Imagerie cellulaire en direct du cytosquelette microtubule et manipulation micromécanique de l’Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Résumé

Ici nous décrivons un protocole pour l’imagerie cellulaire vivante du cytosquelette cortical de microtubule au meristem apical de pousse et surveillant sa réponse aux changements des forces physiques.

Résumé

La compréhension de la régulation de la croissance et de la morphogenèse au niveau des cellules et des tissus est à l’avant-garde de la recherche biologique depuis de nombreuses décennies. Les progrès des technologies moléculaires et d’imagerie nous ont permis d’avoir un aperçu de la façon dont les signaux biochimiques influencent les événements morphogenétiques. Cependant, il est de plus en plus évident qu’en dehors des signaux biochimiques, les signaux mécaniques ont également un impact sur plusieurs aspects de la croissance cellulaire et tissulaire. L’Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) est une structure en forme de dôme responsable de la génération de tous les organes en surface. L’organisation du cytosquelette cortical de microtubule qui médie le dépôt apoplastique de cellulose dans les cellules végétales est spatialement distincte. La visualisation et l’évaluation quantitative des modèles des microtubules corticals sont nécessaires pour comprendre la nature biophysique des cellules au SAM, car la cellulose est la composante la plus rigide de la paroi cellulaire végétale. La forme stéréotypée de l’organisation corticale de microtubule est également une conséquence des forces physiques tissulaires existant au SAM. La perturbation de ces forces physiques et la surveillance subséquente de l’organisation corticale de microtubule permettent l’identification des protéines candidates impliquées dans la médiation de la méchano-perception et de la transduction. Ici, nous décrivons un protocole qui aide à étudier de tels processus.

Introduction

Les cellules végétales sont entourées d’une matrice extracellulaire de polysaccharides et de glycoprotéines qui ressemble mécaniquement à un matériau composite renforcé de fibre capable de modifier dynamiquement ses propriétés^{mécaniques 1}. La croissance des cellules végétales est entraînée par l’absorption d’eau dans la cellule, ce qui entraîne une accumulation concomitante de forces tensiles sur la paroi cellulaire. En réponse à ces forces, les modifications apportées à l’état physique de la paroi cellulaire permettent l’expansion cellulaire. Les cellules dont les parois primaires sont capables de subir une croissance rapide par rapport à la paroi cellulaire secondaire contenant des cellules principalement en raison de différences dans la composition chimique des polysaccharides à l’intérieur. Les cellules murales primaires sont composées de cellulose, d’hémicellulose et de pectine en plus des glycoprotéines, et manquent de lignine, un composant présent dans la paroi cellulaire^{secondaire 2}. La cellulose, un polymère de glucose relié par β-1,4 liaisons, est la composante principale des parois cellulaires. Il est organisé en structures fibrilles capables de résister aux fortes forces tensiles rencontrées lors de la croissance cellulaire³. En plus de résister aux forces tensiles, le renforcement mécanique le long d’une direction préférentielle entraîne une expansion entraînée par turgor le long d’un axe perpendiculaire à l’orientation nette du microfibrille cellulose. L’organisation des microfibrilles de cellulose est influencée par le cytosquelette cortical de microtubule, car ils guident le mouvement directionnel des complexes cellulose-synthétisant situés à la membrane^{plasmatique 4.} Par conséquent, la surveillance de l’organisation corticale des microtubules à l’aide d’une protéine ou d’une tubuline associée aux microtubules fusionnée avec une molécule fluorescente sert de substitut à l’observation des modèles de cellulose dans les cellules végétales.

Le modelage du cytosquelette cortical de microtubule est sous le contrôle des forces mécaniques dérivées de la morphologie cellulaire et tissulaire. L’organisation corticale de microtubule n’a aucune organisation préférentielle au fil du temps dans les cellules situées à l’apex du SAM, tandis que les cellules dans la périphérie et la frontière entre le SAM et l’organe émergent ont un tableau supracellulaire stable et fortement organisé des microtubules^{corticals 5.} Plusieurs approches ont été développées pour perturbant physiquement l’état mécanique des cellules. Les changements au statut osmotique, aussi bien que le traitement avec les composés pharmacologiques et enzymatiques qui influencent la rigidité de la paroi cellulaire peuvent avoir comme conséquence des changements suivants dans les forces tensiles éprouvées par^{la cellule 6,7.} L’utilisation d’engins qui permettent l’augmentation progressive des forces compressives éprouvées par les tissus est une autre alternative⁸. Il a également été démontré que l’application de forces centrifuges influence les forces mécaniques sans aucun contact physique avec les^{cellules 9}. Cependant, les moyens les plus largement utilisés de changer les forces directionnelles dans un groupe de cellules profitent du fait que toutes les cellules épidermiques sont sous tension et l’ablation physique des cellules éliminera la pression turgor localement ainsi que perturber l’adhérence cellule à cellule, modifiant ainsi les forces tensiles rencontrées par les cellules voisines. Ceci est effectué soit en ciblant un laser ultraviolet pulsé de grande puissance ou au moyen d’une aiguille fine.

Ici nous élaborons sur le processus de formation image et évaluant le comportement cortical de microtubule pour la perturbation mécanique au SAM.

Protocole

1. Croissance des plantes

1. Semer les graines d’Arabidopsis exprimant le domaine de liaison microtubule fusionné avec la protéine fluorescente verte (MBD-GFP)¹⁰ sur le sol et se maintenir en longue journée (16 h jour /8 h nuit), 20 °C/6 °C conditions pendant 1 semaine pour la germination.
2. Après la germination, transférer les semis vers de nouveaux pots avec suffisamment d’espace de croissance pour permettre une croissance végétative robuste. Gardez les plantes en court jour (8 h jour /16 h nuit), 20 °C/16 °C pendant 3-5 semaines.
3. Transférer les plantes à une longue journée (16 h le jour /8 h la nuit), 20 °C/16 °C et conserver jusqu’à ce que les plantes boulon (2-3 semaines). Laissez l’inflorescence grandir jusqu’à 2-5 cm de long.

2. Préparation moyenne

1. Préparer les plats disséquants en remplissant de petites boîtes de Pétri (environ 5,5 cm de large, 1,5 cm de profondeur) à environ la moitié de leur profondeur avec 2% d’agarose. Les plats disséquants pourraient également être utilisés pour l’imagerie par point unique.
2. Préparer le milieu de croissance.
   1. Préparez 50 mL d’une solution de stock vitaminique de 1 000 x avec 5 g de myo-inositol, 0,05 g d’acide nicotinique, 0,05 g d’hydrochlorure de pyridoxine, 0,5 g d’hydrochlorure de thiamine et 0,1 g de glycine.
   2. Préparer le milieu de croissance, composé de 1/2 Murashige et Skoog moyen, 1% saccharose, 1,6% agar, 1x vitamines, pH = 5,8. Autoclave et laissez-le refroidir.
   3. Sur un banc stérile et propre, stériliser les boîtes en plastique articulé (environ 5,2 cm x 5,2 cm x 3 cm) en immergeant dans 70 % d’éthanol pendant 15 min.
   4. Sur un banc stérile et propre, une fois que le milieu est à la chaleur supportable, ajouter N6-benzyladenine à une concentration finale de 200 nM, et 1/1000 PPM (mélange conservateur végétal) et bien mélanger. Remplissez les boîtes stériles à environ la moitié de leur profondeur avec le milieu.

3. Dissection du SAM

1. Couper l’inflorescence et enlever les bourgeons floraux plus âgés avec des forceps pointus en éplucher les fleurs à la base des péduncles jusqu’à ce qu’il soit difficile de les voir à l’œil nu.
2. Créer une fente dans l’agarose dans le plat disséquant avec des forceps et planter la base d’inflorescence dans l’agar épais. Cela donne un bon soutien solide pour la dissection fine supplémentaire des fleurs plus jeunes pour exposer le SAM.
3. Retirez les bourgeons floraux restants en les poussant vers le bas avec les forceps commençant par les plus anciens et progressant séquentiellement aux stades plus jeunes sous un microscope disséquant jusqu’à ce que le SAM soit visible. Le SAM est habituellement exposé lorsque les fleurs plus anciennes jusqu’au stade 6 à 7 sont enlevées. Une fois le SAM exposé, évitez la déshydratation de l’échantillon en passant rapidement à l’étape suivante.

4. Transfert et croissance des SAM cultivés

1. Plantez l’échantillon fraîchement disséqué tel que détaillé dans la section 1 dans le milieu de croissance dans la boîte de culture articulée en plastique rectangulaire avec le SAM juste exposé au-dessus de la surface moyenne. Ajouter quelques gouttes d’eau déionisée stérile sur les bords des boîtes de culture et fermer le couvercle pour maintenir l’humidité à l’intérieur de la boîte. Assurez-vous que l’eau ajoutée ne couvre pas le SAM.
2. Fermez le couvercle et enveloppez la boîte avec du ruban micropore. Placez la boîte de croissance dans des conditions de longue journée ou de jour continu à 22 °C et cultivez pendant 12-24 h pour permettre au SAM de se remettre de la procédure de dissection et de s’adapter aux conditions de culture.

5. Imagerie du SAM

1. Remplissez la boîte de culture contenant le SAM d’eau déionisée stérile pour couvrir l’échantillon. Vérifiez sous le microscope disséquant et enlevez toutes les bulles d’air en pulvérisant avec force de l’eau dirigée vers l’échantillon à l’aide d’une pipette de 1 mL.
2. Placez la boîte de culture sur une scène de microscope confocal droit. Faites en sorte que la boîte de culture ne communique pas avec les objectifs du microscope. Utilisez une lentille de trempage d’eau 40x ou 60x longue distance de l’ouverture numérique 0,8-1 qui est optimale pour l’imagerie sans verre de couverture.
3. Abaissez l’objectif dans l’eau et vérifiez s’il y a des bulles d’air formées sur la lentille avant de l’objectif. Enlevez les bulles en abaissant le stade et en essuyant doucement la lentille avec un tissu optique et en ajoutant une petite quantité d’eau à la lentille avant de l’objectif avec une pipette Pasteur avant la réinimmersion dans l’eau.
4. À l’aide du filtre GFP et du module d’épi-illumination du microscope confocal, réglez le contrôleur XY pour localiser l’échantillon. En ajustant la position des oculaires, placez le SAM directement sous la source lumineuse et concentrez-vous le long de l’axe Z jusqu’à ce que l’apex soit localisé.
   REMARQUE : Ne regardez pas directement la lumière ultraviolette.
5. Une fois l’échantillon trouvé, illuminez-le à l’aide d’un laser capable de gfp passionnant (c.-à-d., une source laser de 488 nm ou 496 nm). Ajustez le zoom optique du microscope de sorte que l’ensemble sam et l’étape 1 primordia florale sont dans le champ de vision. Ajustez davantage la puissance de la sortie laser et gagnez des réglages pour assurer un rapport signal-bruit optimal.
   REMARQUE : La haute intensité du laser entraînera un blanchiment photo de l’échantillon. La palette de sous-exposition et de surexposition aide à assurer un meilleur ajustement de ces paramètres.
6. Laisser l’échantillon se déposer pendant 2-5 min. Acquérir des piles de Z confoccales de l’échantillon à des intervalles de tranches de Z de 0,25 μm-0,5 μm À une résolution d’environ 0,3 μm de pixel. Assurez-vous que le temps total d’imagerie requis pour l’acquisition des piles Z pour un échantillon ne dépasse pas 10 minutes à partir du moment où l’échantillon est immergé dans l’eau jusqu’à la fin de l’acquisition.
7. Retirez immédiatement l’eau et transférez la boîte de culture à la chambre de croissance. Le maintien des échantillons longtemps sous l’eau influencera l’état osmotique des cellules.

6. Perturbation micromécanique du SAM

1. Configurer les conditions d’imagerie décrites dans la section 5 et acquérir des piles d’images de préablation de l’organisation corticale des microtubules.
2. Décanter l’eau dans le plat de culture. Effectuer l’ablation à l’aide d’une aiguille de seringue propre (0,4 mm x 20 mm).
   1. À l’aide d’un microscope disséquant, maintenez soigneusement l’aiguille et approchez lentement du SAM.
      REMARQUE : Retenir le souffle et manipuler l’aiguille avec une poignée détendue permet d’éviter de trembler.
   2. Communiquez brièvement avec le dôme SAM avec la pointe de l’aiguille pour confirmer que l’ablation est terminée. Effectuer de préférence l’ablation à la périphérie du SAM, ce qui permet la visualisation du comportement et la transition des microtubules corticals non organisés dans la région centrale du dôme.
3. Remplir le plat de culture d’eau déionisée stérile et ajouter l’idodide propidium (10 μg/mL). En plus de surveiller le signal cortical de microtubule de GFP, visualiser l’iodure de propidium à l’aide d’un canal distinct peut clairement marquer les régions des cellules ablées. Propidium iodure est éclairé à l’aide de la 561 nm ou tout autre laser approprié avec émission enregistrée entre 600-650 nm.
4. Acquérir des piles d’images juste après l’ablation (voir la section 6) et répéter le processus d’acquisition toutes les 2 h pour une période de 6 h. Retourner le plat de culture avec l’échantillon dans la chambre d’incubation après chaque point de temps. Assurez-vous qu’il reste un peu d’eau sur les supports culturels et enveloppez le plat de culture avec du ruban micropore pour empêcher la dessication.

7. Visualisation et quantification des données

1. Générer des projections de surface à l’aide de logiciels disponibles gratuitement tels que MORPHOGRAPHX¹¹, FIJI¹², ou macro SurfCut¹³.
2. Effectuer l’extraction de l’anisotropie microtubule corticale à l’aide de FibrilTool¹⁴ macro aux FIDJI.
   REMARQUE : Des protocoles détaillés pour l’utilisation du logiciel peuvent être obtenus à partir des citations respectives.

Résultats

La figure 1 montre des images de projection typiques obtenues à partir de lignes MBD-GFP avec des cellules au centre du dôme contenant des microtubules corticals désorganisés, et des cellules à la périphérie ayant une distribution circonférentielle (figure 1A,B), tandis que les cellules du domaine limite contiennent des microtubules corticals alignés parallèlement au long axe de la cellule. Ces observat...

Discussion

L’évaluation des événements de transduction du signal mécanique est cruciale pour identifier les régulateurs moléculaires impliqués dans les voies de mécano-perception et de transduction. Le protocole décrit ici fournit une vue quantitative de tels événements en utilisant la réponse corticale de microtubule comme lecture pour un tel processus dans arabidopsis SAMs. La procédure décrite ici est couramment utilisée dans plusieurs études dans divers types de tissus^16,<...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
FibrilTool			Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014
FIJI			Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012
glycine	Merck	1.04201.1000
Leica SP8 confocal microscope	Leica	DM6000 CS
MAP4-GFP			Marc, J. et al., Plant Cell 1998
micropore tape	Leukopor	02482-00
MorphographX			Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019
myo-inositol	Sigma	I5125
N6-benzyladenine	Sigma	B3408
nicotinic acid	Sigma	N4126
plastic hinged box	Electron microscopy sciences	64312
PPM (Plant Preservative Mixture)	Plant Cell Technology	PPM
Propidium iodide	Sigma	P4864
pyridoxine hydrochloride	Sigma	P9755
SURFCUT			Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019
thiamine hydrochloride	Sigma	T4625