اكتشاف بسيط من سيليا الأولية من قبل المناعةfluorescence

Summary

الإهداب الأولية هي هياكل خارج الخلية المرتبطة بالهيكل المركزي. الكشف عن الإهداب الأولية عن طريق تلطيخ الفلوروس المناعة هو إجراء بسيط نسبيا أن النتائج في صور عالية الجودة للغاية. في هذا البروتوكول، كانت الخلايا الليفية التي تعبر عن أهداب أولية ثابتة، ومثبطة للمناعة، ومصوّبة في مجهر فلوري أو مجهري.

Abstract

يتم تنظيم الإهداب الأولية ديناميكيًا أثناء تطور دورة الخلية ، وتحديدًا خلال مراحل G0/G1 من دورة الخلية ، ويتم إعادة ترسبها قبل الانقسام. يمكن تصور الإهداب الأولية بطرق متطورة للغاية ، بما في ذلك المجهر الإلكتروني للإرسال ، والتصوير ثلاثي الأبعاد ، أو استخدام برامج للكشف التلقائي عن الأهداب الأولية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى تلطيخ من الإهداب الأولية لإجراء هذه الطرق. يصف هذا المنشور بروتوكولًا للكشف السهل عن أهداب الأولية في المختبر عن طريق تلطيخ أسيتيلات ألفا توبولين (axoneme) وa توبولين غاما (الجسم القاعدي). هذا البروتوكول الملطّف بالفلورات الملطّف بسيط نسبيًّا وينتج صورًا عالية الجودة. يصف هذا البروتوكول كيف أن أربعة خطوط خلايا (C2C12، MEF، NHLF، والخلايا الليفية الجلدية) التي تعبر عن الأهداب الأولية كانت ثابتة ومثبطة للمناعة وصورة مع مجهر فلوري أو مجهري.

Introduction

الإهداب الأولية هي الحسية، الانفرادي، الغشاء ملزمة، الهياكل غير المبتدئ المرتبطة بالهيكل المركزي الأم للخلية. تم العثور على أهداب الأولية في معظم الخلايا الفقارية باستثناء خلايا الدم الحمراء، adipocytes¹، وخلايا². تتشكل الأهداب الأولية كمحور ممدود يتكون من ميكروتومات، المكون الرئيسي لها هو α-tubulin. ينمو الفأس من الجسم القاعدي، الذي يتم تنظيمه من γ-tubulin. ويتراوح طول الأهداب الأولية بين 2-10 ميكرومتر؛ ومع ذلك، يمكن أن تتغير أبعاده أثناء الجليسيليشن، والتجويع، ونقص الأكسجة، والإجهاد السام للخلايا، أو بعد التعرض للإشعاع المؤين^{3،4،5،6،7}. عادة, الخلايا لديها واحد فقط cilium الابتدائي, التي تشارك في morphogenesis والخلايا إشارات مسارات هامة لانتشار الخلايا والتمايز^8,,9.

يتم تنظيم أهداب الابتدائية بشكل ديناميكي خلال تطور دورة الخلية ، وتحديدا خلال مراحل G0/G1 ، وإعادة ترسب قبل دخول الانقسام في عملية مرتبطة بفك الacetylation tubulin بوساطة HDAC6 (histone deacetylase 6)¹⁰. الدقيقة لحظة سيليا resorption الأساسي يعتمد على نوع الخلية والتعبير عن الجينات المشاركة مباشرة في هذه العملية، مثل أورورا A، Plk1، TcTex-11،^11,12،,13. اعتمادا على نوع الخلية، والإهداب الأولية التعبير عن أنواع مختلفة من المستقبلات، والقنوات الأيونية، ومسارات الإشارات النشطة. وتشمل هذه أهم مستقبلات الإشارات التي تؤثر على الانتشار والبقاء على قيد الحياة، EGFR، PDGFR، وFGFR. وشملت أيضا بعض المسارات الإشارات التي قد تؤثر على وظيفة واحد أو أكثر من الأجهزة، بما في ذلك القنفذ، نوتش، وWNT. وبفضل هذه المستقبلات ومسارات الإشارات، والأهداب الأولية أيضا أداء وظيفة العلاج الكيميائي. هذه الوظيفة تسمح أهداب الأولية للكشف عن يغاند محددة لرقم, الهرمونات, والمواد النشطة بيولوجيا مثل السيروتونين أو سوماتوستاتين. وتشمل الوظائف المحددة الأخرى التي تظهر من قبل أهداب الابتدائية من أطوال مختلفة رد فعل للتغيرات في درجة الحرارة, الجاذبية, وosmolality¹⁴.

يمكن تصور الإهداب الأولية من خلال طرق مختلفة ، مثل التصور الحي ، والمجهر الإلكتروني انتقال ، التصوير ثلاثي الأبعاد ، أو عن طريق برنامج للكشف التلقائي عن الإهداب^{الابتدائية 5،15،16،17}. ومع ذلك، هذه الأساليب هي متخصصة للغاية والبحث المستمر يحتاج إلى أساليب أساسية وسريعة وسهلة لتلوين أهداب الأولية في كل مرحلة من مراحل البحث. وصفها هو وسيلة سهلة ومفيدة للكشف عن أهداب الأولية في الخلايا المستزرعة.

Protocol

1. إعداد وسائل الإعلام الثقافية والحلول والأطباق

1. اُتّمَفّف الأغطية (22 × 22 مم). إعداد 6 لوحات جيدا. ذوبان مصل الأبقار الجنين (FBS) والمضادات الحيوية البنسلين / ستربتوميسين ودفء الثقافة المتوسطة لدرجة حرارة الغرفة (RT). استخدام التربسين-EDTA (0.25%) و 1x PBS (الفوسفات المخزنة المالحة مع الكالسيوم والمغنيسيوم) لتمرير الخلايا.
2. إعداد 4% paraformaldehyde (PFA) في dH₂O (800 ملغ من PFA في 20 مل من dH₂O). يجب أن يكون PFA إعدادا حديثا لكل تجربة. يُحرّك المحلّل ويُحرّكه عند 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في غطاء محرك السيارة. يبرد في RT. أضف 1 M هيدروكسيد الصوديوم حتى يصبح الحل واضحًا (pH = 7.2-7.4). يُخزن عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.
   ملاحظة: PFA هي سامة; دائما ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة، وإعداد في غطاء محرك السيارة الكيميائية.
3. إعداد 500 مل من وسائل الإعلام الثقافة, DMEM (Dulbecco's تعديل النسر المتوسط) تحتوي على 10% FBS, 1% البنسلين/ستريبتوميسين, و 2% الجلوتامين.
4. إعداد 13 مل من 1% محلول الجيلاتين في dH₂O معقمة (130 ملغ من الجيلاتين في 13 مل من dH₂O). استخدام 2 مل من 1٪ الجيلاتين لكل بئر في لوحة 6 جيدا. الحفاظ على العقيمة.
5. تنظيف غطاء محرك تدفق لارينار باستخدام 70٪ الإيثانول. ضع المواد المطلوبة داخل غطاء تدفق الفارني قبل بدء التجربة.

2. ثقافة الخلية لتلوين الكيمياء المناعية

1. ذوبان الخلايا (في هذه الدراسة C2C12, MEF, NHLF, والجلد الليفية) باستخدام التقنيات القياسية وطبق لهم في قارورة T75 تكمل مع ~ 10-12 مل من وسائل الإعلام المعدة. احتضان في 37 درجة مئوية / 5 ٪ CO₂/ 90 ٪ الرطوبة النسبية (RH) حتى الخلايا تصل إلى 70 ٪ التقاء.
2. إزالة الخلايا من الحاضنة ووضعها في غطاء محرك التدفق المفارق. إزالة وسائل الإعلام والثقافة وشطف الخلايا لفترة وجيزة 2x مع 1X PBS. أضف ~ 2 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA في قارورة T75 واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تحقق بشكل دوري على المجهر المقلوب لمراقبة انفصال الخلايا.
   ملاحظة: وقت الحضانة يعتمد على خط الخلية وبالتالي يجب أن يتم تحديد تجريبيا.
3. بلطف resuspend الخلايا في 10 مل من وسائل الإعلام الثقافة، pipetting بعناية لخلق تعليق خلية واحدة. شطف القارورة مرة أخرى إذا لزم الأمر.
4. ضع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 50 مل وطاردة مركزية لمدة 5 دقائق في ~ 200 × ز. Decant فائقة ، إضافة 10 مل من وسائل الإعلام الثقافة ، وإعادة بلطف بيليه. خذ 20 ميكرولتر من تعليق الخلية واخلطها بنسبة 1:1 مع زرقة تريبان وعد في مقياس الخلايا باتباع الطريقة القياسية.
5. مكان واحد coverslip داخل كل بئر من 6 لوحة جيدا باستخدام ملاقط. معطف الأغطية مع الجيلاتين عن طريق صب ~ 2 مل في الآبار. وهذا سيساعد الخلايا على إرفاق إلى الأغطية. إزالة الحل الجيلاتين والسماح للهواء الجاف لبضع دقائق. الأغطية جاهزة الآن لزراعة الخلايا. بدء زراعة على الفور.
6. بذور 100،000 الخلايا الليفية في كل بئر وإضافة 2 مل من وسائل الإعلام الثقافة. احتضان الخلايا ل 24 ساعة في 37 درجة مئوية / 5 ٪ CO₂/ 90 ٪ RH. في هذه المرحلة، يمكن التعامل مع الخلايا وفقا لاحتياجات المستخدم. وقد وصفت سابقا العلاجات للحث على ciliation^4,5.
   ملاحظة: يعتمد عدد البذر الأولي على وقت مضاعفة الخلايا ويجب تحديدها وفقًا لذلك.

3. تلوين المناعة من أهداب الأولية في المختبر

1. قم بتدفئة الـ 4% من الـ paraformaldehyde إلى RT. قم بإعداد ماصات باستور، 1x PBS (RT)، حاوية النفايات، 15 مل أنابيب مخروطية، ميكروبيبتات (0.5-10 ميكرولتر، 20-200 ميكرولتر، و 100-1000 ميكرولتر) ونصائح. خذ الخلايا من الحاضنة ووضعها في مقاعد البدلاء.
   ملاحظة: لا يلزم إجراء التلطخ في ظروف معقمة. يجب أن تكون جميع الحلول في RT.
2. إزالة الوسائط من كل بئر. اترك الغطاء داخل البئر. غسل بلطف جدا الخلايا 3x مع 2 مل من 1X PBS. باستخدام ماصة باستور، إضافة 2 مل من 4٪ PFA في كل بئر لإصلاح الخلايا. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT. إزالة PFA وغسل 3x مع 1X PBS.
   ملاحظة: استخدم دائماً وحدة تخزين كافية لتغطية الغطاء بأكمله خلال فترات الحضانة. لا تدع الخلايا تجف أبداً أبدا صب أي من الحلول مباشرة على الأغطية.
3. إعداد 0.5٪ تريتون X-100 في 13 مل من 1X برنامج تلفزيوني 10 دقيقة قبل الاستخدام. إضافة 2 مل في كل بئر. احتضان لمدة 15 دقيقة. غسل بلطف 4x مع 1X PBS.
   ملاحظة: تريتون X-100 غير قابلة للذوبان في برنامج تلفزيوني في RT. الحرارة 0.5% تريتون X-100 حل إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي لإذابته.
4. ذوبان مصل الماعز 5 دقائق قبل الاستخدام. تمييع مصل الماعز في 1X PBS في نسبة 1:20 كحل حظر. أضف 150 ميكرولتر لكل غطاء واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT.
   ملاحظة: إطالة فترة الحجب تصل إلى 60 دقيقة إذا لزم الأمر. لا تغسل الخلايا بعد حجبها بمصل الماعز.
5. ذوبان الأجسام المضادة الأولية (أي، المضادة للأسيتيل ألفا tubulin ومضادات غاما tubulin) 5 دقائق قبل الاستخدام. تمييع الأجسام المضادة بشكل منفصل في 1x PBS على النحو التالي: الماوس المضادة للأسيتيل ألفا tubulin في نسبة 1:800 والأرانب المضادة للغاما tubulin في نسبة 1:300. إزالة الحل حظر. لا تغسل. أضف 150 ميكرولتر من كل من تخفيفات الأجسام المضادة إلى الأغطية واحتضان لمدة 60 دقيقة في RT.
   ملاحظة: إذا كان الاحتضان بين عشية وضحاها استخدام 500-1،000 ميكرولتر من الحلول المضادة الأولية، وختم لوحة 6 جيدا مع فيلم البارافين، وتخزينها في 4 درجة مئوية. بدلا من ذلك، استخدم 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة واحتضان في غرفة الرطوبة.
6. إزالة الأجسام المضادة الأساسية. غسل الأغطية 3x بلطف جدا مع 2 مل من 1X برنامج تلفزيوني. إعداد الأجسام المضادة الثانوية في 1X PBS عن طريق تخفيف بشكل منفصل Cy3 الأغنام المضادة للماوس واليكسا Fluor488 الماعز المضادة للأرنب في نسبة 1:300. أضف 150 ميكرولتر من كل من تخفيفات الأجسام المضادة الثانوية إلى الأغطية. احتضان لمدة 45 دقيقة في RT في الظلام.
   ملاحظة: احتضان في الظلام لتجنب photobleaching. ويمكن استخدام مجموعات أخرى من الأجسام المضادة الثانوية حسب الحاجة.
7. إعداد DAPI (4'، 6-diamidino-2-فينيليندول) حل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تخزين aliquots الزائدة في -20 درجة مئوية. تمييع 10 ميكرولتر من aliquot الأسهم (1:5,000) في 50 مل من 1X PBS. إضافة 2 مل من هذا التخفيف إلى الأغطية. احتضان لمدة 5 دقائق في RT في الظلام.
   ملاحظة: من المهم احتضان الخلايا في الظلام لتجنب التحسس الضوئي. يمكن تخزين تخفيف DAPI في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
8. إعداد 2 الإبر والشرائح، والملاقط، والوسائط المتصاعدة. تسمية الشرائح.
9. إزالة حل DAPI من الآبار. غسل 3x مع 1X برنامج تلفزيوني. وضع قطرة واحدة من وسائط متزايدة على كل شريحة. استخدم الإبرة لرفع الغطاء بلطف من أسفل البئر. اقلب الغطاء باستخدام الملاقط ووضعها بلطف فوق قطرة الوسائط المتصاعدة. إزالة بعناية أي فقاعات.
10. حماية الشرائح من الضوء وتخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
11. استخدم مجهر الفلورسنت أو الميكون مع التكبير العالي لتصور الأهداب الأولية.
    ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين.

النتائج

إن تلطيخ الإهداب الأولية هو إجراء بسيط نسبيًا ينتج عنه صور عالية الجودة. في هذه التجارب، كانت الخلايا الليفية التي تعبر عن أهداب أولي ثابتة، ومثبطة للمناعة، ومصوّبة في مجهر فلوري أو مجهري متوازٍ باتباع البروتوكول الموصوف أعلاه. تم الكشف عن السيليوم الابتدائي باستخدام أسيتيل α-tubulin و γ-tubuli...

Discussion

وقد وصف العديد من المؤلفين أساليب متنوعة للكشف عن أهداب الأولية، وأحيانا أيضا وصف مختلف طرق التثبيت التي يمكن أن تؤثر على الكشف^{6،20،21،22}. بغض النظر عن ذلك، من الصعب العثور على بروتوكول كامل ومباشر للكشف. ومما لا شك فيه أن ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	TPP	92406	Dimensions 128x86x22 mm
Alexa Fluor488	Jackson ImmunoResearch	111-546-047	AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Rabbit IgG
Anti-Tubulin γ	Sigma-Aldrich	T5192	Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a
C2C12	ATCC	CRL-1772	Myoblast (mouse)
Cy3	Sigma-Aldrich	C2181	Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep
Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	D9542
Dulbecco´s Modified Eagle´s medium	Thermo Scientific	11960044	High glucose, No glutamine, Gibco
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8662	With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	16000044	Sterile-Filtered, Gibco
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
MEF	ATCC	SCRC-1039	Mouse embryonic fibroblast
Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin	Sigma-Aldrich	T7451	Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse
NHLF	Lonza	CC-2512	Primary lung fibroblasts (human)
Normal Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G	Powder
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo Scientific	P36961
Skin fibroblasts	Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové.
Square Cover Slips	Thermo Scientific	22X22-1.5	Borosilicate glass, 22x22mm, Square
Triton X-100	Sigma-Aldrich	11332481001
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Scientific	25200072	Sterile-Filtered, Gibco