حية الخلية التصوير من Microtubule Cytoskeleton والتلاعب micromechanical من عربيدوبسيس تبادل لاطلاق النار Apical Meristem

Summary

هنا نحن وصف بروتوكول للتصوير الخلية الحية من القشرية المجهرية cytoskeleton في تبادل لاطلاق النار meristem apical ورصد استجابتها للتغيرات في القوات المادية.

Abstract

وقد فهم الخلايا والأنسجة على مستوى التنظيم للنمو وmorphogenesis في طليعة البحوث البيولوجية لعقود عديدة. سمح لنا التقدم في التقنيات الجزيئية والتصويرية بالحصول على رؤى حول كيفية تأثير الإشارات الكيميائية الحيوية على الأحداث المورفوجينية. ومع ذلك، فمن الواضح بشكل متزايد أنه بصرف النظر عن الإشارات الكيميائية الحيوية، الإشارات الميكانيكية تؤثر أيضا على عدة جوانب من نمو الخلايا والأنسجة. وعربيدوبسيس تبادل لاطلاق النار meristem (SAM) هو هيكل القبة على شكل مسؤول عن توليد جميع الأجهزة فوق الأرض. تنظيم الهيكل الخلوي القشري المجهري الذي يتوسط ترسب السليلوز في الخلايا النباتية هو متميز مكانياً. التصور والتقييم الكمي لأنماط ميكروتوبولس القشرية ضرورية لفهم الطبيعة البيوفيزيائية للخلايا في سام، كما السليلوز هو أشد عنصر من جدار الخلية النباتية. الشكل النمطي لتنظيم ميكروتوبول القشرية هو أيضا نتيجة للقوى المادية على نطاق الأنسجة الموجودة في SAM. إن اجتياز هذه القوى المادية وما يتبعها من رصد لتنظيم ميكروتوبول القشري يسمح بتحديد البروتينات المرشحة المشاركة في التوسط في إدراك mechano وtransduction. هنا نحن وصف بروتوكول يساعد في التحقيق في مثل هذه العمليات.

Introduction

الخلايا النباتية محاطة بمصفوفة خارج الخلية من السكريات والسكريات glycoproteins التي تشبه ميكانيكيا مادة الألياف المركبة المعززة قادرة على تغيير خصائصها الميكانيكية بشكل حيوي¹. النمو في الخلايا النباتية هو مدفوع من امتصاص المياه في الخلية، مما يؤدي إلى تراكم متزامن للقوى الشد على جدار الخلية. واستجابة لهذه القوى، فإن التعديلات على الحالة المادية للجدار الخلوي تسمح بتوسيع الخلايا. الخلايا ذات الجدران الأولية قادرة على الخضوع للنمو السريع مقارنة بجدار الخلية الثانوية التي تحتوي على خلايا ويرجع ذلك أساسا إلى الاختلافات في التركيب الكيميائي للبوليسكاريد داخل. تتكون خلايا الجدار الأولية من السليلوز والهيميوللوز والبكتين بالإضافة إلى بروتين الجليكوبروتين، وتفتقر إلى اللجنين، وهو مكون موجود في جدار الخلية^{الثانوية 2}. السليلوز، بوليمر الجلوكوز المرتبطة عبر β-1،4 السندات، هو العنصر الرئيسي من جدران الخلية. يتم تنظيمها في هياكل الفيبريلار التي هي قادرة على تحمل قوى الشد العالية التي شهدتها أثناء نمو الخلايا³. بالإضافة إلى تحمل قوى الشد، يؤدي التعزيز الميكانيكي على طول اتجاه تفضيلي إلى توسع يحركه تورغور على طول محور عمودي على التوجه الصافي للسيليلوز microfibril. ويتأثر تنظيم السليلوز microfibrils من قبل القشرية المجهرية cytoskeleton، لأنها توجه الحركة الاتجاهية للمجمعات السليلوز توليف الموجود في غشاء البلازما⁴. لذلك ، فإن مراقبة منظمة ميكروتوبول القشرية باستخدام بروتين أو طوبولين مرتبط بالميكروبوليه ، يعمل بمثابة وكيل لمراقبة الأنماط المفرطة للسليلوز في الخلايا النباتية.

نقش الهيكل الخلوي القشري المجهري هو تحت سيطرة الخلايا والأنسجة القوى الميكانيكية المشتقة. لا تملك منظمة microtubule القشرية أي منظمة تفضيلية مع مرور الوقت في الخلايا الموجودة في قمة سام، في حين أن الخلايا في المحيط والحدود بين سام والجهاز الناشئ لديها مجموعة مستقرة، منظمة للغاية فوق الخلوية من microtubules القشرية⁵. وقد وضعت عدة نهج لانزعاج جسديا الوضع الميكانيكي للخلايا. يمكن أن يؤدي تغيير الحالة التناضحية ، وكذلك العلاج بالمركبات الدوائية والإزيمية التي تؤثر على صلابة جدار الخلية إلى تغييرات لاحقة في قوى الشد التي تعاني منها الخلية^6،7. استخدام البدع التي تسمح للزيادة التدريجية في القوى الضغط التي تعاني منها الأنسجة هو بديل آخر⁸. كما ثبت تطبيق قوات الطرد المركزي للتأثير على القوى الميكانيكية دون أي اتصال مادي مع الخلايا⁹. ومع ذلك، فإن الوسائل الأكثر استخداما لتغيير قوى الاتجاه في مجموعة من الخلايا الاستفادة من حقيقة أن جميع خلايا البشرة هي تحت التوتر والاستئصال المادي للخلايا سوف القضاء على ضغط تورغور محليا، فضلا عن تعطيل التصاق من خلية إلى خلية، وبالتالي تعديل قوى الشد التي تعاني منها الخلايا المجاورة. ويتم ذلك إما عن طريق استهداف ليزر فوق البنفسجية النبضية عالية الطاقة أو عن طريق إبرة غرامة.

هنا نتوسع في عملية التصوير وتقييم سلوك الميككتوبول القشري للانزعاج الميكانيكي في SAM.

Protocol

1. نمو النبات

1. بذور زرع Arabidopsis التعبير عن مجال microtubule ملزمة تنصهر مع البروتين الفلورسنت الأخضر (MBD-GFP)¹⁰ على التربة والحفاظ في يوم طويل (16 ساعة يوم / 8 ساعة ليلة)، 20 درجة مئوية / 6 درجة مئوية شروط لمدة أسبوع واحد للإنبات.
2. بعد الإنبات، نقل الشتلات إلى الأواني الجديدة مع مساحة كافية للنمو للسماح بنمو نباتي قوي. إبقاء النباتات في يوم قصير (8 ساعات يوم / 16 ساعة ليلة)، 20 درجة مئوية / 16 درجة مئوية شروط لمدة 3-5 أسابيع.
3. نقل النباتات إلى يوم طويل (16 ساعة يوم / 8 ساعة ليلة)، 20 درجة مئوية / 16 درجة مئوية الشروط والاحتفاظ بها حتى مصنع الترباس (2-3 أسابيع). السماح للانفتاح لتنمو تصل إلى 2-5 سم طويلة.

2- الإعداد المتوسط

1. إعداد الأطباق تشريح عن طريق ملء أطباق بيتري الصغيرة (حوالي 5.5 سم واسعة، 1.5 سم عميق) إلى ما يقرب من نصف عمقها مع 2٪ agarose. ويمكن أيضا أن تستخدم الأطباق تشريح لتصوير نقطة زمنية واحدة.
2. إعداد متوسط النمو.
   1. إعداد 50 مل من 1000x فيتامين مخزون الحل مع 5 غرام من ميو-إينوزيتول, 0.05 غرام من حمض النيكوتينيك, 0.05 غرام من هيدروكلوريد البيريدون, 0.5 غرام من هيدروكلوريد الثيامين, و 0.1 غرام من الجليسين.
   2. إعداد متوسط النمو، وتتألف من 1/2 Murashige و Skoog المتوسطة، 1٪ السكروز، 1.6٪ أجار، 1x الفيتامينات، درجة الH = 5.8. أوتوكلاف والسماح لها لتبرد.
   3. على مقعد معقمة ونظيفة، تعقيم صناديق بلاستيكية يتوقف (حوالي 5.2 سم × 5.2 سم × 3 سم) عن طريق الغمر في الإيثانول 70٪ لمدة 15 دقيقة.
   4. على مقعد معقمة ونظيفة، مرة واحدة في المتوسط هو في دفء محتملة، إضافة N6-benzyladenine إلى تركيز النهائي من 200 nM، و 1/1،000 PPM (خليط المواد الحافظة النباتية) ويخلط جيدا. ملء صناديق معقمة إلى ما يقرب من نصف عمقها مع المتوسطة.

3. تشريح SAM

1. قطع الانفلوس وإزالة براعم الزهور القديمة مع ملقط حادة عن طريق تقشير الزهور في قاعدة الpeduncles حتى يكون من الصعب رؤيتها بالعين المجردة.
2. إنشاء شق في agarose في طبق تشريح مع ملقط وزرع قاعدة إينفلورسنس في أجار سميكة. وهذا يعطي دعما قويا جيدا لمزيد من تشريح غرامة من الزهور الأصغر سنا لفضح SAM.
3. إزالة براعم الزهور المتبقية عن طريق دفعها إلى أسفل مع ملقط بدءا من أقدم وتسلسل تتقدم إلى المراحل الأصغر سنا تحت مجهر تشريح حتى SAM مرئيا. وعادة ما يتعرض سام عند إزالة الزهور القديمة تصل إلى المرحلة 6 إلى 7. بمجرد تعرض SAM ، تجنب جفاف العينة عن طريق الانتقال بسرعة إلى الخطوة التالية.

4. نقل ونمو SAMs مثقف

1. زرع عينة تشريح حديثا كما هو مفصل في القسم 1 في وسط النمو في مربع الثقافة المفصلية البلاستيكية المستطيلة مع SAM يتعرض فقط فوق السطح المتوسط. إضافة بضع قطرات من الماء المعقم الأيونية إلى حواف مربعات الثقافة وإغلاق الغطاء للحفاظ على الرطوبة داخل منطقة الجزاء. تأكد من أن المياه المضافة لا تغطي سام.
2. أغلق الغطاء ولف الصندوق بشريط ميكروبور. وضع مربع النمو في يوم طويل أو ظروف اليوم المستمر في 22 درجة مئوية وتنمو لمدة 12-24 ساعة للسماح لسام للتعافي من إجراء تشريح والتكيف مع ظروف الثقافة.

5. تصوير سام

1. املأ مربع الثقافة الذي يحتوي على سام مع المياه الأيونية المعقمة لتغطية العينة. تحقق تحت المجهر تشريح وإزالة أي فقاعات الهواء عن طريق رش المياه بقوة الموجهة إلى العينة مع ماصة 1 مل.
2. ضع مربع الثقافة على مرحلة المجهر confocal تستقيم. الحرص على أن مربع الثقافة لا الاتصال أهداف المجهر. استخدام مسافة طويلة 40x أو 60x عدسة غمس المياه من الفتحة الرقمية 0.8-1 التي هي الأمثل للتصوير دون غطاء الزجاج.
3. خفض الهدف في الماء والتحقق من فقاعات الهواء التي شكلت على عدسة الهدف الأمامي. إزالة أي فقاعات عن طريق خفض المرحلة ومسح بلطف العدسة مع الأنسجة البصرية وإضافة كمية صغيرة من الماء إلى العدسة الأمامية للهدف مع ماصة باستور قبل إعادة توجيهها إلى الماء.
4. باستخدام مرشح GFP ووحدة إنارة التبّي من المجهر confocal، ضبط وحدة تحكم XY لتحديد مكان العينة. ضبط موضع العينين، وضع SAM مباشرة تحت مصدر الضوء والتركيز على طول محور Z حتى يقع قمة.
   ملاحظة: لا تنظر مباشرة إلى الضوء فوق البنفسجي.
5. بمجرد العثور على العينة، تضيء باستخدام ليزر قادر على GFP مثيرة (أي، مصدر ليزر 488 نانومتر أو 496 نانومتر). ضبط التكبير البصري للمجهر بحيث سام بأكملها والمرحلة 1 primordia الأزهار هي في مجال الرؤية. مزيد من ضبط قوة إخراج الليزر وإعدادات كسب لضمان الأمثل نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
   ملاحظة: سوف يؤدي كثافة عالية من الليزر في تبييض الصورة من العينة. تساعد لوحة under-و overexposure على ضمان ضبط أفضل لهذه الإعدادات.
6. السماح للعينة ليستقر لمدة 2-5 دقيقة. الحصول على أكوام من عينة 0.25 ميكرومتر-0.5 μm Z الفواصل الزمنية شريحة في دقة من حجم بكسل 0.3 ميكرومتر تقريبا. تأكد من أن إجمالي وقت التصوير المطلوب للحصول على رصات Z لعينة واحدة لا يتجاوز 10 دقائق من وقت غمر العينة في الماء حتى الانتهاء من عملية الاستحواذ.
7. على الفور إزالة المياه ونقل مربع الثقافة مرة أخرى إلى غرفة النمو. حفظ العينات لفترة طويلة تحت الماء سوف تؤثر على الوضع التناضحي للخلايا.

6. الانزعاج micromechanical من SAM

1. قم بإعداد حالات التصوير كما هو موضح في القسم 5 والحصول على رصات صورة الاستئصال المسبق لمنظمة ميكروتوبول القشرية.
2. decant الماء في طبق الثقافة. إجراء الاستئصال مع إبرة حقنة نظيفة (0.4 مم × 20 ملم).
   1. باستخدام المجهر تشريح، عقد بعناية الإبرة والاقتراب ببطء SAM.
      ملاحظة: يساعد احتجاز التنفس والتعامل مع الإبرة بقبضة مريحة على تجنب الاهتزاز.
   2. اتصل لفترة وجيزة قبة سام مع طرف إبرة للتأكد من أن الاستئصال هو القيام به. ويفضل أن تؤدي الاجتثاث على محيط سام، والذي يسمح التصور السلوك والانتقال من microtubules القشرية غير منظمة في المنطقة الوسطى من القبة.
3. أعد ملء طبق الثقافة بالماء الأيوني العقيم وإضافة مادة البربدييوم إيدويديد (10 ميكروغرام/مل). بالإضافة إلى مراقبة إشارة ميكروتوبول القشرية GFP، يمكن لتصور يوديد البروديسيوم باستخدام قناة منفصلة أن يميز بوضوح مناطق الخلايا المموجة. يتم إضاءة يوديد بروبدييوم باستخدام 561 نانومتر أو أي ليزر مناسب آخر مع الانبعاثات المسجلة بين 600-650 نانومتر.
4. الحصول على كومة الصورة الحق بعد الاجتثاث (انظر القسم 6) وتكرار عملية اقتناء كل 2 ساعة لفترة 6 ح. العودة طبق الثقافة جنبا إلى جنب مع عينة في غرفة الحضانة بعد كل نقطة زمنية. تأكد من وجود بعض المياه المتبقية على وسائل الإعلام والثقافة والتفاف طبق الثقافة مع الشريط micropore لمنع desiccation.

7 - التصور الكمي للبيانات

1. توليد التوقعات السطحية باستخدام البرمجيات المتاحة بحرية مثل MORPHOGRAPHX¹¹، فيجي¹²، أو الماكرو SurfCut¹³.
2. أداء استخراج ميكروتوبول القشرية anisotropy باستخدام فيبريلتول¹⁴ ماكرو في فيجي.
   ملاحظة: يمكن الحصول على بروتوكولات مفصلة لاستخدام البرامج من الاقتباسات ذات الصلة.

النتائج

ويبين الشكل 1 صور الإسقاط النموذجية التي تم الحصول عليها من خطوط MBD-GFP مع خلايا في وسط القبة تحتوي على ميكروتومات القشرية غير منظمة، وخلايا في المحيط مع وجود توزيع محيطي(الشكل 1A,B)، في حين أن خلايا المجال الحدي تحتوي على ميكروتوبولا...

Discussion

إن تقييم أحداث نقل الإشارات الميكانيكية أمر بالغ الأهمية لتحديد المنظمين الجزيئيين المشاركين في إدراك mechano ومسارات النقل. ويوفر البروتوكول الموصوف هنا نظرة كمية لمثل هذه الأحداث باستخدام استجابة ميكروتوبول القشرية كمقرة لمثل هذه العملية في Arabidopsis SAMs. يتم استخدام الإجراء الموضح هنا ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FibrilTool			Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014
FIJI			Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012
glycine	Merck	1.04201.1000
Leica SP8 confocal microscope	Leica	DM6000 CS
MAP4-GFP			Marc, J. et al., Plant Cell 1998
micropore tape	Leukopor	02482-00
MorphographX			Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019
myo-inositol	Sigma	I5125
N6-benzyladenine	Sigma	B3408
nicotinic acid	Sigma	N4126
plastic hinged box	Electron microscopy sciences	64312
PPM (Plant Preservative Mixture)	Plant Cell Technology	PPM
Propidium iodide	Sigma	P4864
pyridoxine hydrochloride	Sigma	P9755
SURFCUT			Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019
thiamine hydrochloride	Sigma	T4625