Détection simple des cils primaires par immunofluorescence

Résumé

Les cils primaires sont des structures extracellulaires associées au centriole. La détection primaire des cils par coloration immunofluorescente est une procédure relativement simple qui se traduit par des images de haute qualité. Dans ce protocole, les fibroblastes exprimant des cils primaires ont été fixés, immunostained, et photographiés dans un microscope fluorescent ou confocal.

Résumé

Les cils primaires sont régulés dynamiquement au cours de la progression du cycle cellulaire, en particulier pendant les phases G0/G1 du cycle cellulaire, étant résorbés avant la mitose. Les cils primaires peuvent être visualisés avec des méthodes très sophistiquées, y compris la microscopie électronique de transmission, l’imagerie 3D, ou en utilisant un logiciel pour la détection automatique des cils primaires. Cependant, la coloration immunofluorescente des cils primaires est nécessaire pour effectuer ces méthodes. Cette publication décrit un protocole pour la détection facile des cils primaires in vitro en tachant la tubuline alpha acétylée (axoneme) et la tubuline gamma (corps basal). Ce protocole de coloration immunofluorescente est relativement simple et donne des images de haute qualité. Le présent protocole décrit comment quatre lignées cellulaires (C2C12, MEF, NHLF et fibroblastes cutanés) exprimant des cils primaires ont été fixées, immunostainées et imageuses à l’aide d’un microscope fluorescent ou confocal.

Introduction

Les cils primaires sont des structures sensorielles, solitaires, liées à la membrane, non-motiles associées au centriole mère de la cellule. Les cils primaires se trouvent sur la plupart des cellules vertébrées, à l’exception des globules rouges, des adipocytes¹et des hépatocytes². Les cils primaires sont formés sous forme d’axoneme allongé composé de microtubules, dont le principal composant est l’α-tubuline. L’axoneme pousse à partir du corps basal, qui est structuré à partir de γ-tubuline. La longueur des cils primaires varie entre 2 et 10 μm; cependant, ses dimensions peuvent changer pendant la glycylation, la famine, l’hypoxie, le stress cytotoxique, ou après exposition au rayonnement ionisant^3,4,5,6,7. Habituellement, les cellules n’ont qu’un seul cilium primaire, qui est impliqué dans la morphogenèse et les voies de signalisation cellulaire importantes pour la prolifération cellulaire et la différenciation^8,9.

Les cils primaires sont régulés dynamiquement au cours de la progression du cycle cellulaire, en particulier pendant les phases G0/G1, et résorbés avant d’entrer dans la mitose dans un processus associé à la déacétylation de tubuline médiée par HDAC6 (histone deacetylase 6)¹⁰. Le moment exact de la résorption primaire des cils dépend du type de cellule et de l’expression des gènes directement impliqués dans ce processus, tels que Aurora A, Plk1, TcTex-1^11,12,13. Selon le type de cellule, les cils primaires expriment différents types de récepteurs, canaux ions et voies de signalisation actives. Il s’agit notamment des récepteurs de signalisation les plus importants affectant la prolifération et la survie, EGFR, PDGFR, et FGFR. Sont également inclus quelques-unes des voies de signalisation qui peuvent affecter la fonction d’un ou plusieurs organes, y compris hedgehog, Notch, et Wnt. Grâce à ces récepteurs et voies de signalisation, les cils primaires effectuent également une fonction chimiosensorielle. Cette fonction permet aux cils primaires de détecter des ligands spécifiques pour Notch, les hormones et les substances biologiquement actives comme la sérotonine ou la somatostatine. D’autres fonctions spécifiques exposées par des cils primaires de différentes longueurs incluent la réaction aux changements de température, de gravité et d’osmolalité¹⁴.

Les cils primaires peuvent être visualisés par diverses méthodes, telles que la visualisation en direct, la microscopie électronique de transmission, l’imagerie 3D, ou par logiciel pour la détection automatique des cils primaires^5,15,16,17. Cependant, ces méthodes sont hautement spécialisées et la recherche continue a besoin de méthodes de base, rapides et faciles pour tacher les cils primaires à chaque étape de la recherche. Décrit est une méthode facile et utile pour la détection des cils primaires dans les cellules cultivées.

Protocole

1. Préparation des supports culturels, des solutions et des plats

1. Autoclavez les couvercles (22 x 22 mm). Préparer 6 assiettes de puits. Décongeler le sérum bovin fœtal (FBS) et la pénicilline/streptomycine antibiotique et réchauffer la température moyenne à ambiante (RT). Utiliser trypsin-EDTA (0.25%) et 1x PBS (saline tamponnée de phosphate avec calcium et magnésium) pour passer les cellules.
2. Préparer du paraformaldéhyde frais à 4 % (PFA) en dH₂O (800 mg de PFA dans 20 mL de dH₂O). La PFA doit être fraîchement préparée pour chaque expérience. Remuer et chauffer la solution à 55 °C pendant 30 min dans le capot. Refroidir à RT. Ajouter 1 M d’hydroxyde de sodium jusqu’à ce que la solution devienne claire (pH = 7,2–7,4). Conserver à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
   Note: PFA est toxique; toujours porter un équipement de protection individuelle adéquat et se préparer dans le capot chimique.
3. Préparer 500 mL de supports de culture, DMEM (le milieu de l’aigle modifié de Dulbecco) contenant 10% FBS, 1% de pénicilline/streptomycine, et 2% de glutamine.
4. Préparer 13 mL de 1% de solution de gélatine en dH stérile₂O (130 mg de gélatine dans 13 mL de dH₂O). Utilisez 2 mL de gélatine de 1% pour chaque puits dans une assiette de 6 puits. Restez stérile.
5. Nettoyez le capot d’écoulement laminaire à l’aide de 70 % d’éthanol. Placez le matériau requis à l’intérieur du capot d’écoulement laminaire avant de commencer l’expérience.

2. Culture cellulaire pour la coloration immunocytochimie

1. Décongeler les cellules (dans cette étude C2C12, MEF, NHLF, et fibroblastes de la peau) en utilisant des techniques standard et les plaquer dans une fiole T75 complétée par ~10–12 mL des médias préparés. Incuber à 37 °C/5% CO_{2 /90%}d’humidité relative (RH) jusqu’à ce que les cellules atteignent 70% confluence.
2. Retirez les cellules de l’incubateur et placez-les dans le capot d’écoulement laminaire. Retirez le support de culture et rincez brièvement les cellules 2x avec 1x PBS. Ajouter ~2 ml de 0,25% trypsin-EDTA dans la fiole T75 et incuber à 37 °C pendant ~5 min. Vérifiez périodiquement sur le microscope inversé pour surveiller le détachement cellulaire.
   REMARQUE : Le temps d’incubation dépend de la ligne cellulaire et doit donc être déterminé empiriquement.
3. Resuspendez doucement les cellules dans 10 mL de supports de culture, en pipeting soigneusement pour créer une suspension à cellule unique. Rincer à nouveau la fiole si nécessaire.
4. Placez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 mL et une centrifugeuse pendant 5 min à ~200 x g. Décanter le supernatant, ajouter 10 mL de supports de culture, et resuspender doucement le granulé. Prenez 20 μL de la suspension cellulaire et mélangez-les dans un rapport de 1:1 avec le bleu trypan et comptez dans un cytomètre suivant la méthode standard.
5. Placez un couvercle à l’intérieur de chaque puits d’une plaque de 6 puits à l’aide de pinces à épiler. Enrober les couvercles de gélatine en versant ~2 mL dans les puits. Cela aidera les cellules à s’attacher aux couvercles. Retirer la solution de gélatine et laisser sécher à l’air pendant quelques minutes. Les couvercles sont maintenant prêts pour la culture des cellules. Commencez la culture immédiatement.
6. Détemêlez 100 000 fibroblastes dans chaque puits et ajoutez 2 mL de supports culturels. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C/5% CO₂/90% RH. À ce stade, les cellules peuvent être traitées en fonction des besoins de l’utilisateur. Les traitements pour induire la ciliation ont été précédemment^{décrits 4,5}.
   REMARQUE : Le nombre initial d’ensemencement dépend du temps de doublement des cellules et doit être déterminé en conséquence.

3. Coloration immunofluorescente des cils primaires in vitro

1. Chauffer le paraformaldéhyde à 4 % à RT. Préparer les pipettes Pasteur, 1x PBS (RT), le contenant de déchets, les tubes coniques de 15 mL, les micropipettes (0,5–10 μL, 20–200 μL et 100–1 000 μL) et les pointes. Prenez les cellules de l’incubateur et placez-les sur le banc.
   REMARQUE : La procédure de coloration n’a pas besoin d’être effectuée dans des conditions stériles. Toutes les solutions doivent être à RT.
2. Retirez les supports de chaque puits. Laissez le couvercle à l’intérieur du puits. Laver très doucement les cellules 3x avec 2 mL de 1x PBS. À l’aide d’une pipette Pasteur, ajouter 2 mL de 4 % de PFA dans chaque puits pour fixer les cellules. Incuber pendant 10 min à RT. Retirer la PFA et laver 3x avec 1x PBS.
   REMARQUE : Utilisez toujours un volume suffisant pour couvrir l’intégralité du couvercle pendant les périodes d’incubation. Ne laissez jamais sécher les cellules. Ne versez jamais aucune des solutions directement sur le couvercle.
3. Préparer 0,5% Triton X-100 en 13 mL de 1x PBS 10 min avant utilisation. Ajouter 2 mL dans chaque puits. Incuber pendant 15 min. Laver doucement 4x avec 1x PBS.
   REMARQUE : Triton X-100 est insoluble dans PBS à RT. Chauffer la solution Triton X-100 de 0,5 % à 37 °C dans un bain d’eau pour la dissoudre.
4. Décongeler le sérum de chèvre 5 min avant utilisation. Diluer le sérum de chèvre en 1x PBS dans un rapport de 1:20 comme solution de blocage. Ajouter 150 μL à chaque couvercle et incuber pendant 20 min à RT.
   REMARQUE : Prolongez la période de blocage jusqu’à 60 min si nécessaire. Ne pas laver les cellules après le blocage avec du sérum de chèvre.
5. Décongeler les anticorps primaires (c.-à-d. alpha tubuline anti-acétylée et tubuline anti-gamma) 5 min avant utilisation. Diluer les anticorps séparément dans 1x PBS comme suit: souris anti-acétylated alpha tubuline dans un rapport de 1:800 et lapin anti-gamma tubuline dans un rapport de 1:300. Supprimez la solution de blocage. Ne vous lavez pas. Ajouter 150 μL des deux dilutions d’anticorps aux couvercles et incuber pendant 60 min à RT.
   REMARQUE : Si vous couverez pendant la nuit utiliser 500–1 000 μL des solutions d’anticorps primaires, sceller la plaque de 6 puits avec du film de paraffine, et stocker à 4 °C. Sinon, utilisez 150 μL d’anticorps et incuber dans une chambre d’humidité.
6. Retirez les anticorps primaires. Laver les couvercles très doucement 3x avec 2 mL de 1x PBS. Préparer les anticorps secondaires en 1x PBS en diluant séparément l’anti-souris de mouton Cy3 et l’anti-lapin de chèvre Alexa Fluor488 dans un rapport de 1:300. Ajouter 150 μL des deux dilutions d’anticorps secondaires aux couvercles. Incuber pendant 45 min à RT dans l’obscurité.
   REMARQUE : Incuber dans l’obscurité pour éviter le photobleaching. D’autres combinaisons d’anticorps secondaires peuvent être utilisées au besoin.
7. Préparer une solution DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) selon les instructions du fabricant. Conserver l’excédent d’aliquots à -20 °C. Diluer 10 μL à partir d’un aliquot de stock (1:5,000) dans 50 mL de 1x PBS. Ajouter 2 mL de cette dilution aux couvercles. Incuber pendant 5 min à RT dans l’obscurité.
   REMARQUE : Il est important d’incuber les cellules dans l’obscurité pour éviter le photobleaching. La dilution du DAPI peut être stockée à 4 °C jusqu’à 1 mois.
8. Préparez 2 aiguilles, toboggans, pinces à épiler et supports de montage. Étiqueter les diapositives.
9. Retirez la solution DAPI des puits. Laver 3x avec 1x PBS. Mettez une goutte de support de montage sur chaque diapositive. Utilisez l’aiguille pour soulever doucement le couvercle du fond du puits. Retournez le couvercle à l’aide de la pince à épiler et placez-le doucement sur la goutte de support de montage. Retirez soigneusement les bulles.
10. Protégez les lames de la lumière et rangez-les toute la nuit à 4 °C.
11. Utilisez un microscope fluorescent ou confocal avec un grossissement élevé pour visualiser les cils primaires.
    REMARQUE : Les lames peuvent être stockées dans l’obscurité à 4 °C pendant jusqu’à 2 mois.

Résultats

La coloration immunofluorescente des cils primaires est une procédure relativement simple qui se traduit par des images de haute qualité. Dans ces expériences, les fibroblastes exprimant les cils primaires ont été fixés, immunostained, et photographiés dans un microscope fluorescent ou confocal suivant le protocole décrit ci-dessus. Le cilium primaire a été détecté à l’aide d’acétylated α-tubuline et γ-tubuline. L’évaluation des cils primaires peut être effectuée à divers niveaux et tout changem...

Discussion

Plusieurs auteurs ont décrit diverses méthodes pour la détection des cils primaires, décrivant parfois également diverses méthodes de fixation qui peuvent affecter leur détection^6,20,21,22. Quoi qu’il en soit, il est difficile de trouver un protocole complet et simple pour la détection. La disponibilité immédiate d’une telle méthode serait sans aucun doute d’une grande aide à ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	TPP	92406	Dimensions 128x86x22 mm
Alexa Fluor488	Jackson ImmunoResearch	111-546-047	AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Rabbit IgG
Anti-Tubulin γ	Sigma-Aldrich	T5192	Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a
C2C12	ATCC	CRL-1772	Myoblast (mouse)
Cy3	Sigma-Aldrich	C2181	Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep
Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	D9542
Dulbecco´s Modified Eagle´s medium	Thermo Scientific	11960044	High glucose, No glutamine, Gibco
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8662	With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	16000044	Sterile-Filtered, Gibco
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
MEF	ATCC	SCRC-1039	Mouse embryonic fibroblast
Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin	Sigma-Aldrich	T7451	Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse
NHLF	Lonza	CC-2512	Primary lung fibroblasts (human)
Normal Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G	Powder
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo Scientific	P36961
Skin fibroblasts	Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové.
Square Cover Slips	Thermo Scientific	22X22-1.5	Borosilicate glass, 22x22mm, Square
Triton X-100	Sigma-Aldrich	11332481001
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Scientific	25200072	Sterile-Filtered, Gibco