JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم تقديم بروتوكول لتصنيع جهاز ورقي لإثراء وعزل الميكروبات والكوسومات بشكل فعال.

Abstract

microvesicles وicssosomes هي الحويصلات membranous الصغيرة التي تم إصدارها إلى البيئة خارج الخلية وتعميمها في جميع أنحاء الجسم. ولأنها تحتوي على جزيئات بيولوجية مشتقة من خلايا أبوية مختلفة مثل الحمض النووي، والميرنا، والميرنا، والبروتينات، والدهون، فإن إغناءها وعزلها هما خطوتان حاسمتان لاستغلالهما كمعلمات بيولوجية محتملة للتطبيقات السريرية. ومع ذلك، فإن طرق العزل التقليدية (مثل الطرد الشديد) تسبب خسائر كبيرة وأضرار في الميكروسات الدقيقة. تتطلب هذه الطرق أيضًا خطوات متكررة متعددة للطرد الشديد التركيز والتحميل وإهدار الكواشف. توضح هذه المقالة طريقة مفصلة لاختلاق جهاز الورق اوريغامي القائم على (Exo-PAD) مصممة لإثراء فعالة وعزلة من microvesicles و exosomes بطريقة بسيطة. إن التصميم الفريد لـ Exo-PAD، الذي يتكون من طبقات متعددة الطبقات الشبيهة بالأكورديون مع مناطق عينة متقاربة، مدمج مع تقنية استقطاب تركيزات الأيونات، مما يتيح إثراء خمسة أضعاف من الطبقات الدقيقة والأكسوسوم على طبقات محددة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم عزل microvesicles المخصب واكسوسوم ببساطة من خلال تتكشف إكسو-PAD.

Introduction

الدقيقة والويسوس هي غشاء صغير الحويصلات قياس 0.2−1 ميكرومتر و 30-200 نانومتر، على التوالي. ويفرز في بيئة خارج الخلية من قبل عدة أنواع مختلفة من الخلايا1،2،3،4،5. أنها تحتوي على معلومات الخلية الأبوية في شكل مجموعات فرعية من الحمض النووي، مرنا، ميرنا، البروتينات، والدهون، وتدور في جميع أنحاء الجسم عن طريق سوائل الجسم المختلفة مثل المصل، والبلازما، والبول، والسوائل النخاعية، السائل الأمنيوسي، واللعاب6،,7،,8،,9. وهكذا، يمكن أن توفر تقنيات العزل الفعال للميكروسات الدقيقة والإكسوسومات من السوائل البيولوجية فرصًا واسعة في مجالات التشخيص والتكهن والرصد في الوقت الفعلي للمرض، وكذلك في تطوير علاجات جديدة.

ومع ذلك، فإن طريقة العزل التقليدية للميكروسينتوريس و الكوسومات القائمة على الطرد فوق المركز تستغرق وقتاً طويلاً للغاية وتسبب خسارة كبيرة وتلوث العينة. وذلك لأنه ينطوي على عدة خطوات مرهقة pipetting والتحميل والتخلص من الكواشف المختلفة مع تكرار الrifugation5،6،10،11،12. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يسبب الإجهاد القص عالية الناجمة عن الطاردة المفرطة (~ 100،000 س ز) التحلل المادي من microvesicles واكسوزومات، مما يؤدي إلى معدلات انتعاش الفقراء (5-23٪)6،,13،,14. ولذلك، يجب تطوير تقنية عزل عالية الكفاءة وغير مزعجة للميكروفيسيليس واكسوسومات للحد من الأضرار والفقدان، وبالتالي تحقيق معدلات أعلى للتعافي.

تم تطوير جهاز اوريغامي ورقة المستندة (Exo-PAD) لعزل أبسط وألطف، وكفاءة عالية من microvesicles و exosomes6. تصميم EXO-PAD هو ورقة متعددة المستويات مع مناطق عينة متصلة بشكل تسلسلي التي تتناقص تدريجيا في القطر. تم دمج تقنية استقطاب تركيز الأيوني (ICP) ، وهي ظاهرة نانو كهربية مركزية تعمل قبل التركيز على الجزيئات الحيوية المشحونة ، مع هذا التصميم الفريد. أدى استخدام EXO-PAD إلى إثراء خمسة أضعاف من microvesicles وicsos في طبقات محددة وعزلها ببساطة عن طريق الكشف عن الجهاز. توضح هذه المقالة EXO-PAD بالتفصيل، من التصنيع العام للجهاز وتشغيله إلى تحليل استخدامه، لتوضيح الأسلوب وإظهار النتائج التمثيلية6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تصنيع الأجهزة

  1. تحديد المنطقة التي سيتم طباعتها على الورق باستخدام برنامج الطابعة(جدول المواد).
    ملاحظة: يحتوي التصميم على 12 طبقة منقوشة بالشمع حيث تضيق أقطار مناطق العينة الدائرية تدريجياً من 5 ملم إلى 2 مم(الشكل 1A).
  2. طباعة الشمع الهيدروفوس على المناطق المعينة على جانبي ورقة السليلوز (جدول المواد) باستخدام طابعة شمعية تجارية (جدول المواد) (الشكل 1B).
  3. ضع الورق المطبوع بالشمع في فرن المختبر لمدة 80 درجة مئوية عند 120 درجة مئوية.
    ملاحظة: تسمح هذه الخطوة الشمع للوصول إلى داخل ورقة من خلال تحقيق إعادة تدفق الحرارية من الشمع المطبوعة. مع هذا البروتوكول الحضانة، والقرار من نمط هو ~ 2 ملم. وبالتالي، يجب الحرص على عدم طباعة أنماط أقل من 2 ملم. وإلا سيتم حظر أنماط من قبل الشمع.
  4. قطع ورقة الشمع المطبوعة مع القاطع لجعل الأجهزة الفردية (الشكل 1C).
  5. إسقاط 5 ميكرولتر و 2 ميكرولتر من غشاء permselective (على سبيل المثال، نافيون؛ جدول المواد) على مناطق العينة في أقصى اليمين والطبقات أقصى اليمين ، على التوالي (الشكل 1D).
  6. ضع الطبقات المغلفة بالغشاء المتمحدد على صفيحة ساخنة عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتتبخر مذيب الغشاء المتمحدد.
  7. ختم السطح الخارجي للطبقة المطلية التي تواجه الحل العازلة مع الشريط الحساس للضغط، وترك ثقب صغير.
  8. أضعاف الجهاز الفردية المطبوعة (أي، إكسو-PAD) ذهابا وإيابا على طول الخطوط البيضاء.
    ملاحظة: عن طريق طي الجهاز، تصبح جميع مناطق العينة متصلة بشكل متقارب(الشكل 1E). ويركز هذا التصميم المتقارب خطوط الحقل الكهربائية عندما يتم تطبيق الجهد على برنامج المقارنات الدولية، مما يحقق تركيزًا مسبقًا أكثر كثافة للميكروفيسلات واكسوسومس.

2- إثراء التركيز المكاني للميكروسينت واكسوسومات الإكسوسات بواسطة استقطاب تركيزات الأيونات

  1. تحميل 15 ميكرولتر من العينة الدقيقة واكسوسوم (~ 3 ×10 10 جسيمات / مل في 0.1x الفوسفات المخزنة المالحة [PBS] مع 0.05٪ توين 20) في مناطق العينة متقاربة عن طريق الأنابيب والانتظار بضع ثوان لضمان إكمال نحن من جميع مناطق العينة (الشكل 1F).
  2. مكان غرفتين الاكريليك في كلا طرفي EXO-PAD ومشابك EXO-PAD بشكل آمن مع مقاطع الموثق الصغيرة لمنع تتكشف(الشكل 1G).
  3. ملء الغرف مع 110 μL من 0.1x PBS وإدراج اثنين Ag / AgCl الأقطاب الكهربائية (الشكل 1H).
  4. تطبيق 30 V إلى الأقطاب الكهربائية لمدة 20 دقيقة باستخدام نظام قياس مصدر التيار الجهد(جدول المواد).
    ملاحظة: الجهد التطبيقي يولد ظاهرة برنامج المقارنات الدولية وبالتالي preconcentrates microvesicles و exosomes على الطبقات 8 و 9 من EXO-PAD.

3- عزل الميكروفيسات والأكسوسومات الغنية

  1. فصل مطوي Exo-PAD من غرف الاكريليك وتتكشف الجهاز لعزل microvesicles المخصب واكسوسوم من الطبقات الأخرى (الشكل 1I).
  2. لكمة خارج مناطق العينة في الطبقات 8 و 9، حيث يتم إثراء microvesicles و exosomes، لتحليل المصب(الشكل 1J).

4. مسح التحليل المجهري الإلكتروني

  1. إصلاح microvesicles المخصب واكسوسومات عن طريق غمر المناطق لكمات في 2.5٪ glutaraldehyde في 0.1 M الصوديوم cacodylate العازلة لمدة 1 ساعة وفي 1٪ أوسميوم تتراوكسيد في 0.1 M كاوديلات الصوديوم لمدة 1 ساعة.
    تنبيه: أوزميوم تتروكسيد مادة كيميائية شديدة السامة والخطرة. لأن أوزميوم تيتروكسيد يمكن أن تخترق البلاستيك، يجب أن تكون مخزنة في الزجاج. يجب أن يتم إجراء أي معالجة من التيتروكسيد osmium في غطاء الدخان الكيميائية مع قفازات النتريل مزدوجة.
  2. يجفف الدقيق الثابت والاكسوسوم مع درجات تصاعدية من 200 الايثانول دليل (أي 50٪، 70٪، 90٪، و 100٪) لمدة 30 دقيقة لكل من.
  3. قم بتجفيف العينة كيميائيًا عن طريق غمرها في سداسية الميثيليديسيلازان في جهاز تجفيف لمدة 30 دقيقة.
    تنبيه: Hexamethyldisilazane مادة كيميائية قابلة للاشتعال وحساسة للرطوبة. يجب تخزينها في منطقة جافة وجيدة التهوية بعيدا عن مصادر الاشتعال.
  4. معطف microvesicles المجففة تماما وicsosomes مع الذهب / البلاديوم (~ 20 نانومتر) عن طريق sputtering والتقاط المجهر الإلكتروني المسح (SEM) الصور.

5. تحليل تتبع الجسيمات النانوية

  1. لكمة خارج مناطق العينة في طبقات 6 و 8 و 10 باستخدام لكمة خزعة بعد 20 دقيقة من عملية الجهاز.
  2. غمر كل منطقة بالكم في محلول عازل (0.1x PBS مع 0.01٪ Tween 20).
  3. دوامة لمدة 10 دقيقة والطرد المركزي لمدة 30 s في 6000 دورة في الدقيقة لإعادة الاعتماد على microvesicles المخصب وexosomes.
  4. إزالة المناطق لكمات التدريجي من الحل وقياس تركيز microvesicles واكسوسومس من قبل تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) الصك (جدول المواد).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يجب أن يكون الوقت عملية الأمثل لتحقيق أقصى عائد الانتعاش من microvesicles المخصب واكسوسوم. عدم كفاية الوقت لا يسمح هجرة كافية من microvesicles وicsssومات، مما يقلل من الإثراء، في حين أن الوقت المفرط يتدهور التركيز المكاني وبالتالي يثر microvesicles وicsss. وهكذا، من خلال خطوة التحسين الوقت، يمكن تحديد عامل الترك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

على الرغم من أن EXO-PAD استخدمت بنجاح لإثراء وعزل microvesicles وicsos، ينبغي النظر بعناية عدة نقاط حرجة: 1) وقت حضانة الفرن ودرجة الحرارة أثناء إعداد الجهاز، 2) وقت المعالجة، 3) تطبيق الجهد مع أرقام طبقة متفاوتة وأقطار منطقة العينة، و 4) إمكانية التطبيق على العينات السريرية.

وقت الحضانة و?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد دعمت هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا، منحة NRF-2018R1D1A1A090840444. تم دعم J. H. Lee بمنحة بحثية من جامعة كوانجون في عام 2019. 11- وقد تلقى هيرين كيم الدعم من "برنامج تطوير الكفاءة للمتخصصين في الصناعة" التابع لوزارة التجارة والصناعة والطاقة الكورية، الذي يديره المعهد الكوري للنهوض بالتكنولوجيا (KIAT) (رقم 1999). P0002397، HRD برنامج التقارب الصناعي للأجهزة الذكية القابلة للارتداء).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ag/AgCl electrodesA-M Systems, Inc.5315000.15" diameter
Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugateThermo Fisher ScientificA13101BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Carbonate-Bicarbonate BufferSigma-AldrichC3041-50CAPCarbonate buffer
CorelDraw software (Coral Co., Canada)Corel CorporationPrinter software to define wax printing region
ColorQube 8870Xerox CorporationWax printer
Chromatography paper grade 1Whatman3001-861Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm
Fluorescent-labeled exosome standardsHansaBioMed Life Sciences, Ltd.HBM-F-PEP-100Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 current/voltage source-meterKeithley Instruments, Inc.Current–voltage source measurement system
Nafion perfluorinated resin solutionSigma-Aldrich31175-20-9Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water
NanoSight LM10NanoSight TechnologyNanoparticle tracking analysis (NTA) machine
Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4)Thermo Fisher Scientific10010001

References

  1. Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).
  2. Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).
  3. Simons, M., Raposo, G. Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication. Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).
  4. Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).
  5. Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (98), e52722(2015).
  6. Kim, H., et al. Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation. Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).
  7. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  8. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).
  9. Liu, C., et al. Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows. ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).
  10. Marczak, S., et al. Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization. Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).
  11. Livshts, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  12. Chiriacò, M. S., et al. Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization. Sensors. 18 (10), 3175(2018).
  13. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).
  14. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  15. Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).
  16. Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

158 microfluidics microvesicle exosome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved