JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

انخفاض بروتيوستاتيكي هو السمة المميزة للشيخوخة، وتسهيل ظهور الأمراض العصبية. نحن الخطوط العريضة لبروتوكول لقياس قياس كميا proteostasis في اثنين من مختلف الأنسجة Elegans Caenorhabditis من خلال التعبير heterologous من polyglutamine يكرر تنصهر لمراسل الفلورسنت. يسمح هذا النموذج بسرعة في التحليل الجيني في الجسم الحي للبروتيوستاسي.

Abstract

القدرة على الحفاظ على وظيفة سليمة وقابلة للطي من البروتيوم (البروتين التوازن) تنخفض خلال الشيخوخة العادية، مما يسهل ظهور عدد متزايد من الأمراض المرتبطة بالعمر. على سبيل المثال، البروتينات مع توسعات البوليغلوتامين عرضة للتراكم، كما يتضح من بروتين هنتنغتين وما يصاحبه من بداية مرض هنتنغتون. وقد درس على نطاق واسع تدهور المرتبطة بالعمر من البروتيوم من خلال استخدام elegans Caenorhabditis المعدلة وراثيا التعبير عن polyQ يكرر تنصهر إلى بروتين الفلورسنت الأصفر (YFP). هذا النموذج الحيواني المعدل وراثيا polyQ::YFP يسهل القياس الكمي المباشر للانخفاض المرتبط بالعمر من البروتيوم من خلال تصوير التكوين التدريجي لل البؤر الفلورية (أي مجاميع البروتين) وظهور عيوب الحركة اللاحقة التي تتطور نتيجة لانهيار البروتيوم. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون التعبير عن المتحول متعدد التخصصات: YFP مدفوعا بجهات مروجة خاصة بالأنسجة ، مما يسمح بتقييم البروتيوستاسي عبر الأنسجة في سياق كائن حي متعدد الخلايا سليم. هذا النموذج قابل للغاية للتحليل الجيني ، وبالتالي توفير نهج لتحديد حجم الشيخوخة التي تكمل اختبارات العمر. نحن نصف كيفية قياس بدقة متعدد الأضلاع::تشكيل بؤر YFP داخل الخلايا العصبية أو عضلة جدار الجسم أثناء الشيخوخة، وظهور العيوب السلوكية اللاحقة. بعد ذلك، نسلط الضوء على كيفية تكييف هذه النهج مع الإنتاجية العالية، والتطبيقات المستقبلية المحتملة باستخدام استراتيجيات ناشئة أخرى للتحليل الجيني C. elegans.

Introduction

البروتين التوازن (بروتيوستسيس) يعرف بأنه القدرة الخلوية للحفاظ على وظيفة مناسبة وقابلة للطي من البروتيوم. التحدي الكامن في البروتيوستاسيس هو ضمان طي جميع البروتينات بشكل صحيح والحفاظ عليها في تشكيل أصلي ، والذي يتم تضخيمه بشكل أكبر من خلال الطبيعة المتنوعة لحجم البروتين ، وتكوين الأحماض الأمينية ، والتكوين الهيكلي ، والاستقرار ، والدوران ، والتعبير ، والتجزيء دون الخلوي ، والتعديلات1. يتم الحفاظ على بروتيوستسيس من خلال العمل المنسق لشبكة بروتيوستاتيكي كبيرة، تتكون من ما يقرب من 2000 البروتينات الفريدة، والتي تنظم التوليف السليم، للطي، والاتجار، وتدهور داخل البروتيوم2،3. مكونات حصان العمل من شبكة بروتيوستاتيكي هي تسع عائلات رئيسية من المرافقين الجزيئية4. كل نوع من الأنسجة والخلايا يستخدم بشكل تفضيلي مجموعات فرعية محددة من المرافقين الجزيئية، ويفترض أن يتماشى مع مطالب مختلفة من البروتيوم متميزة5.

إحدى السمات المميزة للشيخوخة الطبيعية للكائنات الحية هي الانخفاض التدريجي وانهيار داء البروتيستاسيس الخلوي ، والذي يعتقد أنه أساس أساسي لظهور وتطور عدد متزايد من الأمراض المرتبطة بالعمر. على سبيل المثال، مرض الزهايمر، مرض باركنسون، مرض هنتنغتون، والتصلب الجانبي الضموري (ALS) تشترك في سمة مشتركة: في كل حالة من مظاهر التجدد العصبي مدفوعة التعديلات الوراثية التي تهيئ بروتين متحولة لتجميع (اميلويد-β/تاو، α-سينوكلين، HTT، FUS/TBD-43/SOD-1، على التوالي)6و7و8و9و10 . أثناء الشيخوخة ، تنخفض سلامة الشبكة البروتيوستيكية وعدم قابليتها للانحلال ، مما يؤدي إلى تراكم المجاميع البروتيوتوكسية التي تؤدي إلى خلل وظيفي في الخلايا وتجدد الأعصاب. من الجدير بالذكر أن أمراض تشكيل البروتين ليست فريدة من نوعها للخلايا العصبية ، وتحدث عبر أنسجة متعددة ، كما أبرزها مرض السكري من النوع الثاني ، والمايلوما المتعددة ، والتليف الكيسي11،12،13،14. ولذلك، فإن توضيح الآليات القادرة على الحفاظ على البروتيوستاسي سيسهل تطوير التدخلات المستهدفة لعلاج المرض وتعزيز الشيخوخة الصحية.

التربة الصغيرة nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) كان له دور فعال في اكتشاف الجينات وتوضيح المسارات التي تغير البروتيوستاسي. يتم الحفاظ على العديد من مكونات الشبكة البروتيوستاتيكية ومسارات نقل الإشارات التي تنظم البروتيوستازي تطوريا. وعلاوة على ذلك، قللت سي إليغانز من التعقيد والتكرار مقارنة بالنظم الفقارية، مما جعلها أكثر قابلية للتحليل الجيني واكتشاف الجينات. وتشمل المزايا الإضافية ل C. elegans التي أدت إلى استخدامه على نطاق واسع كنظام نموذجي لدراسة داء البروتيوستاسي: الجينوم الوراثي والوظيفي القوي ، ودورة حياة قصيرة (3 أيام) والعمر (3 أسابيع) ، والجينوم المدمج والشروح جيدا ، وتوافر مجموعة واسعة من المسوخ الوراثية ، وسهولة تصور التغيرات الخاصة بالأنسجة في بيولوجيا الخلايا باستخدام المراسلين الفلوريين.

يمكن قياس الاضمحلال التدريجي للبروتيوستاسي أثناء الشيخوخة بسهولة في C. elegans. أظهر مختبر موريموتو لأول مرة أن توسع البوليglutamine تنصهر إلى البروتين الفلوري الأصفر(polyQ::YFP)يمكن استخدامها لقياس الانخفاض البروتيوستاتيكي في C. elegans خلال الشيخوخة15،16،17،18. YFP الانصهار إلى 35 يكرر الجلوتامين أو أكثر نتيجة في تشكيل المرتبطة بالعمر من بؤر الفلورسنت جنبا إلى جنب مع علامات علم الأمراض الخلوية. وتجدر الإشارة إلى أن هذه المجموعة من توسع الجلوتامين تعكس طول المسالك البوليغلوتامين من بروتين هنتنغتين الذي يبدأ فيه رصد أمراض مرض هنتنغتون في البشر (عادة >35 CAG يكرر)19. وقد استخدمت سلالات مع التعبير عن polyQ::YFP داخل العضلات, الأمعاء, أو الخلايا العصبية للتأكد من أن الانخفاض المرتبط بالعمر من البروتيوستاسي يحدث عبر أنواع مختلفة من الخلايا والأنسجة. العضلات محددة polyQ::YFP التعبير (أي unc-54p::Q35::YFP)كان المراسل الأكثر استخداما على نطاق واسع الأنسجة محددة, كما تراكم بؤر الفلورسنت من السهل تحديد كميا خلال الأيام القليلة الأولى من مرحلة البلوغ باستخدام المجهر تشريح الفلورسنت بسيطة (الشكل 1A-1B). بالإضافة إلى ذلك ، تصبح الحيوانات مشلولة خلال منتصف العمر ، حيث ينهار البروتيوم داخل العضلات بسبب التأثير البروتيوتوكسي للمراسل(الشكل 1C). وبالمثل، يمكن أن يتبع الانخفاض المرتبط بالعمر في البروتيوستاسيس العصبي(rgef-1p::Q40::YFP)عن طريق التحديد الكمي المباشر لل البؤر / التكوين الكلي والانخفاضات المرتبطة بالعمر في الانحناءات المنسقة للجسم بعد وضع الحيوانات في السائل(الشكل 2).

هنا، نقدم بروتوكول مفصل حول كيفية قياس التقدم المعتمد على العمر من تراكم البروتين الكلي والسمية البروتوتوكسية المرتبطة الناجمة عن التعبير عن البوليغلوتامين يكرر داخل الأنسجة العصبية والعضلات في C. elegans. نحن نقدم أمثلة على النتائج النموذجية التي تم إنشاؤها باستخدام هذه السلالات والأساليب. علاوة على ذلك ، نظهر كيف استخدمنا هذه الأساليب لدراسة التنظيم النسخي للشبكة البروتيوستاتيكية. نناقش طرقا إضافية يمكن من خلالها دمج هؤلاء المراسلين بسهولة مع الكواشف الموجودة الأخرى أو تكييفها لشاشات أكبر.

Protocol

1. إعداد الكواشف

  1. اختر الجينات ذات الأهمية التي سيتم تعطيلها عن طريق RNAi القائم على التغذية. شراء مخزونات من HT115 E. القولونية التي تحتوي على استنساخ RNAi منالفائدة 20. بدلا من ذلك، subclone cDNA من الجين من الفائدة في موقع متعدد النسيلة من البلازميد L4440.
    ملاحظة: لمنع تدهور dsRNA داخل البكتيريا، استخدم سلالة HT115. هذا هو RNase الثالث ناقص E. القولونية سلالة مع IPTG-inducible T7 نشاط البوليميراز. بالنسبة لدراسات البروتيوستاسي التي لا تستخدم ال RNAi القائم على التغذية، يمكن استخدام إما HT115 أو OP50 E. coli على لوحات NGM القياسية.
  2. إعداد لوحات 5 × 6 سم لكل حالة اختبار. للتجارب باستخدام RNAI، حث إنتاج dsRNA في تحويل HT115 E. القولونية. للدراسات التي لا RNAi، يمكن استخدام OP50 E. coli على لوحات NGM القياسية (انظر الملف التكميلي 1 لوصفات لوحة NGM و RNAi القياسية).
    ملاحظة: يمكن تخزين لوحات RNAi عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لعدة أشهر قبل البذر بالبكتيريا.
  3. زراعة ثقافات الإشريكية القولونية بين عشية وضحاها (16-20 ساعة) عند 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز عند 220 دورة في الدقيقة. تنمو HT115 E. القولونية في مرق لوريا (LB) مع أمبيسلين (50 ميكروغرام / مل).
    ملاحظة: معيار OP50 E. القولونية ليست مقاومة للمضادات الحيوية، ولكن المتغيرات مقاومة الستربتومايسين متوفرة أيضا.
    1. تركيز البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 2400 × ز لمدة 15-20 دقيقة في جهاز الطرد المركزي benchtop، يستنشق supernatant، وإعادة تعليق بيليه في 1/10 th حجمالبداية (أي، تركيز 10x) من LB مع أمبيسيلين لHT115، أو LB دون أمبيسلين لمعيار OP50.
    2. Aliquot 200 ميكرولتر من البكتيريا المركزة 10x إلى كل لوحة (3-4 يكرر لكل حالة اختبار، مع 2 لوحات احتياطية إضافية، لاستخدامها في حالة التلوث).
    3. السماح لوحات مفتوحة لتجف في بيئة نظيفة مثل مقعد تدفق صفح حتى يتم امتصاص جميع السائل أو السماح لوحات مغطاة لتجف على مقاعد البدلاء مختبر بين عشية وضحاها.
  4. بالنسبة لأطباق RNAi المصنفة المجففة في غطاء محرك السيارة ، قم بتخزين الأطباق المجففة داخل صندوق دودة بين عشية وضحاها (حتى 24 ساعة) في درجة حرارة الغرفة. بعد يوم واحد في RT، يمكن تخزين الأطباق عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين في كيس مختوم (لمنع جفاف الألواح). قبل الاستخدام، اسمح للوحات المخزنة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية بالعودة إلى درجة حرارة الغرفة داخل كيس القفل البريدي لمنع التكثيف من إدخال التلوث الفطري المحمول جوا.
    1. عند استخدام RNAi القائم على التغذية، اترك بكتيريا HT115 المصنفة على لوحات RNAi في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة على الأقل قبل إضافة C. elegans. تحتوي لوحات RNAI على IPTG ، مما يحفز إنتاج dsRNA. بدلا من ذلك، يمكن إضافة IPTG إلى الثقافات السائلة في نهاية الخطوة 1.3.1، قبل ساعتين من البذر.
    2. تجنب التخزين طويل الأجل من لوحات HT115 المبذر في درجة حرارة الغرفة (أكبر من بضعة أيام) لتجنب تكسير أجار من شأنها أن تسبب C. elegans لحفر في أجار.

2. تزامن سي إليجانس

ملاحظة: اختر ما إذا كان لمزامنة C. elegans إما عن طريق علاج الهيبوكلوريت القلوية من البالغين gravid أو وضع البيض.

  1. مزامنة الحيوانات عن طريق معالجة هيبوكلوريت من الحيوانات البالغة gravid لتعزيز الافراج عن الأجنة22.
    1. لعلاج هيبوكلوريت، غسل hermaphrodites gravid 2 مرات مع العازلة M9، ثم resuspend في محلول هيبوكلوريت 5 مل (3.25 مل من محلول هيبوكلوريت، 1 مل من العازلة M9 و 0.75 مل من 5 M NaOH) لمدة 5 دقائق، يهز الحيوانات المكروبة كل دقيقة. بعد 5 دقائق، تدور أسفل الحيوانات ويغسل 3 مرات مع المخزن المؤقت M9.
      ملاحظة: وقد افترض علاج هيبوكلوريت أن تؤثر على بروتيوستاسي21.
    2. بعد علاج هيبوكلوريت، اسمح للأجنة بالفقس بين عشية وضحاها في محلول M9 3 مل مع الدوران عند 20 درجة مئوية.
    3. حساب كثافة الحيوانات L1 (أو بدلا من ذلك، الأجنة) لكل ميكرولتر عن طريق إسقاط 10 ميكرولتر من محلول L1 3x على لوحة 6 سم وحساب عدد الحيوانات L1 لحساب متوسط عدد الحيوانات L1 لكل μL. سوف تستقر الحيوانات L1 مع مرور الوقت. لذلك، بشكل دوري خلط حلول L1 لتجنب تسوية.
    4. البذور 50 L1 الحيوانات لكل لوحة، عد وتسجيل عدد المصنفين، ونقل لوحات إلى حاضنة 20 درجة مئوية. من المهم معرفة العدد الفعلي للحيوانات على كل طبق في بداية الفحص.
      ملاحظة: مزامنة الحيوانات L1 عن طريق الفقس بين عشية وضحاها في M9 يستخدم بشكل روتيني لأنه يقلل من عدم التجانس التنموي بعد وضع الحيوانات على الغذاء. ومع ذلك، يحدث التزامن من خلال الاعتقال التنموي استجابة لإشارات المجاعة، والتي ينبغي تجنبها بالنسبة لبعض الدراسات (انظر23 لمزيد من المناقشة). كبديل، يمكن الحصول على الحيوانات المتزامنة تقريبا من خلال وضع البيض، انظر 2.2.
    5. تجميد وتخزين بقايا الحيوانات L1 في النيتروجين السائل أو الفريزر -80 درجة مئوية. وبهذه الطريقة، يتم الحفاظ على عينة من كل سلالة في وقت الإعداد التجريبي، وخلق مورد قيم للدراسات المستقبلية وتحسين القابلية للاستنساخ.
      ملاحظة: انظر الملف التكميلي 1 لوصفات حل هيبوكلوريت و M9.
  2. لمزامنة الحيوانات عن طريق وضع البيض، ضع 20 حيوانا بالغا صغيرا (اليوم الأول من البلوغ) على كل طبق لمدة 4-6 ساعات، والسماح لهم بوضع البيض حتى يكون هناك ما يقرب من 50 بيضة لكل طبق. إزالة جميع البالغين gravid ونقل لوحات مع البيض إلى حاضنة 20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب مزامنة الحيوانات البالغة gravid في اليوم الأول من مرحلة البلوغ. قد تضع الحيوانات القديمة البيض الذي تم الاحتفاظ به في الرحم ، مما يسبب إطلاق البويضات التي هي في مرحلة نمو أكثر تقدما.

3. إنتاج ذرية

ملاحظة: يجب اتخاذ خطوات لمنع إنتاج السلف أو لفصل السكان بدء متزامنة من ذريتهم. يمكن تحقيق منع إنتاج ذرية كيميائيا مع إضافة 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR) إلى لوحات، وهو ما هو موضح هنا. وأفادت بعض الدراسات أن FUdR يمكن أن يغير البروتيوستسيس24،25. وفيما يلي مناقشة للنهج البديلة لمنع إنتاج السلف.

  1. جعل محلول الأسهم 1000x من FUdR عن طريق حل 1 غرام من FUdR إلى 10 مل من ultrapure H2O. تصفية تعقيم المخزون FUdR مع مرشح 0.2 ميكرومتر وحقنة 10 مل. Aliquot 1 مل من المخزون في أنبوب معقم 1.5 مل. تجميد وتخزين في -20 درجة مئوية.
  2. زراعة الحيوانات في 20 درجة مئوية حتى المرحلة L4. تتطلب N2 التي يتم تربيتها من L1s المتزامنة من معالجة الهيبوكلوريت ما يقرب من 40 ساعة من النمو عند 20 درجة مئوية للوصول إلى L4. وينبغي اختبار معدلات النمو للسلالات الأخرى تجريبيا قبل التجريب. للحصول على تفاصيل حول كيفية المرحلة بدقة C. elegans انظر26.
    1. لكل صفيحة 6 سم مع L4، أضف 100 ميكرولتر من 80x FUdR. من المهم إضافة FUdR في مرحلة L4.
  3. عودة لوحات إلى مربع دودة ووضع مربع في كيس الرمز البريدي قفل. العودة إلى الحاضنة المناسبة.

4. قياس الانخفاض في النتوءات في الأنسجة العضلية باستخدام الحيوانات التي تعبر عن البوليغلوتامين

ملاحظة: يمكن استخدام طريقتين لتحديد انخفاض البروتيوستاسيس في خلايا العضلات: تصوير تكوين مجاميع البروتين أثناء الشيخوخة (4.1) وقياس السمية البروتية التي تسببها هذه المجاميع مع التقدم في العمر من خلال بداية الشلل (4.2).

  1. تصوير تشكيل بوليغلوتامين الكلي في العضلات أثناء الشيخوخة
    ملاحظة: يتم تصوير التقدم المعتمد على العمر لتجميع البروتين في خلايا العضلات باستخدام البوليغلوتامين (polyQ) الذي يتم دمجه في بروتين فلوري أصفر (YFP). يحدد هذا البروتوكول استخدام سلالة AM140 rmIs132 [unc-54p::Q35::YFP]، ولكن يمكن أيضا استخدام سلالات متغيرة أخرى من البوليغلوتامين. يتم التعبير عن polyQ::YFP transgene في العضلات باستخدام المروج العضلات unc-54 محددة. متزامنة unc-54p::p olyQ::YFP التعبير عن الحيوانات يتم تصور في اليوم 1, 2, 3 و 4 من مرحلة البلوغ. لتصور unc-54p::p olyQ::YFP المجاميع، واستخدام المجهر المركب مجهزة للفلورسينس أو المجهر تشريح الفلورسنت. AM140 متاح من مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC) في: https://cgc.umn.edu/strain/AM140.
    1. في أيام التصوير (اليوم 1 و2 و3 و4 من مرحلة البلوغ)، اختر 20 حيوانا وا جبل على إعداد شريحة المجهر مع لوحة agarose 3٪ وانخفاض 5 ميكرولتر من 10 mM الصوديوم azide (المخفف في المخزن المؤقت M9).
    2. بعد أن شلت جميع الحيوانات بواسطة azide الصوديوم (~ 5 دقائق)، صورة الأجسام كلها من الحيوانات باستخدام عدسة التكبير 10x (الشكل 1A). للتصوير، استخدم فلتر FITC ونفس التعرض لكل. تجاهل الشرائح بعد التصوير.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن أيضا تحديد بؤر YFP مباشرة على اللوحات، ولكن يجب منع الحركة عن طريق تطبيق تيار من ثاني أكسيد الكربون على اللوحة أثناء التسجيل. هذه الطريقة البديلة هي الأنسب عند فحص عدد كبير من الشروط (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل).
    3. بعد الحصول على الصور، عد عدد البؤر في عضلات جدار الجسم للحيوان كله. البؤر هي إشارات أكثر إشراقا تتخللها التي يمكن تمييزها عن إشارة قابلة للذوبان باهتة في الخلفية.
    4. رسم تطور تراكم بؤر YFP من الأيام 1 و 2 و 3 و 4. رسم رسم بياني XY حيث يمثل X أيام البلوغ و Y يمثل عدد unc-54p::p olyQ::YFP بؤر (الشكل 1B). يقارن عدد البؤر في الحالة التجريبية (مثل انخفاض تنظيم الجينات أو الإفراط في التعبير) بالحيوانات المسيطرة. إجراء تحليل إحصائي بين المجموعات في كل نقطة زمنية يتم ملاحظتها لكل تجربة.
      1. عند مقارنة عدد البؤر شرطين فقط، قم بإجراء اختبار t عينة مستقلة في كل نقطة زمنية.
      2. عند مقارنة بؤر التهم لأكثر من شرطين، إجراء تحليل ANOVA أحادي الاتجاه شامل لكل نقطة زمنية، بما في ذلك البيانات لكافة الشروط في تلك النقطة الزمنية. إذا كانت ANOVA الشاملة تعطي قيمة p هامة (أي p < 0.005) ، قم بإجراء تحليل ما بعد مخصص مع عينة مستقلة من اختبارات t لتحديد الشروط المحددة التي تم اكتشاف اختلاف كبير بينهما في البؤر (على سبيل المثال ، للمجموعات A و B و C قارن A و B و A و C و B و C و B و C).
  2. قياس معدلات شلل الحيوان كبديل لسمية البوليغلوتامين في خلايا العضلات
    ملاحظة: تؤدي الزيادة المعتمدة على العمر في مجاميع البولي كيو في العضلات إلى تراجع الوظيفة العضلية التي تحرك الحركة. يمكن تحديد هذا العيب في الحركة من خلال قياس المعدل التدريجي للشلل في الحيوانات المعبرة عن تعدد الحيوانات. بالنسبة لمقايسة الشلل ، يتم تسجيل مزامنة unc-54p::p olyQ::YFP التي تعبر عن الحيوانات في اليوم 3 و 5 و 7 و 9 من مرحلة البلوغ. أضف نقاط زمنية إضافية، حسب الحاجة لتوسيع نطاق التهديف، بحيث يمكنك تقييم تأثير الاضطراب الوراثي.
    1. في أيام التسجيل (اليوم 3 و5 و7 و9 من مرحلة البلوغ)، انظر إلى لوحات 6 سم التي تحتوي على 50 حيوانا وسجل عدد الحيوانات المشلولة. إزالة الحيوانات المشلولة من لوحة. إذا كانت الحيوانات قد زحفت من الصحن، أو ماتت، فيجب أن تخضع للرقابة. تسجيل الحدث بحيث يمكن حسابها في التحليل.
      ملاحظة: يعتبر الحيوان مشلولا عندما لا يلاحظ أي حركة بعد تعريضه لمحفزات لمس خفيفة أو لطيفة. يستخدم نشاط ضخ البلعوم لتحديد ما إذا كانت الحيوانات غير متحركة على قيد الحياة أو ميتة.
    2. عند الانتهاء من التجربة، حساب معدل الشلل لكل حالة. القيام بذلك في كل نقطة زمنية عن طريق تقسيم جزء من الحيوانات المشلولة على العدد الإجمالي للحيوانات لوحظ لهذا الشرط في ذلك الوقت. إذا كان رصد لوحات متعددة لكل شرط في نقطة زمنية (أي تكرار لوحات)، وحساب نسبة على حدة لكل تكرار.
    3. رسم تطور معدل الشلل في الرسم البياني XY (مبعثر). X يمثل أيام من مرحلة البلوغ وY يمثل معدلات الشلل. معدل الشلل من unc-54p::p olyQ::YFP الحيوانات مقارنة الحيوانات السيطرة (الشكل 1C). إجراء تحليل إحصائي بين المجموعات؛ لإجراء تجارب متعددة، تعامل مع التجارب بشكل مستقل. استخدم كوكس الانحدار التناسبي المخاطر واختبار والد. تدعم معظم أدوات تحليل البيانات التي تدعم تحليل البقاء على قيد الحياة أيضا نمذجة كوكس.
      1. تحويل البيانات: يجب أن يكون لكل شرط عمودين، أحدهما للوقت والآخر ل "الحدث". في كل نقطة زمنية لوحظ، إضافة صف مع 0 لكل مشلول، و 1 لكل خاضع للرقابة. يجب أن يكون العدد الإجمالي للصفوف مساويا لعدد الحيوانات التي تبدأ على اللوحة لهذا الشرط.
      2. قم بإجراء نمذجة كوكس للأخطار النسبية، متبوعا باختبار والد، وفقا لتعليمات برنامجك الإحصائي. نموذج أحادي المتغيرات سيكون مناسبا لتصاميم التجارب النموذجية. لأكثر من شرطين، إذا كان الاختبار مع جميع الشروط المدرجة يشير إلى نتيجة هامة (أي p < 0.005)، يمكن إجراء اختبارات ثنائية بين الشروط لتحديد الزوج (الزوج) المهم المحدد للشروط.
        ملاحظة: يعتمد طراز كوكس على افتراض أن شرط (شروط) الاختبار يعدل احتمال وقوع حدث بشكل متناسب مع مرور الوقت. وهذا يعني، على سبيل المثال، أن نموذج كوكس لن يكون مناسبا لمقارنة حالة يصاب فيها معظم الحيوانات بالشلل في اليوم الأول بحالة تشل فيها معظم الحيوانات في اليوم التاسع. ملحقات نموذج كوكس، والنهج الأخرى لمقارنة النسب المشلولة في كل نقطة زمنية، متاحة للحالات التي لا يصمد فيها افتراض المخاطر النسبية، انظر27،28،29،30.

5. قياس الانخفاض في البروتيوستاسي في الأنسجة العصبية باستخدام البوليغلوتامين التعبير عن الحيوانات.

ملاحظة: يتم استخدام طريقتين متكاملتين لقياس انخفاض البروتيوستاسي في الخلايا العصبية (1) عن طريق تحديد تشكيل مجاميع البروتين (بؤر الفلورسنت) أثناء الشيخوخة و (2) عن طريق قياس الانخفاض المرتبط بالعمر في البروتيوم العصبي عن طريق المقايسة القائمة على الحركة.

  1. تصوير تشكيل الكلي polyglutamine في الخلايا العصبية أثناء الشيخوخة
    ملاحظة: على غرار المقايسة التي نوقشت بالفعل في أنسجة العضلات، يتم تصوير التقدم المعتمد على العمر لتجميع البروتين في الخلايا العصبية من خلال التعبير عن بروتين الانصهار polyQ::YFP مدفوعا بالمروج الخاص بالأنسجة العصبية من rgef-1. على وجه التحديد نحن نستخدم AM101: rmIs110 [rgef-1p::Q40::YFP]، وأربعين الانصهار الجلوتامين إلى YFP16. لتصور rgef-1p::p olyQ::YFP، استخدم مجهر مركب مجهز للفلور مع عدسة تكبير 40x. AM101 متاح من CGC على: https://cgc.umn.edu/strain/AM101.
    1. في أيام التصوير (اليوم 4 و6 و8 و10 من مرحلة البلوغ)، اختر 20 حيوانا وا جبل على شريحة مجهر تحتوي على لوحة agarose 3٪ مع انخفاض 5 ميكرولتر من 10 mM صوديوم azide (المخفف في المخزن المؤقت M9).
    2. بعد أن يتم شل حركة جميع الحيوانات بواسطة azide الصوديوم (~ 5 دقائق)، واتخاذ صور z-كومة من رأس الحيوانات باستخدام عدسة التكبير 40x (الشكل 2A). تجاهل الشرائح بعد التصوير.
    3. بعد الحصول على الصور، عملية z-مداخن للحصول على الإسقاط الأقصى واستخدامها لتحديد عدد البؤر في الخلايا العصبية الموجودة على منطقة حلقة العصب. البؤر هي إشارات أكثر إشراقا تتخللها التي يمكن تمييزها عن إشارة قابلة للذوبان باهتة في الخلفية.
      ملاحظة: لقد اخترنا على وجه التحديد منطقة الحلقة العصبية لتحديد rgef-1p::p olyQ::YFP المجاميع لأن هذه هي المنطقة حيث تلتقي معظم الخلايا العصبية لإجراء اتصالات متشابك. ومع ذلك، من أجل قياس مستويات التكوين الكلي في الخلايا العصبية الحركية، يمكن قياس rgef-1p::p olyQ::YFP المجاميع الموجودة على الحبل العصبي الظهري أو البطني كميا.
    4. رسم تطور تراكم بؤر YFP من D4 و D6 و D8 و D10. القيام بذلك على الرسم البياني XY حيث X يمثل أيام من مرحلة البلوغ وY يمثل عدد من rgef-1p::p olyQ::YFP بؤر (الشكل 2B). يقارن عدد البؤر في الحالة التجريبية (مثل انخفاض تنظيم الجينات أو الإفراط في التعبير) بالحيوانات المسيطرة. يتم التحليل الإحصائي لأعداد بؤر للخلايا العصبية بنفس الطريقة كما هو الحال بالنسبة للعضلات بؤر متعددة العضلات; راجع الخطوات 4.1.4 والملاحظات المقترنة.
  2. قياس الانحناءات الجسم كمقياس بديل من البروتيتوكسيوكسيسيتي البوليغلوتامين في الخلايا العصبية.
    ملاحظة: يتم تحديد الإجهاد البروتيوكسي الناجم عن التراكم الكلي التدريجي للخلايا العصبية متعددة الخلايا من خلال النظر في عيوب الخلايا العصبية الحركية من خلال فحص السحق. تحديد عدد الانحناءات الجسم في فترة 30 ثانية في حين علقت في المخزن المؤقت الفسيولوجي M9 (ملف تكميلي 1).
    1. في اليوم الثاني من مرحلة البلوغ، اختر 10 متزامنة من الطبق ووضعها على قطرة 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 على شريحة المجهر. كرر هذه الخطوة أربع مرات على الأقل للحصول على عينة من 40 حيوانا أو أكثر.
    2. يسجل الفيديو حركة الحيوانات العشرة الموضوعة على شريحة المجهر مع 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 لمدة 30 ثانية على منظار مجسم مع كاميرا قادرة على الفيديو. كرر هذه الخطوة 4 مرات للحصول على نموذج إجمالي عدد 40. يجب تعديل التكبير والموضع بحيث تكون جميع الحيوانات مرئية في الإطار لمدة 30 ثانية كاملة.
    3. مرة واحدة يتم تسجيل جميع أشرطة الفيديو مع الحيوانات التي سيتم تحليلها، وتشغيل الفيديو وتسجيل الانحناءات الجسم من كل. يتم تعريف منحنى جسم واحد كما هو الحال عندما يذهب فرج الحيوان من جانب واحد إلى العكس وعلى طول الطريق إلى وضع البداية.
      ملاحظة: نجد الحيوانات البرية نوع وعادة ما يكون 49 ± 0.79 الانحناءات الجسم في 30 ثانية.
    4. رسم عدد الانحناءات الجسم لكل في الرسم البياني العمود حيث تمثل كل نقطة عدد الانحناءات الجسم في 30 ق (محور ص) مع ظروف مختلفة اختبارها على محور X. عدد الانحناءات الجسم من unc-54p::p olyQ::YFP الحيوانات مقارنة الحيوانات السيطرة(الشكل 2C). إجراء تحليل إحصائي بين المجموعات بشكل مستقل لكل تجربة؛ إذا تكررت المقايسة في نقاط زمنية متعددة، قم بتحليل البيانات بشكل مستقل لكل نقطة زمنية.
      1. عند النظر في شرطين فقط، قم بإجراء اختبار t-sample مستقل.
      2. عند النظر في أكثر من شرطين في وقت واحد ، أولا إجراء تحليل ANOVA أحادي الاتجاه الشامل ، بما في ذلك البيانات لجميع الشروط في تلك الفترة التجريبية / نقطة زمنية. إذا كان ANOVA omnibus تسفر عن قيمة p كبيرة (أي p < 0.005) ، إجراء تحليل ما بعد مخصص مع عينة مستقلة pairwise تي الاختبارات لتحديد الشروط المحددة التي تم الكشف عن اختلاف كبير في عدد منحنى الجسم.

النتائج

في C. elegans، كان نموذج تكرار البوليglutamine مفيدا لتحديد الجينات التي تنظم الشبكة البروتيوستاتيكية. على سبيل المثال، أظهرنا سابقا أن كيناز البروتين التفاعل homeodomain (hpk-1)، وهو عامل مساعد النسخ، ويؤثر على البروتيوستاسيس أثناء الشيخوخة من خلال تنظيم التعبير عن autophagy والمرافقين الجزيئية

Discussion

وتتميز الشيخوخة من قبل انخفاض تدريجي في البروتيوستاسيس. يتم الحفاظ على البروتيوستازي من خلال نظام معقد، شبكة بروتيوستاتيكي، للتحكم المنسق والديناميكي والمستجيب للإجهاد في طي البروتين وتدهوره وترجمته. لماذا يفشل البروتيوستاسي في سياق الشيخوخة غير مفهومة بشكل جيد ، ولكن epigenome المتحللة ، ...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

نود أن نشكر الأعضاء السابقين والحاليين في مختبر سامويلسون على مساعدتهم في صقل هذه الطريقة و/ أو المناقشة التي ساعدت على تطوير هذه المخطوطة. تم دعم الأبحاث التي تم الإبلاغ عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للشيخوخة للمعاهد الوطنية للصحة تحت أرقام الجوائز RF1AG062593 وR21AG064519. المحتوى هو فقط مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار نشر المخطوطة أو إعدادها.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
24 Well Culture PlatesGreiner Bio-One#662102
2 mL 96-well platesGreiner Bio-One#780286
600 µL 96-well platesGreiner Bio-One#786261
96-pin plate replicatorNunc250520
Air-permeable plate sealVWR60941-086
bacteriological agarAffymetrix/USB10906
bacto-peptoneVWR90000-368
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- AhringerSource BioscienceC. elegans RNAi Collection (Ahringer)See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- VidalSource BioscienceC. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine)Alfa AesarL16497
Glass microscope cover slipsVWR48404-455
Glass microscope slidesVWR160004-422
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside)Gold Bio12481C100
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mmThermo-Fisher242811
Sodium Azide, CAS #26628-22-8Sigma-AldrichS2002
Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 softwareZeissunknown
Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscopeZeissunknown

References

  1. Wolff, S., Weissman, J. S., Dillin, A. Differential scales of protein quality control. Cell. 157 (1), 52-64 (2014).
  2. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
  3. Powers, E. T., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W., Balch, W. E. Biological and chemical approaches to diseases of proteostasis deficiency. Annual Review of Biochemistry. 78, 959-991 (2009).
  4. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  5. Sala, A. J., Bott, L. C., Morimoto, R. I. Shaping proteostasis at the cellular, tissue, and organismal level. Journal of Cell Biology. 216 (5), 1231-1241 (2017).
  6. Braak, H., Braak, E., Strothjohann, M. Abnormally phosphorylated tau protein related to the formation of neurofibrillary tangles and neuropil threads in the cerebral cortex of sheep and goat. Neuroscience Letters. 171 (1-2), 1-4 (1994).
  7. Poirier, M. A., Jiang, H., Ross, C. A. A structure-based analysis of huntingtin mutant polyglutamine aggregation and toxicity: evidence for a compact beta-sheet structure. Human Molecular Genetics. 14 (6), 765-774 (2005).
  8. Vilchez, D., Saez, I., Dillin, A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nature Communications. 5, 5659 (2014).
  9. Eftekharzadeh, B., Hyman, B. T., Wegmann, S. Structural studies on the mechanism of protein aggregation in age related neurodegenerative diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 156, 1-13 (2016).
  10. Pokrishevsky, E., Grad, L. I., Cashman, N. R. TDP-43 or FUS-induced misfolded human wild-type SOD1 can propagate intercellularly in a prion-like fashion. Scientific Reports. 6, 22155 (2016).
  11. Mukherjee, A., Morales-Scheihing, D., Butler, P. C., Soto, C. Type 2 diabetes as a protein misfolding disease. Trends in Molecular Medicine. 21 (7), 439-449 (2015).
  12. Sikkink, L. A., Ramirez-Alvarado, M. Biochemical and aggregation analysis of Bence Jones proteins from different light chain diseases. Amyloid. 15 (1), 29-39 (2008).
  13. Qu, B. H., Strickland, E., Thomas, P. J. Cystic fibrosis: a disease of altered protein folding. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 29 (5), 483-490 (1997).
  14. Qu, B. H., Strickland, E. H., Thomas, P. J. Localization and suppression of a kinetic defect in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator folding. Journal of Biological Chemistry. 272 (25), 15739-15744 (1997).
  15. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
  16. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  17. Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. New England Journal of Medicine. 355 (21), 2254-2255 (2006).
  18. Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes & Development. 22 (11), 1427-1438 (2008).
  19. Walker, F. O. Huntington's disease. Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).
  20. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 0002 (2001).
  21. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
  22. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  23. Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. Journal of Visualized Experiments. (136), e57819 (2018).
  24. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
  25. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
  26. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
  27. Schemper, M. Cox Analysis of Survival Data with Non-Proportional Hazard Functions. Journal of the Royal Statistical Society. Series D (The Statistician). 41 (4), 455-465 (1992).
  28. Royston, P., Parmar, M. K. The use of restricted mean survival time to estimate the treatment effect in randomized clinical trials when the proportional hazards assumption is in doubt. Statistics in Medicine. 30 (19), 2409-2421 (2011).
  29. Campbell, I. Chi-squared and Fisher-Irwin tests of two-by-two tables with small sample recommendations. Statistics in Medicine. 26 (19), 3661-3675 (2007).
  30. Busing, F. M., Weaver, B., Dubois, S. 2 x 2 Tables: a note on Campbell's recommendation. Statistics in Medicine. 35 (8), 1354-1358 (2016).
  31. Das, R., et al. The homeodomain-interacting protein kinase HPK-1 preserves protein homeostasis and longevity through master regulatory control of the HSF-1 chaperone network and TORC1-restricted autophagy in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 13 (10), 1007038 (2017).
  32. Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes & Development. 21 (22), 3006-3016 (2007).
  33. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  34. Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
  35. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  36. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  37. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
  38. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
  39. Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
  40. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
  41. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 119-128 (2005).
  42. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  43. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
  44. Johnson, D. W., et al. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad complexes integrate diverse longevity signals. PLoS Genetics. 10 (4), 1004278 (2014).
  45. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  46. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

175 polyQ YPC C elegans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved