Préconcentration et isolation des microvesicules et des exosomes sur papier

Résumé

Présenté est un protocole pour fabriquer un dispositif à base de papier pour l’enrichissement et l’isolement efficaces des microvesicules et des exosomes.

Résumé

Les microvesicules et les exosomes sont de petites vésicules membraneuses libérées dans l’environnement extracellulaire et distribuées dans tout le corps. Étant donné qu’ils contiennent diverses biomolécules d’origine cellulaire parentale telles que l’ADN, l’ARNm, le miARN, les protéines et les lipides, leur enrichissement et leur isolement sont des étapes essentielles pour leur exploitation en tant que biomarqueurs potentiels pour les applications cliniques. Toutefois, les méthodes d’isolement conventionnelles (p. ex., l’ultracentrifugation) causent des pertes et des dommages importants aux microvesicules et aux exosomes. Ces méthodes nécessitent également de multiples étapes répétitives d’ultracentrifugation, de chargement et de gaspillage de réactifs. Cet article décrit une méthode détaillée pour fabriquer un dispositif à base de papier origami (Exo-PAD) conçu pour l’enrichissement et l’isolement efficaces des microvesicules et des exosomes d’une manière simple. La conception unique de l’Exo-PAD, composée de couches multiples en forme d’accordéon avec des zones d’échantillonnage convergentes, est intégrée à la technique de polarisation de la concentration des ions, permettant ainsi un enrichissement quintuple des microvesicules et des exosomes sur des couches spécifiques. En outre, les microvesicules enrichies et les exosomes sont isolés en déployant simplement l’Exo-PAD.

Introduction

Les microvesicules et les exosomes sont de petites vésicules membranaires mesurant respectivement 0,2−1 μm et 30−200 nm. Ils sont sécrétés dans l’environnement extracellulaire par plusieurs types de cellules différents^1,2,3,4,5. Ils contiennent des informations relatives aux cellules parentales sous forme de sous-ensembles d’ADN, d’ARNm, de miARN, de protéines et de lipides, et circulent dans tout le corps via divers fluides corporels tels que le sérum, le plasma, l’urine, le liquide céphalo-rachidien, le liquide amniotique et la salive^6,,7,8,9. Ainsi, les techniques d’isolement efficace des microvesicules et des exosomes des fluides biologiques peuvent fournir de vastes possibilités dans les domaines du diagnostic, du pronostic et de la surveillance en temps réel de la maladie, ainsi que dans le développement de nouvelles thérapies.

Cependant, la méthode d’isolement conventionnelle pour les microvesicules et les exosomes basée sur l’ultracentrifugation prend énormément de temps et entraîne une perte et une contamination importantes de l’échantillon. C’est parce qu’il implique plusieurs étapes lourdes de pipetage et de chargement et le rejet de divers réactifs avec ultracentrifugation répétée^5,6,10,11,12. En outre, le stress de cisaillement élevé induit par l’ultracentrifugation (~100 000 x g)peut causer la lyse physique des microvesicules et des exosomes, ce qui donne de faibles taux de récupération (5−23%)^6,13,14. Par conséquent, une technique d’isolement discrète et très efficace pour les microvesicules et les exosomes doit être développée pour réduire les dommages et les pertes, atteignant ainsi des taux de récupération plus élevés.

Un dispositif origami-papier (Exo-PAD) a été développé pour un isolement plus simple, plus doux et très efficace des microvesicules et des exosomes⁶. La conception de l’Exo-PAD est un papier multifréqué avec des zones d’échantillonnage reliées en série qui diminuent progressivement de diamètre. La technique de polarisation de la concentration des ions (ICP), qui est un phénomène nano-électrocinétique qui préconcentre les biomolécules chargées par les préconcentrés, a été intégrée à cette conception unique. L’utilisation de l’Exo-PAD a entraîné un enrichissement quintuple des microvesicules et des exosomes dans des couches spécifiques et leur isolement en déroulant simplement l’appareil. Cet article décrit l’Exo-PAD en détail, de la fabrication et de l’exploitation globales de l’appareil à l’analyse de son utilisation, pour illustrer la méthode et afficher des résultats représentatifs⁶.

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Protocole

1. Fabrication d’appareils

1. Définir la région à imprimer sur papier à l’aide d’un logicield’imprimante( Table des matériaux ).
   REMARQUE : La conception comporte 12 couches à motifs de cire dans lesquelles les diamètres des zones d’échantillonnage circulaires se rétrécissent progressivement de 5 mm à 2 mm (figure 1A).
2. Imprimer de la cire hydrophobe sur les régions désignées des deux côtés du papier cellulosique ( Tableau des matériaux) àl’aide d’uneimprimante de cire commerciale (Tableau des matériaux) ( Figure1B).
3. Placer le papier imprimé ciré dans un four de laboratoire pendant 80 s à 120 °C.
   REMARQUE : Cette étape permet à la cire d’atteindre l’intérieur du papier en réalisant un réflow thermique de la cire imprimée. Avec ce protocole d’incubation, la résolution du motif est de ~2 mm. Ainsi, veillez à ne pas imprimer des motifs de moins de 2 mm. Sinon, les motifs seront bloqués par la cire.
4. Couper le papier imprimé ciré à l’aide d’un coupeur pour fabriquer des appareils individuels (figure 1C).
5. Baisse de 5 μL et de 2 μL de membrane permsélective (p. ex., Nafion; Tableau des matériaux) sur les zones d’échantillonnage dans les couches les plus à gauche et à droite, respectivement (figure 1D).
6. Placez les couches recouvertes de la membrane permsélective sur une plaque chauffante à 70 °C pendant 30 min pour évaporer le solvant de membrane permsélective.
7. Sceller la surface la plus externe de la couche enduite face à la solution tampon avec du ruban sensible à la pression, laissant un petit trou.
8. Pliez l’appareil individuel imprimé (c.-à-d. Exo-PAD) d’avant en arrière le long des lignes blanches.
   REMARQUE : En pliant l’appareil, toutes les zones d’échantillonnage deviennent convergentes (figure 1E). Cette conception convergente concentre les lignes de champ électrique lorsque la tension est appliquée pour ICP, réalisant une préconcentration plus intensive des microvesicules et des exosomes.

2. Enrichissement et focalisation spatiale des microvesicules et des exosomes par polarisation de la concentration d’ions

1. Chargez 15 μL de l’échantillon de microvesicle et d’exosome (~3 x 10¹¹ particules/mL en 0,1x de phosphate tamponné saline [PBS] avec 0,05% Tween 20) dans les zones d’échantillonnage convergentes en pipeting et attendre quelques secondes pour assurer le mouillage complet de toutes les zones d’échantillonnage (Figure 1F).
2. Placez deux chambres acryliques aux deux extrémités de l’Exo-PAD et serrez l’Exo-PAD en toute sécurité avec de petits pinces à reliure pour éviter le déploiement (Figure 1G).
3. Remplissez les chambres de 110 μL de 0,1 x PBS et insérez deux électrodes Ag/AgCl (Figure 1H).
4. Appliquer 30 V sur les électrodes pendant 20 min à l’aide d’un système de mesure de la source de tension de courant (Table des matériaux).
   REMARQUE : La tension appliquée génère le phénomène ICP et préconcentre donc les microvesicles et les exosomes sur les couches 8 et 9 de l’Exo-PAD.

3. Isolation des microvesicules et exosomes enrichis

1. Séparez l’Exo-PAD plié des chambres acryliques et dépliez l’appareil pour isoler les microvesicules enrichies et les exosomes des autres couches (Figure 1I).
2. Éperner les zones d’échantillonnage dans les couches 8 et 9, où les microvesicules et les exosomes sont enrichis, pour l’analyse en aval (Figure 1J).

4. Analyse de microscopie électronique à balayage

1. Fixer les microvesicules enrichies et les exosomes en immergeant les zones perforées dans 2,5% de glutaraldéhyde dans 0,1 M tampon de cacodylate de sodium pour 1 h et dans 1% de tétroxide d’osmium dans 0,1 M de cacodylate de sodium pendant 1 h.
   ATTENTION : Le tétroxide d’osmium est un produit chimique hautement toxique et dangereux. Parce que le tétroxide d’osmium peut pénétrer dans les plastiques, il doit être stocké dans le verre. Toute manipulation de tétroxide d’osmium doit être effectuée dans un capot de fumée chimique avec des gants de nitrule double.
2. Déshydrater les microvesicules fixes et les exosomes avec des teneurs ascendantes de 200 éthanols de preuve (c.-à-d. 50%, 70%, 90%, et 100%) pendant 30 min chacun.
3. Sécher chimiquement l’échantillon en l’immergeant dans l’hexaméthyldisilazane dans un desiccateur pendant 30 min.
   ATTENTION : Hexaméthyldisilazane est un produit chimique inflammable et sensible à l’humidité. Il doit être stocké dans une zone sèche et bien aérée, à l’écart des sources d’inflammation.
4. Enrober les microvesicules et les exosomes complètement séchés d’or/palladium (~20 nm) par pulvérisation et capture de microscopie électronique à balayage (SEM).

5. Analyse de suivi des nanoparticules

1. Poinçonnez les zones d’échantillon dans les couches 6, 8 et 10 à l’aide d’un poinçon de biopsie après 20 min d’opération de l’appareil.
2. Plongez chaque zone perforée dans une solution tampon (0,1 x PBS avec 0,01% Tween 20).
3. Vortex pendant 10 min et centrifugeuse de 30 s à 6 000 tr/min pour réutiliser les microvesicules enrichies et les exosomes.
4. Retirer les zones perforées de la solution et mesurer la concentration de microvesicules et d’exosomes par un instrument d’analyse de suivi des nanoparticules (NTA)(Tableau des matériaux).

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Résultats

Le temps d’opération doit être optimisé pour atteindre le rendement maximal de récupération des microvesicles enrichis et des exosomes. Le temps insuffisant ne permet pas une migration suffisante des microvesicules et des exosomes, ce qui diminue l’enrichissement, alors que le temps excessif détériore la focalisation spatiale et disperse donc les microvesicules et les exosomes. Ainsi, grâce à l’étape d’optimisation du temps, le facteur maximum de préconcentration des microvesicules et des exosomes et l...

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Discussion

Bien que l’Exo-PAD ait été utilisé avec succès pour l’enrichissement et l’isolement des microvesicules et des exosomes, plusieurs points critiques doivent être soigneusement examinés : 1) le temps et la température d’incubation du four pendant la préparation de l’appareil, 2) le temps de traitement, 3) l’application de la tension avec des nombres de couches variables et les diamètres de la surface d’échantillonnage, et 4) l’applicabilité aux échantillons cliniques.

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ag/AgCl electrodes	A-M Systems, Inc.	531500	0.15" diameter
Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate	Thermo Fisher Scientific	A13101	BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Carbonate-Bicarbonate Buffer	Sigma-Aldrich	C3041-50CAP	Carbonate buffer
CorelDraw software (Coral Co., Canada)	Corel Corporation		Printer software to define wax printing region
ColorQube 8870	Xerox Corporation		Wax printer
Chromatography paper grade 1	Whatman	3001-861	Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm
Fluorescent-labeled exosome standards	HansaBioMed Life Sciences, Ltd.	HBM-F-PEP-100	Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 current/voltage source-meter	Keithley Instruments, Inc.		Current–voltage source measurement system
Nafion perfluorinated resin solution	Sigma-Aldrich	31175-20-9	Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water
NanoSight LM10	NanoSight Technology		Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine
Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4)	Thermo Fisher Scientific	10010001