JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il declino proteostatico è un segno distintivo dell'invecchiamento, facilitando l'insorgenza di malattie neurodegenerative. Delineiamo un protocollo per misurare in modo quantificabile la proteostasi in due diversi tessuti di Caenorhabditis elegans attraverso l'espressione eterologa di ripetizioni di poliglutamina fuse a un reporter fluorescente. Questo modello consente una rapida analisi genetica in vivo della proteostasi.

Abstract

La capacità di mantenere il corretto funzionamento e il ripiegamento del proteoma (omeostasi proteica) diminuisce durante il normale invecchiamento, facilitando l'insorgenza di un numero crescente di malattie associate all'età. Ad esempio, le proteine con espansioni di poliglutamina sono inclini all'aggregazione, come esemplificato con la proteina huntingtina e l'insorgenza concomitante della malattia di Huntington. Il deterioramento associato all'età del proteoma è stato ampiamente studiato attraverso l'uso di Caenorhabditis elegans transgenici che esprimono ripetizioni polyQ fuse a una proteina fluorescente gialla (YFP). Questo modello animale transgenico polyQ::YFP facilita la quantificazione diretta del declino del proteoma associato all'età attraverso l'imaging della progressiva formazione di focolai fluorescenti (cioè aggregati proteici) e la successiva insorgenza di difetti di locomozione che si sviluppano a seguito del collasso del proteoma. Inoltre, l'espressione del transgene polyQ::YFP può essere guidata da promotori tessuto-specifici, consentendo la valutazione della proteostasi tra i tessuti nel contesto di un organismo multicellulare intatto. Questo modello è altamente suscettibile di analisi genetica, fornendo così un approccio per quantificare l'invecchiamento che è complementare ai saggi della durata della vita. Descriviamo come misurare con precisione la formazione di focolai polyQ::YFP all'interno dei neuroni o del muscolo della parete corporea durante l'invecchiamento e la successiva insorgenza di difetti comportamentali. Successivamente, evidenziamo come questi approcci possono essere adattati per una maggiore produttività e potenziali applicazioni future utilizzando altre strategie emergenti per l'analisi genetica di C. elegans.

Introduzione

L'omeostasi proteica (proteostasi) è definita come la capacità cellulare di mantenere il corretto funzionamento e il ripiegamento del proteoma. La sfida intrinseca alla proteostasi è garantire che tutte le proteine siano correttamente ripiegate e mantenute in una conformazione nativa, che è ulteriormente amplificata dalla varia natura delle dimensioni delle proteine, dalla composizione degli amminoacidi, dalla conformazione strutturale, dalla stabilità, dal turnover, dall'espressione, dalla compartimentazione subcellulare e dalle modifiche1. La proteostasi viene mantenuta attraverso l'azione coordinata di una grande rete proteostatica, costituita da circa 2000 proteine uniche, che regolano la corretta sintesi, ripiegamento, traffico e degradazione all'interno del proteoma2,3. I componenti cavallo di battaglia della rete proteostatica sono nove famiglie principali di chaperoni molecolari4. Ogni tessuto e tipo di cellula utilizza preferenzialmente sottoinsiemi specifici di chaperoni molecolari, presumibilmente in linea con le diverse esigenze di proteomi distinti5.

Un segno distintivo del normale invecchiamento dell'organismo è il progressivo declino e collasso della proteostasi cellulare, che si ritiene sia una base di base per l'insorgenza e la progressione di un numero crescente di malattie associate all'età. Ad esempio, il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la malattia di Huntington e la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) condividono una caratteristica comune: in ogni caso la manifestazione della neurodegenerazione è guidata da alterazioni genetiche che predispongono all'aggregazione una proteina mutante (amiloide-β/Tau, α-sinucleina, HTT, FUS/TBD-43/SOD-1, rispettivamente)6,7,8,9,10 . Durante l'invecchiamento, l'integrità e l'inducibilità della rete proteostatica diminuisce, il che si traduce nell'accumulo di aggregati proteotossici che provocano disfunzione cellulare e neurodegenerazione. Da notare, le malattie conformazionali proteiche non sono uniche per i neuroni e si verificano su più tessuti, come evidenziato dal diabete di tipo II, dal mieloma multiplo e dalla fibrosi cistica11,12,13,14. Pertanto, chiarire meccanismi in grado di preservare la proteostasi faciliterà lo sviluppo di interventi mirati per il trattamento della malattia e per promuovere un invecchiamento sano.

Il piccolo nematode del suolo Caenorhabditis elegans (C. elegans) è stato determinante nella scoperta di geni e nel chiarire i percorsi che alterano la proteostasi. Molti componenti della rete proteostatica e le vie di trasduzione del segnale che regolano la proteostasi sono evolutivamente conservati. Inoltre, C. elegans ha ridotto la complessità e la ridondanza rispetto ai sistemi di vertebrati, rendendolo più suscettibile all'analisi genetica e alla scoperta di geni. Ulteriori vantaggi di C. elegans che hanno portato ad essere ampiamente utilizzato come sistema modello per studiare la proteostasi includono: potente genomica genetica e funzionale, un breve ciclo di vita (3 giorni) e durata della vita (3 settimane), un genoma compatto e ben annotato, la disponibilità di un vasto assortimento di mutanti genetici e la facilità di visualizzare i cambiamenti specifici del tessuto nella biologia cellulare utilizzando reporter fluorescenti.

Il progressivo decadimento della proteostasi durante l'invecchiamento può essere facilmente quantificato in C. elegans. Il laboratorio di Morimoto ha dimostrato per la prima volta che un'espansione di poliglutamina fusa in proteina fluorescente gialla(polyQ::YFP)potrebbe essere utilizzata per quantificare il declino proteostatico di C. elegans durante l'invecchiamento15,16,17,18. Le fusioni YFP a 35 ripetizioni di glutammina o più provocano una formazione associata all'età di focolai fluorescenti insieme a segni di patologia cellulare. Da notare, questa gamma di espansione della glutammina rispecchia la lunghezza del tratto poliglutamminico della proteina Huntingtina a cui la patologia della Malattia di Huntington inizia ad essere osservata negli esseri umani (tipicamente >35 ripetizioni CAG)19. Ceppi con espressione di polyQ::YFP all'interno di cellule muscolari, intestinali o neuronali sono stati utilizzati per confermare che il declino associato all'età della proteostasi si verifica in diversi tipi di cellule e tessuti. L'espressione poliQ::YFP muscolo-specifica (cioè unc-54p::Q35::YFP)è stata la reporter tessuto-specifica più utilizzata, poiché l'accumulo di focolai fluorescenti è facile da quantificare nei primi giorni dell'età adulta utilizzando un semplice microscopio fluorescente sezionante (Figura 1A-1B). Inoltre, gli animali diventano paralizzati durante la mezza età, poiché il proteoma all'interno del muscolo collassa a causa dell'effetto proteotossico del reporter (Figura 1C). Allo stesso modo, il declino associato all'età della proteostasi neuronale può essere seguito (rgef-1p::Q40::YFP) quantificando direttamente la formazione di focolai/aggregati e il declino associato all'età nelle curve coordinate del corpo dopo aver messo gli animali in liquido (Figura 2).

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato su come misurare la progressione dipendente dall'età dell'accumulo di aggregati proteici e la proteotossicità associata indotta dall'espressione di ripetizioni di poliglutamina all'interno del tessuto neuronale e muscolare in C. elegans. Forniamo esempi di risultati tipici generati utilizzando questi ceppi e metodi. Inoltre, mostriamo come abbiamo utilizzato questi metodi per studiare la regolazione trascrizionale della rete proteostatica. Discutiamo di ulteriori modi in cui questi reporter possono essere facilmente integrati con altri reagenti esistenti o adattati per schermi più grandi.

Protocollo

1. Preparazione dei reagenti

  1. Selezionare i geni di interesse da inattivare tramite RNAi basato sull'alimentazione. Acquisto di azioni di HT115 E. coli contenenti il clone RNAi di interesse20. In alternativa, subclone il cDNA del gene di interesse nel sito multicloning del plasmide L4440.
    NOTA: Per prevenire la degradazione del dsRNA all'interno dei batteri, utilizzare il ceppo HT115. Questo è un ceppo di E. coli carente di RNasi III con attività della polimerasi T7 inducibile da IPTG. Per gli studi di proteostasi che non utilizzano RNAi basato sull'alimentazione, è possibile utilizzare HT115 o OP50 E. coli su piastre NGM standard.
  2. Preparare piastre da 5 x 6 cm per condizione di prova. Per gli esperimenti che utilizzano RNAi, indurre la produzione di dsRNA in HT115 E. colitrasformato. Per gli studi senza RNAi, è possibile utilizzare OP50 E. coli su piastre NGM standard (vedere il file supplementare 1 per le ricette standard di piastre NGM e RNAi).
    NOTA: le piastre RNAi possono essere conservate a 4 °C per diversi mesi prima della semina con batteri.
  3. Coltivare colture di E. coli durante la notte (16-20 h) a 37 °C in un incubatore vibrante a 220 giri/min. Coltivare HT115 E. coli in brodo di Luria (LB) con ampicillina (50 μg/mL).
    NOTA: Lo standard OP50 E. coli non è resistente agli antibiotici, ma sono disponibili anche varianti resistenti alla streptomicina.
    1. Concentrare i batteri per centrifugazione a 2.400 x g per 15-20 min in una centrifuga da banco, aspirare il surnatante e ri-sospendere il pellet in 1/10 del volume iniziale (cioè concentrazione 10x) di LB con ampicillina per HT115, o LB senza ampicillina per OP50 standard.
    2. Aliquota 200 μL di batteri concentrati 10x a ciascuna piastra (3-4 repliche per condizione di prova, con 2 piastre di backup aggiuntive, da utilizzare in caso di contaminazione).
    3. Lasciare asciugare le piastre aperte in un ambiente pulito come un banco a flusso laminare fino a quando tutto il liquido non è stato assorbito o lasciare asciugare le piastre coperte su un banco di laboratorio durante la notte.
  4. Per le piastre RNAi seminate essiccate in un cappuccio, conservare le piastre essiccate all'interno di una scatola di vermi durante la notte (fino a 24 ore) a temperatura ambiente. Dopo 1 giorno a RT, le piastre possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 2 settimane in un sacchetto sigillato (per evitare che le piastre si secchino). Prima dell'uso, lasciare che le piastre conservate a 4 °C ritornino a temperatura ambiente all'interno del sacchetto con chiusura lampo per evitare che la condensa introduca contaminanti fungini dispersi nell'aria.
    1. Quando si utilizza RNAi basato sull'alimentazione, lasciare i batteri HT115 seminati su piastre RNAi a temperatura ambiente per almeno 12 ore prima di aggiungere C. elegans. Le piastre RNAi contengono IPTG, che induce la produzione di dsRNA. In alternativa, iPTG può essere aggiunto alle colture liquide alla fine del passaggio 1.3.1, 2 ore prima della semina.
    2. Evitare la conservazione a lungo termine di piastre HT115 seminate a temperatura ambiente (superiore a pochi giorni) per evitare la rottura dell'agar che causerà c. elegans a scavare nell'agar.

2. Sincronizzazione di C. elegans

NOTA: Scegliere se sincronizzare C. elegans mediante trattamento con ipoclorito alcalino di adulti gravidi o deposizione di uova.

  1. Sincronizzare gli animali mediante trattamento con ipoclorito di animali adulti gravidi per promuovere il rilascio di embrioni22.
    1. Per il trattamento con ipoclorito, lavare gli ermafroditi gravidi 2 volte con tampone M9, quindi sospendare in 5 mL di soluzione di ipoclorito (3,25 mL di soluzione di ipoclorito, 1 mL di tampone M9 e 0,75 mL di 5 M NaOH) per 5 minuti, scuotendo gli animali sospesi ogni minuto. Dopo 5 minuti, girare gli animali e lavare 3 volte con il tampone M9.
      NOTA: Il trattamento con ipoclorito è stato ipotizzato per influenzare la proteostasi21.
    2. Dopo il trattamento con ipoclorito, lasciare che gli embrioni si schiudano durante la notte in 3 mL di soluzione M9 con rotazione a 20 °C.
    3. Calcola la densità degli animali L1 (o in alternativa, degli embrioni) per μL facendo cadere 10 μL di soluzione L1 3x su una piastra di 6 cm e contando il numero di animali L1 per calcolare il numero medio di animali L1 per μL. Gli animali L1 si depositeranno nel tempo. Pertanto, mescolare periodicamente le soluzioni L1 per evitare l'assestamento.
    4. Semina 50 animali L1 per piatto, conta e registra il numero di semi e sposta le piastre in un incubatore a 20 °C. È importante conoscere il numero effettivo di animali su ciascuna piastra all'inizio del test.
      NOTA: La sincronizzazione degli animali L1 mediante schiusa notturna in M9 viene utilizzata di routine in quanto riduce al minimo l'eterogeneità dello sviluppo dopo aver messo gli animali sul cibo. Tuttavia, la sincronizzazione avviene attraverso l'arresto dello sviluppo in risposta a segnali di fame, che per alcuni studi dovrebbero essere evitati (vedere23 per ulteriori discussioni). In alternativa, gli animali approssimativamente sincronizzati possono essere ottenuti attraverso una deposizione delle uova, vedi 2.2.
    5. Congelare e conservare gli animali L1 rimanenti in azoto liquido o in un congelatore a -80 °C. In questo modo, viene conservato un campione di ciascun ceppo al momento della configurazione sperimentale, creando una risorsa preziosa per studi futuri e migliorando la riproducibilità.
      NOTA: vedere il file supplementare 1 per le ricette di ipoclorito e soluzione M9.
  2. Per sincronizzare gli animali tramite la deposizione delle uova, posizionare 20 giovani animali adulti gravidi (giorno 1 dell'età adulta) su ciascun piatto per 4-6 ore e consentire loro di depostare le uova fino a quando non ci sono circa 50 uova per piatto. Rimuovere tutti gli adulti gravidi e spostare le piastre con le uova in un'incubatrice a 20 °C.
    NOTA: Gli animali adulti gravidi devono essere sincronizzati al primo giorno dell'età adulta. Gli animali più anziani possono devotare le uova che sono state trattenute nell'utero, causando il rilascio di uova che si trovano in una fase di sviluppo più avanzata.

3. Produzione di progenie

NOTA: è necessario adottare misure per impedire la produzione di progenie o per separare la popolazione di partenza sincronizzata dalla progenie. Prevenire la produzione di progenie può essere ottenuto chimicamente con l'aggiunta di 5-Fluoro-2'-deossiuridina (FUdR) alle piastre, che è descritta qui. Alcuni studi hanno riportato che FUdR può alterare la proteostasi24,25. Di seguito sono discussi approcci alternativi per prevenire la produzione di progenie.

  1. Fare una soluzione stock 1000x di FUdR sciogliendo 1 g di FUdR in 10 mL di ultrapuro H2O. Il filtro sterilizza il FUdR con un filtro da 0,2 μm e una siringa da 10 mL. Aliquota 1 mL di stock in un tubo sterile da 1,5 mL. Congelare e conservare a -20 °C.
  2. Coltivare animali a 20 °C fino allo stadio L4. Gli animali N2 allevati da L1 sincronizzati dal trattamento con ipoclorito richiedono circa 40 ore di crescita a 20 °C per raggiungere L4. I tassi di crescita per altri ceppi dovrebbero essere testati empiricamente prima della sperimentazione. Per i dettagli su come mettere accuratamente in scena C. elegans vedi26.
    1. Per ogni piastra di 6 cm con animali L4, aggiungere 100 μL di 80x FUdR. È fondamentale aggiungere FUdR nella fase L4.
  3. Restituire i piatti in una scatola di vermi e mettere la scatola in un sacchetto con chiusura a zip. Torna all'incubatore appropriato.

4. Misurare il declino della proteostasi nel tessuto muscolare utilizzando animali che esprimono poliglutamina

NOTA: Due metodi possono essere utilizzati per identificare il declino della proteostasi nelle cellule muscolari: l'imaging della formazione di aggregati proteici durante l'invecchiamento (4.1) e la misurazione della proteotossicità che questi aggregati causano con l'età attraverso l'insorgenza della paralisi (4.2).

  1. Imaging della formazione di aggregati di poliglotamina nel muscolo durante l'invecchiamento
    NOTA: La progressione dipendente dall'età dell'aggregazione proteica nelle cellule muscolari viene ingiunta usando ripetizioni di poliglutamina (polyQ) fuse in una proteina fluorescente gialla (YFP). Questo protocollo delinea l'uso del ceppo AM140 rmIs132 [unc-54p::Q35::YFP], ma possono essere utilizzati anche altri ceppi di varianti di poliglutamina. Il transgene polyQ::YFP è espresso nel muscolo usando il promotore muscolo-specifico unc-54. Gli animali sincronizzati unc-54p::p olyQ::YFP che esprimono sono visualizzati nei giorni 1, 2, 3 e 4 dell'età adulta. Per visualizzare gli aggregati unc-54p::p olyQ::YFP, utilizzare un microscopio composto attrezzato per la fluorescenza o un microscopio fluorescente per la dissezione. AM140 è disponibile presso il Caenorhabditis Genetics Center (CGC) all'indirizzo: https://cgc.umn.edu/strain/AM140.
    1. Nei giorni di imaging (Giorno 1, 2, 3 e 4 dell'età adulta), scegliere 20 animali e montare su un vetrino per microscopio con un tampone di agarose al 3% e una goccia di 5 μL di 10 mM di azide di sodio (diluito in tampone M9).
    2. Dopo che tutti gli animali sono stati immobilizzati dall'azide di sodio (~ 5 minuti), immagina l'intero corpo degli animali usando una lente di ingrandimento 10x (Figura 1A). Per l'imaging, utilizzare un filtro FITC e la stessa esposizione per ogni animale. Scartare le diapositive dopo l'imaging.
      NOTA: In alternativa, i fuochi YFP possono anche essere quantificati direttamente sulle piastre, ma il movimento deve essere inibito applicando un flusso di anidride carbonica sulla piastra durante il punteggio. Questo metodo alternativo è più appropriato quando si esegue lo screening di un gran numero di condizioni (vedere la discussione per maggiori dettagli).
    3. Dopo l'acquisizione delle immagini, conta il numero di fuochi nei muscoli della parete corporea dell'intero animale. I fuochi sono segnali punteggiati più luminosi che possono essere differenziati dal segnale solubile dimmer sullo sfondo.
    4. Traccia la progressione dell'accumulo di focolai YFP dai giorni 1, 2, 3 e 4. Traccia un grafico XY dove X rappresenta i giorni dell'età adulta e Y rappresenta il numero di focolai unc-54p::p olyQ::YFP (Figura 1B). Il numero di focolai nella condizione sperimentale (ad esempio, downregulation genica o sovraespressione) viene confrontato con gli animali di controllo. Eseguire analisi statistiche tra i gruppi in ogni punto temporale osservato per ogni studio.
      1. Quando si confrontano i conteggi dei fuochi solo per due condizioni, eseguire un t-test del campione indipendente in ogni punto temporale.
      2. Quando si confrontano i conteggi dei fuochi per più di due condizioni, eseguire un'analisi ANOVA omnibus unidirezionale per ogni punto temporale, inclusi i dati per tutte le condizioni in quel punto temporale. Se l'omnibus ANOVA produce un valore p significativo (ad esempio, p < 0,005), eseguire un'analisi post-hoc con t-test di campionamento indipendenti a coppie per determinare le condizioni specifiche tra le quali è stata rilevata una differenza significativa nei fuochi (ad esempio, per i gruppi A, B e C confrontare A & B, A & C e B & C).
  2. Misurare i tassi di paralisi animale come surrogato della tossicità della poliglutamina nelle cellule muscolari
    NOTA: L'aumento dipendente dall'età degli aggregati polyQ nel muscolo provoca il declino della funzione muscolare che guida la locomozione. Questo difetto nella locomozione può essere determinato misurando il tasso progressivo di paralisi negli animali che esprimono poliQ. Per il test di paralisi, gli animali sincronizzati unc-54p::p olyQ::YFP sono valutati al giorno 3, 5, 7 e 9 dell'età adulta. Aggiungi ulteriori punti temporali, se necessario per estendere l'intervallo di punteggio, in modo da poter valutare l'effetto della perturbazione genetica.
    1. Nei giorni di punteggio (Giorno 3, 5, 7 e 9 dell'età adulta), guarda le piastre di 6 cm contenenti 50 animali e registra il numero di animali paralizzati. Rimuovere gli animali paralizzati dal piatto. Se gli animali sono strisciati fuori dal piatto o sono morti, dovrebbero essere censurati; registrare l'evento in modo che possa essere contabile nell'analisi.
      NOTA: Un animale è considerato paralizzato quando non si osserva alcun movimento dopo esserlo esposto a stimoli leggeri o delicati al tatto. L'attività di pompaggio faringeo viene utilizzata per determinare se gli animali non mobili sono vivi o morti.
    2. Al completamento dell'esperimento, calcola il tasso di paralisi per ogni condizione. Fallo in ogni punto temporale dividendo la frazione di animali paralizzati per il numero totale di animali osservati per quella condizione in quel momento. Se si osservano più piastre per condizione per punto temporale (ad esempio, piastre di replica), calcolare il rapporto separatamente per ogni replica.
    3. Traccia la progressione del tasso di paralisi in un grafico XY (grafico a dispersione). X rappresenta i giorni dell'età adulta e Y rappresenta i tassi di paralisi. Il tasso di paralisi degli animali unc-54p::p olyQ::YFP viene confrontato con quello degli animali di controllo (Figura 1C). Eseguire analisi statistiche tra i gruppi; per studi multipli, trattare gli studi in modo indipendente. Utilizzare la regressione dei rischi proporzionali di Cox e il test di Wald. La maggior parte degli strumenti di analisi dei dati che supportano l'analisi di sopravvivenza supportano anche la modellazione di Cox.
      1. Trasforma i dati: ogni condizione dovrebbe avere due colonne, una per il tempo e un'altra per "evento". In ogni punto temporale osservato, aggiungi una riga con "0" per ogni animale paralizzato e un "1" per ogni animale censurato. Il numero totale di file dovrebbe essere uguale al numero di animali di partenza sul piatto per tale condizione.
      2. Eseguire la modellazione Cox Proportional-Hazards, seguita dal test Wald, in base alle istruzioni per il software statistico. Un modello univariato sarà appropriato per i progetti tipici degli esperimenti. Per più di due condizioni, se un test con tutte le condizioni incluse indica un risultato significativo (ad es. p < 0,005), è possibile eseguire test a coppie tra le condizioni per determinare la coppia o le coppie significative specifiche di condizioni.
        NOTA: il modello di Cox si basa sul presupposto che le condizioni di test modulano la probabilità di un evento proporzionalmente nel tempo. Ciò significa, ad esempio, che il modello di Cox non sarebbe appropriato per confrontare una condizione in cui la maggior parte degli animali è paralizzata al giorno 1 con una condizione in cui la maggior parte degli animali è paralizzata al giorno 9. Estensioni del modello di Cox e altri approcci per confrontare le proporzioni paralizzate in ogni punto temporale sono disponibili per i casi in cui l'ipotesi dei rischi proporzionali non regge, vedi27,28,29,30.

5. Misurare il declino della proteostasi nel tessuto neuronale utilizzando animali che esprimono poliglutamina.

NOTA: Due metodi complementari sono utilizzati per misurare il declino della proteostasi nei neuroni (1) quantificando la formazione di aggregati proteici (focolai fluorescenti) durante l'invecchiamento e (2) misurando il declino associato all'età nel proteoma neuronale tramite un test basato sul movimento.

  1. Imaging della formazione di aggregati di poliglotamina nei neuroni durante l'invecchiamento
    NOTA: Simile al saggio già discusso nel tessuto muscolare, la progressione dipendente dall'età dell'aggregazione proteica nei neuroni viene considerata esprimendo una proteina di fusione polyQ::YFP guidata dal promotore pan-neuronale tessuto-specifico di rgef-1. Nello specifico utilizziamo AM101: rmIs110 [rgef-1p::Q40::YFP],una fusione di quaranta glutammine a YFP16. Per visualizzare rgef-1p::p olyQ::YFP, utilizzare un microscopio composto dotato di fluorescenza con una lente di ingrandimento 40x. AM101 è disponibile presso il CGC all'indirizzo: https://cgc.umn.edu/strain/AM101.
    1. Nei giorni di imaging (giorni 4, 6, 8 e 10 dell'età adulta), scegliere 20 animali e montare su un vetrino per microscopio contenente un tampone di agarose al 3% con una goccia di 5 μL di 10 mM di azide di sodio (diluito in tampone M9).
    2. Dopo che tutti gli animali sono stati immobilizzati dall'azide di sodio (~ 5 minuti), scatta immagini z-stack della testa degli animali usando una lente di ingrandimento 40x (Figura 2A). Scartare le diapositive dopo l'imaging.
    3. Dopo l'acquisizione delle immagini, elaborare z-stack per ottenere la massima proiezione e utilizzare per quantificare il numero di focolai nei neuroni situati nell'area dell'anello nervoso. I fuochi sono segnali punteggiati più luminosi che possono essere differenziati dal segnale solubile dimmer sullo sfondo.
      NOTA: Abbiamo selezionato specificamente l'area dell'anello nervoso per quantificare gli aggregati rgef-1p::p olyQ::YFP poiché questa è la regione in cui convergono la maggior parte dei neuroni per effettuare connessioni sinaptiche. Tuttavia, al fine di misurare i livelli di formazione aggregata nei motoneuroni, è possibile quantificare gli aggregati rgef-1p::p olyQ::YFP situati sul cordone nervoso dorsale o ventrale.
    4. Traccia la progressione dell'accumulo di focolai YFP da D4, D6, D8 e D10. Fallo su un grafico XY dove X rappresenta i giorni dell'età adulta e Y rappresenta il numero di focolai rgef-1p::p olyQ::YFP (Figura 2B). Il numero di focolai nella condizione sperimentale (ad esempio, downregulation genica o sovraespressione) viene confrontato con gli animali di controllo. L'analisi statistica dei conteggi dei fuochi per i neuroni viene effettuata allo stesso modo dei focolai di poliQ muscolare; vedere i passaggi 4.1.4 e le note associate.
  2. Misurare le pieghe del corpo come misura surrogata della proteotossicità della poliglutamina nei neuroni.
    NOTA: Lo stress proteotossico indotto dal progressivo accumulo aggregato di polyQ neuronale è determinato osservando i difetti dei motoneuroni attraverso un test di thrashing. Quantificare il numero di curve del corpo in un periodo di 30 secondi mentre è sospeso nel tampone fisiologico M9 (File supplementare 1).
    1. Il giorno 2 dell'età adulta, scegli 10 animali sincronizzati dalla piastra e posizionali su una goccia di 10 μL di tampone M9 su un vetrino per microscopio. Ripeti questo passaggio almeno quattro volte per ottenere un campione di 40 o più animali.
    2. Registrare video il movimento dei 10 animali posti sul vetrino del microscopio con 10 μL di tampone M9 per un periodo di 30 s su uno stereomicroscopio con una videocamera capace. Ripetere questo passaggio 4 volte per un numero di campione totale di 40. Lo zoom e la posizione devono essere regolati in modo tale che tutti gli animali siano visibili nell'inquadratura per tutti i 30 secondi.
    3. Una volta registrati tutti i video con gli animali da analizzare, riproduci il video e segna le curve del corpo di ciascun animale. Una curva del corpo è definita come quando la vulva dell'animale va da un lato all'opposto e torna alla posizione di partenza.
      NOTA: Troviamo che gli animali selvatici hanno in genere 49 ± 0,79 curve del corpo in 30 secondi.
    4. Traccia il numero di piegature del corpo per ogni animale in un grafico a colonne in cui ogni punto rappresenta il numero di piegature del corpo in 30 s (asse Y) con le diverse condizioni testate sull'asse X. Il numero di curve corporee degli animali unc-54p::p olyQ::YFP viene confrontato con gli animali di controllo (Figura 2C). Eseguire analisi statistiche tra i gruppi in modo indipendente per ogni studio; se il test viene ripetuto in più punti temporali, analizzare i dati in modo indipendente per ogni punto temporale.
      1. Quando si considerano solo due condizioni, eseguire un t-test del campione indipendente.
      2. Quando si considerano più di due condizioni contemporaneamente, eseguire prima un'analisi ANOVA omnibus unidirezionale, inclusi i dati per tutte le condizioni in quella prova a tempo / punto temporale. Se l'omnibus ANOVA produce un valore p significativo (cioè p < 0,005), eseguire un'analisi post-hoc con t-test di campionamento indipendenti a coppie per determinare le condizioni specifiche tra le quali è stata rilevata una differenza significativa nel conteggio delle curve del corpo.

Risultati

In C. elegans,il modello di ripetizione della poliglutamina è stato determinante per l'identificazione dei geni che regolano la rete proteostatica. Ad esempio, abbiamo precedentemente dimostrato che l'omeodominio che interagisce con la proteina chinasi (hpk-1), un cofattore trascrizionale, influenza la proteostasi durante l'invecchiamento regolando l'espressione di autofagia e chaperoni molecolari31. Abbiamo scoperto che la perdita di hpk-1,sia per silenziamento RNAi ch...

Discussione

L'invecchiamento è caratterizzato da un graduale declino della proteostasi. La proteostasi è mantenuta da un sistema complesso, la rete proteostatica, per il controllo coordinato, dinamico e sensibile allo stress del ripiegamento, della degradazione e della traduzione delle proteine. Il motivo per cui la proteostasi fallisce nel corso dell'invecchiamento è poco compreso, ma un epigenoma in decomposizione, una diminuzione dell'inducibilità delle risposte allo stress e la perdita di crosstalk compensatorio coincidono t...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Vorremmo ringraziare i membri passati e presenti del laboratorio Samuelson per la loro assistenza nel perfezionamento di questo metodo e / o discussione che ha aiutato lo sviluppo di questo manoscritto. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute on Aging del National Institutes of Health con i numeri di premio RF1AG062593 e R21AG064519. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
24 Well Culture PlatesGreiner Bio-One#662102
2 mL 96-well platesGreiner Bio-One#780286
600 µL 96-well platesGreiner Bio-One#786261
96-pin plate replicatorNunc250520
Air-permeable plate sealVWR60941-086
bacteriological agarAffymetrix/USB10906
bacto-peptoneVWR90000-368
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- AhringerSource BioscienceC. elegans RNAi Collection (Ahringer)See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- VidalSource BioscienceC. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine)Alfa AesarL16497
Glass microscope cover slipsVWR48404-455
Glass microscope slidesVWR160004-422
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside)Gold Bio12481C100
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mmThermo-Fisher242811
Sodium Azide, CAS #26628-22-8Sigma-AldrichS2002
Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 softwareZeissunknown
Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscopeZeissunknown

Riferimenti

  1. Wolff, S., Weissman, J. S., Dillin, A. Differential scales of protein quality control. Cell. 157 (1), 52-64 (2014).
  2. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
  3. Powers, E. T., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W., Balch, W. E. Biological and chemical approaches to diseases of proteostasis deficiency. Annual Review of Biochemistry. 78, 959-991 (2009).
  4. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  5. Sala, A. J., Bott, L. C., Morimoto, R. I. Shaping proteostasis at the cellular, tissue, and organismal level. Journal of Cell Biology. 216 (5), 1231-1241 (2017).
  6. Braak, H., Braak, E., Strothjohann, M. Abnormally phosphorylated tau protein related to the formation of neurofibrillary tangles and neuropil threads in the cerebral cortex of sheep and goat. Neuroscience Letters. 171 (1-2), 1-4 (1994).
  7. Poirier, M. A., Jiang, H., Ross, C. A. A structure-based analysis of huntingtin mutant polyglutamine aggregation and toxicity: evidence for a compact beta-sheet structure. Human Molecular Genetics. 14 (6), 765-774 (2005).
  8. Vilchez, D., Saez, I., Dillin, A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nature Communications. 5, 5659 (2014).
  9. Eftekharzadeh, B., Hyman, B. T., Wegmann, S. Structural studies on the mechanism of protein aggregation in age related neurodegenerative diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 156, 1-13 (2016).
  10. Pokrishevsky, E., Grad, L. I., Cashman, N. R. TDP-43 or FUS-induced misfolded human wild-type SOD1 can propagate intercellularly in a prion-like fashion. Scientific Reports. 6, 22155 (2016).
  11. Mukherjee, A., Morales-Scheihing, D., Butler, P. C., Soto, C. Type 2 diabetes as a protein misfolding disease. Trends in Molecular Medicine. 21 (7), 439-449 (2015).
  12. Sikkink, L. A., Ramirez-Alvarado, M. Biochemical and aggregation analysis of Bence Jones proteins from different light chain diseases. Amyloid. 15 (1), 29-39 (2008).
  13. Qu, B. H., Strickland, E., Thomas, P. J. Cystic fibrosis: a disease of altered protein folding. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 29 (5), 483-490 (1997).
  14. Qu, B. H., Strickland, E. H., Thomas, P. J. Localization and suppression of a kinetic defect in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator folding. Journal of Biological Chemistry. 272 (25), 15739-15744 (1997).
  15. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
  16. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  17. Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. New England Journal of Medicine. 355 (21), 2254-2255 (2006).
  18. Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes & Development. 22 (11), 1427-1438 (2008).
  19. Walker, F. O. Huntington's disease. Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).
  20. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 0002 (2001).
  21. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
  22. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  23. Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. Journal of Visualized Experiments. (136), e57819 (2018).
  24. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
  25. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
  26. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
  27. Schemper, M. Cox Analysis of Survival Data with Non-Proportional Hazard Functions. Journal of the Royal Statistical Society. Series D (The Statistician). 41 (4), 455-465 (1992).
  28. Royston, P., Parmar, M. K. The use of restricted mean survival time to estimate the treatment effect in randomized clinical trials when the proportional hazards assumption is in doubt. Statistics in Medicine. 30 (19), 2409-2421 (2011).
  29. Campbell, I. Chi-squared and Fisher-Irwin tests of two-by-two tables with small sample recommendations. Statistics in Medicine. 26 (19), 3661-3675 (2007).
  30. Busing, F. M., Weaver, B., Dubois, S. 2 x 2 Tables: a note on Campbell's recommendation. Statistics in Medicine. 35 (8), 1354-1358 (2016).
  31. Das, R., et al. The homeodomain-interacting protein kinase HPK-1 preserves protein homeostasis and longevity through master regulatory control of the HSF-1 chaperone network and TORC1-restricted autophagy in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 13 (10), 1007038 (2017).
  32. Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes & Development. 21 (22), 3006-3016 (2007).
  33. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  34. Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
  35. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  36. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  37. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
  38. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
  39. Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
  40. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
  41. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 119-128 (2005).
  42. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  43. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
  44. Johnson, D. W., et al. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad complexes integrate diverse longevity signals. PLoS Genetics. 10 (4), 1004278 (2014).
  45. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  46. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

BiologiaNumero 175proteostasipoliglutaminapolyQ YPCC elegansinvecchiamentobiomarcatoreomeostasi proteicaanalisi geneticagenomica funzionale

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati