillespie, D. T. Exact stochastic simulation of coupled chemical reactions. Journal of Physical Chemistry. 81 (25), 21 (1977).
  24. Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 461-469 (2012).
  25. Matsuda, S., Launey, T., Mikawa, S., Hirai, H. Disruption of AMPA receptor GluR2 clusters following long-term depression induction in cerebellar Purkinje neurons. EMBO Journal. 19 (12), 2765-2774 (2000).
  26. Ahmad, M., et al. Postsynaptic Complexin Controls AMPA Receptor Exocytosis during LTP. Neuron. 73 (2), 260-267 (2012).
  27. Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annual Review of Biochemistry. 76, 823-847 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved