التصوير داخل النواة أكتين رودز في الحرارة الحية وشدد الأجنة Drosophila

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو حقن رودامين مترافقة في شكل اجناة دوزوفيليا وصورة إيننويا actin قضبان الجمعية بعد الإجهاد الحراري.

Abstract

الغرض من هذا البروتوكول هو تصور قضبان actin داخل النواة التي تجمع في الأجنة الزهرية الميلانوغاستر الحية بعد الإجهاد الحراري. قضبان Actin هي السمة المميزة لاستجابة الإجهاد Actin المحفوظة وغير القابلة للانكولوجيا (ASR) التي ترافق الأمراض البشرية ، بما في ذلك الأمراض العصبية. في السابق، أظهرنا أن ASR يساهم في فشل التشكلات المُرفَضة وتقليل قدرة الأجنة النامية على البقاء. يسمح هذا البروتوكول بالدراسة المستمرة للآليات الكامنة في تجميع القضيب ACTIN و ASR في نظام نموذجي قابل للغاية للتصوير وعلم الوراثة والكيمياء الحيوية. يتم جمع الأجنة وتركيبها على غطاء لإعدادها للحقن. يتم تخفيف رودامين مترافقة غلوبال أكتين (G-actin^{الأحمر)}وتحميلها في microneedle. يتم إجراء حقنة واحدة في مركز كل جنين. بعد الحقن ، يتم احتضان الأجنة في درجة حرارة مرتفعة ويتم تصور قضبان actin داخل النواة عن طريق المجهر confocal. ويمكن إجراء عملية استعادة الفلوريسنس بعد تجارب التحسس الضوئي (FRAP) على قضبان أكتين؛ ويمكن أيضا أن تكون صورت غيرها من الهياكل أكتين الغنية في السيتوبلازم. نجد أن G-actin^Redizes مثل G-actin الذاتية ولا تتداخل، من تلقاء نفسها، مع تطور الجنين الطبيعي. أحد القيود المفروضة على هذا البروتوكول هو أنه يجب توخي الحذر أثناء الحقن لتجنب الإصابة الخطيرة بالجنين. ومع ذلك، مع الممارسة، حقن G-actin^الأحمر في الأجنة Drosophila هو وسيلة سريعة وموثوق بها لتصور قضبان actin ويمكن بسهولة أن تستخدم مع الذباب من أي نوع جيني أو مع إدخال ضغوط الخلوية الأخرى، بما في ذلك نقص الأكسجة والأكسدة.

Introduction

يصف هذا البروتوكول كيفية حقن G-actin^Red لتصور تجميع قضبان actin داخل النواة في الأجنة التي تعاني من الإجهاد الحراري التي تخضع لاستجابة الإجهاد Actin غير القابلة للتحميل (ASR)¹. وضعنا هذا البروتوكول لمساعدة الدراسات من ASR، والتي في الأجنة يؤدي إلى انقطاع morphogenesis وانخفاض الجدوى، وفي أنواع الخلايا البشرية الكبار يرتبط مع الأمراض بما في ذلك الفشل الكلوي², اعتلالات العضلات³, ومرض الزهايمر وهنتنغتون^4,5,6,7,8. هذا ASR هو الناجم عن العديد من الضغوط الخلوية، بما في ذلك الصدمة الحرارية^9،10،11، الإجهاد التأكسي^4،6، انخفاض ATP التوليف¹²، وغير طبيعي Huntingtin أو β-amyloid oligomerization^4،5^{،6،7،9،13،14،16}. السمة المميزة لـ ASR هي تجميع قضبان actin الشاذة في إما السيتوبلازم أو نواة الخلايا المصابة ، والتي تحركها فرط النشاط الناجم عن الإجهاد من بروتين التفاعل actin ، Cofilin^1،5،6،10. ولسوء الحظ، لا تزال هناك فجوات معرفية رئيسية فيما يتعلق بـ ASR. على سبيل المثال، وظيفة قضبان actin غير معروف. نحن لا نفهم لماذا قضبان تشكل في السيتوبلازم لبعض أنواع الخلايا، ولكن نواة الآخرين. كما أنه ليس من الواضح ما إذا كان ASR وقائيًا أو غير مُبطِل للخلايا أو الأجنة التي تخضع للإجهاد. وأخيرا، ما زلنا لا نعرف الآليات التفصيلية الكامنة في Cofilin فرط التنشيط أو actin قضبان الجمعية. وهكذا، يوفر هذا البروتوكول فحص سريع ومتعدد الاستخدامات للتحقيق في ASR عن طريق تصور تشكيل قضيب actin وديناميكية في النظام التجريبي القابلة للتصرّف للغاية من جنين ذبابة الفاكهة الحية.

تم تطوير بروتوكول microinject G-actin^Red في أجنة دروسوفيليا الحية في البداية لدراسة ديناميات هياكل cytoplasmic الطبيعية¹⁷ خلال أحداث بناء الأنسجة. في تلك الدراسات، وجدنا أن^حقنة G-actin Red لم تؤثر سلبًا على عمليات النمو المبكرة في الجنين، بما في ذلك تحلل السيتوكينات أو^17،18. ثم قمنا بتعديل البروتوكول ، وتكييف معالجة الجنين وحقن G-actin^Red للسماح بتصوير قضبان actin في الأجنة المجهدة الحرارية التي تخضع لـ ASR¹. يمكن استخدام طرق أخرى إلى جانب حقن G-actin^Red لتصور actin في الأجنة. هذه الأساليب تعتمد على التعبير عن البروتينات الفلورية (FPs) الموسومة إلى actin أو إلى مجالات البروتينات الملزمة actin ، مثل Utrophin- mCherry ، Lifeact ، F-tractin -GFP ، وMoesin -GFP (استعرضت في¹⁹). ومع ذلك، فإن استخدام هذه المسابير FP يتطلب الحذر لأنها يمكن أن تستقر أو تعطل بعض الهياكل actin، لا تسمية على قدم المساواة جميع الهياكل actin²⁰، وفي حالة actin-GFP، هي مفرطة جدا - إشكالية لتحليل الجمعية قضيب الذي لا يقتصر على الإجهاد تعتمد ولكن أيضا actin التركيز تعتمد¹. وهكذا، G-actin^الأحمر هو المسبار المفضل لدراسات قضيب في الأجنة تطير، وحجم كبير من الجنين يسمح حقنه سهلة.

سير عمل هذا البروتوكول مشابه لتقنيات الحقن المجهرية الأخرى الراسخة التي استخدمت لحقن البروتينات والأحماض النووية والعقاقير والمؤشرات الفلورية في الأجنة الدروسوفيا ^{21،22،23،24،25،26،27}. ومع ذلك، بعد الحقن المجهري من G-actin^الأحمر هنا، والأجنة تتعرض لضغوط الحرارة خفيفة للحث على ASR وداخل النواة actin قضبان التجميع. بالنسبة للمختبرات التي والحصول على الذباب وتلاعب الحقن، ينبغي أن تكون هذه الطريقة قابلة للتنفيذ بسهولة وقابلة للتكيف مع خطوط محددة للدراسة فيما يتعلق بـ ASR، بما في ذلك تحريضها من خلال ضغوط مختلفة أو تعديل في خلفيات جينية متميزة.

Protocol

1. إعداد أكواب جمع الأجنة وألواح عصير التفاح أجار

1. قبل خمسة أيام من تجربة الحقن، قم ببناء²⁸ أو شراء كأسين صغيرين على الأقل لجمع الأجنة. جعل الطازجة 60 مم عصير التفاح أجار لوحات لاستخدامها مع أكواب جمع صغيرة²⁸. لوحات تخزين في صناديق بلاستيكية مغطاة بمناشف ورقية رطبة عند 4 °C.
   ملاحظة: سوف توفر أكواب جمع الأجنة الصغيرة، المُلَغَلة بأرقام الذبابة كما هو موضح في الخطوة 1.3، أعدادًا كافية من الأجنة لكل تجربة، مع ضمان إمكانية إجراء معالجة الجنين وحقنه في وقت قصير بما يكفي للسماح بتصوير مراحل النمو المبكرة.
2. سخّن أطباق عصير التفاح إلى 18 درجة مئوية وأضف داب من معجون الخميرة إلى وسط اللوحة. معجون الخميرة هو عجينة بسيطة من الخميرة النشطة والمياه المقطرة.
3. لتعزيز زرع البيض الأكثر سخاء، إعداد أكواب جمع مع الذباب 2 أيام قبل التجربة. إضافة ما لا يقل عن 100 الإناث و 50 ذباب الذكور إلى أكواب جمع، وأعلى مع طبق عصير التفاح المعدة (الشكل 1، الخطوة 1). في الأيام التي تسبق تجربة الحقن تغيير لوحات عصير التفاح على الأقل مرتين كل يوم، مرة واحدة في الصباح ومرة واحدة في المساء.
   ملاحظة: يتم الحصول على أفضل نتائج الحقن والتصوير عندما يتم الاحتفاظ بأكواب جمع الأجنة عند درجة حرارة 18 درجة مئوية مع ضوء 12 ساعة/ دورة ضوء.

2. إعداد حل الأسهم العاملة من G-actin^الأحمر للمجهر

ملاحظة: هذا الإعداد يجعل فقط 2 ميكرولتر من 5 ملغ / مل المخزون العامل من G-actin^الأحمر، لذلك إذا كان المستخدمون غير معتادين على تقنية الحقن المجهري ، فمن المفيد أن تتخطى إلى الخطوة 3 وممارسة الحقن المجهرية مع عازلة محايدة لدرجة اللون اله PH للحفاظ على المخزون العامل الثمين. يمكن تخزين مخزون 10 ميكروغرام من G-actin^Red من البائع في عبوته الأصلية في وعاء علوي 16 أوقية مع 500 غرام من الزهاء عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.

1. إعداد حل الأسهم G-العازلة مقدما: 5 M تريس-HCl, 0.2 mM CaCl_2,pH 8.0. تصفية وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
2. في يوم الحقن، وإعداد 1 مل من حل العمل G-العازلة في أنبوب جديد المفاجئة سقف microcentrifuge على الجليد باستخدام المخزون G-العازلة من الخطوة 2.1، تستكمل بما يلي في التركيزات النهائية المشار إليها: 1 mM dithiothreitol (DTT) و 0.2 mM ATP، درجة النقح الانبعاثات 8.0.
   ملاحظة: حجم 1 مل من حل العمل G-buffer هو أكثر من ما هو مطلوب لتجربة ولكن يبسط إعداد. يمكن التخلص من الفائض بعد التجربة أو يمكن للمستخدمين تقليصها وفقًا لتفضيلاتهم.
   1. حفظ 10 ميكروغرام G-actin^الأحمر المخزون على الجليد، أولا إضافة 1 ميكرولتر من تصفية، والمياه المقطرة إلى الجزء العلوي من قطرة الوردي من G-actin^الأحمر داخل الأنبوب.
   2. بعد ذلك، إضافة 1 μL من الباردة، أعدت حديثا G-العازلة حل العمل من الخطوة 2.2. Pipet صعودا وهبوطا ~ 20 مرة لخلط جيدا مع حجم ماصة تعيين إلى 1 ميكرولتر. الأسهم G-actin^الأحمر سيكون الآن في التخفيف النهائي من 5 ملغ / مل.
3. احتضان إعداد G-actin^الأحمر لمدة 30 دقيقة على الجليد دون عائق.
4. جهاز طرد مركزي إعداد G-actin^الأحمر في 16,000 x ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية في microcentrifuge لإزالة أي عجل.
5. بعناية pipet 1.5 μL من supernatant في أنبوب قبعة صغيرة صغيرة جديدة على الجليد ، وتجنب بيليه الوردي الداكن.
6. تخزين إعداد G-actin^الأحمر فوق على الجليد لمدة تصل إلى 6 ساعة حتى تصبح جاهزة لتحميل في microneedle.
   ملاحظة: يمكن سحب Microneedles من أنابيب الشعيرات الدموية مقدما على جرة ميكروبيبيت، ثم تخزينها في درجة حرارة الغرفة على شريط من الطين النمذجة في طبق بيتري 100 × 20 ملم. يمكن العثور على المعلمات المقترحة لسحب microneedle في كتاب الطبخ الماص²⁹.

3. جمع الأجنة وجبل للحقن

1. السماح للذباب لوضع الأجنة لمدة 30 دقيقة على أطباق عصير التفاح مع معجون الخميرة في 18 درجة مئوية.
2. في حين أن الذباب يتم وضع، قبل الدافئة لوحة عصير التفاح أجار دون معجون الخميرة إلى درجة حرارة الغرفة، وقطع 4 سم × 1 سم إسفين مستطيلة من عصير التفاح أجار مع شفرة حلاقة، ومكان على شريحة زجاجية 25 مم × 75 ملم.
   1. حصاد لوحة من جمع 30 دقيقة وأجنة مُصفّح عن طريق صب التبييض الطازج، المخفف 1:1 مع الماء المقطر، على لوحة ويحوم لوحة لمدة 1 دقيقة، كما هو موضح في²⁸ (الشكل 1، الخطوة 2).
      ملاحظة: تباع ماركات مختلفة من التبييض بتركيزات مختلفة. التبييض المستخدمة هنا هو 6٪ هيبوكلوريت الصوديوم من الزجاجة ويتم تخفيفها إلى تركيز نهائي من هيبوكلوريت الصوديوم 3٪. سوف العلامات التجارية التبييض الأخرى بتركيزات أقل قليلا تعمل بشكل جيد على قدم المساواة.
   2. صب التبييض والأجنة المصفحة في سلة جمع (مصفاة خلية 70 ميكرومتر) وشطف اللوحة مرتين بالماء المقطر من زجاجة بخ، مضيفا هذه يغسل إلى سلة جمع.
   3. شطف بقوة الأجنة المفحتة في سلة جمع مع الماء المقطر حتى لا كتل الخميرة مرئية والسلة لا يترك علامات وردية من التبييض الزائد عندما لطخت على منشفة ورقية.
3. باستخدام فرشاة الطلاء مع شعيرات مبللة بالماء المقطر، ونقل الأجنة المطهرة والمغسلة من سلة جمع على عصير التفاح إعداد أجار إسفين على الشريحة الزجاجية.
4. استخدام زوج من ملاقط تلميح غرامة أو إبرة تشريح لترتيب عشرة أجنة في خط مستقيم على طول المحور الطويل من إسفين أجار مستطيلة (الشكل 1, الخطوة 3). ترتيب الأجنة وجها إلى الذيل، بحيث القطب الأمامي يواجه إلى الجانب الأيمن والدوسل تواجه الباحث(الشكل 1، الخطوة 3 ، تضخيم).
5. قطع 0.5 سم من نهاية تلميح P200 ماصة مع شفرة حلاقة وتراجع في "الغراء الجنين" (وصفها في²⁸). معطف بسخاء منطقة 5 ملم في العرض(الشكل 1، الخطوة 4)على طول الحافة الطويلة من 24 مم × 50 مم مستطيلة الأغطية ، والسماح الجافة ، ولصق الجانب حتى. سوف يستغرق التجفيف ~ 30 ثانية، ويكتمل بمجرد أن تظهر المنطقة المغلفة بالغراء كامل غير لامع بدلاً من الرطب أو لامعة.
   ملاحظة: إعداد "الغراء الجنين" على الأقل 48 ساعة مقدما. أضف ن-هيبتان إلى شرائط من الشريط على الوجهين في قارورة متألقة كما هو موضح في²⁸.
6. بمجرد أن جفف "الغراء الجنين" ، ضع بلطف جانب الغراء الأغطية لأسفل على قمة صف الأجنة المنحازة على agar ، مما يترك 2-3 مم من المساحة بين حافة الغطاء وصف الأجنة.
   ملاحظة: قد يؤدي لصق الأجنة القريبة جدًا من حافة الغطاء إلى جفاف الأجنة أكثر من اللازم أثناء التجربة.
7. قم بقلب الغطاء حتى تواجه الأجنة الآن. وينبغي أن تكون عالقة في خط على طول حافة واحدة طويلة من الغطاء، ومنطقة البطن التي تواجهها أقرب حافة الغطاء (الشكل 1، الخطوة 4 ، مكبرة).
8. قم بتخريب الأجنة عن طريق وضع الغطاء مع الأجنة بلطف فوق 150 غرام من المجففات الزرقاء الطازجة المخزنة في جرة 16 أوقية برغي أعلى. المسمار بإحكام على غطاء واحتضان لمدة 8-10 دقيقة(الشكل 1، الخطوة 5).
9. بعد جفاف، وإزالة الأغطية من جرة مجفف والشريط كل جانب قصير من الأغطية إلى شريحة المجهر، جانب الجنين حتى،مع اثنين من 4 سم² قطعة من الشريط على الوجهين بحيث يغطي الجنين سوف تناسب على مرحلة الحقن (الشكل 1، الخطوة 6).
10. أضف 2-3 قطرات من زيت الهالكربون 27 مع ماصة باستير لتغطية الأجنة المنحازة وحمايتها من المزيد من الجفاف (الشكل 1، الخطوة 6).

4. حقن والحرارة الأجنة الإجهاد لتعزيز تشكيل قضيب actin

ملاحظة: يتم إجراء جميع الحقن في غرفة يتم التحكم فيها بدرجة حرارة عند 18 درجة مئوية.

1. إعداد غرف الحضانة الرطبة من طبق بيتري الزجاج لا يقل عن 100 مم × 20 ملم في الحجم وخط الغرفة مع التقلبات من ماسحات الأنسجة المختبرية مبللة بالماء المقطر (الشكل 1, الخطوة 8). تدفئة ما قبل غرف الحضانة عند 32 درجة مئوية أو درجة حرارة الحضانة المطلوبة قبل حقن الأجنة.
2. فتح صمام تدفق الهواء للمخنّغ الصغير وتشغيل على الميكروين (الهواء المضغوط أو الهواء المنزل مع ضغط لا يقل عن 90 psi هو مناسبة).
3. في حين أن الأجنة هي المجففة، backload السابق إعداد G-actin^الأحمر سوبرنات في microneedle باستخدام طرف محمل الصغرى. تعيين ماصة لرسم 1-1.5 μL.
   ملاحظة: بسبب اللزوجة actin قد لا تكون دقيقة تحميل وحدات التخزين وقد يكون هناك actin كافية اليسار لتحميل ما لا يقل عن واحد إلى اثنين من microneedles أكثر. يمكن حقن ما يصل إلى 60 جنينًا لكل ميكرونيدل تم تحميله إذا تم معايرة الميكرونسيدل بشكل صحيح ولم يتم انسداده أثناء التجربة.
4. إرفاق microneedle إلى حامل إبرة وتشديد المسمار. توصيل أنبوب الهواء إلى الميكروين والتأكد من أن ضغط التدفق الخلفي على موازين microneedle إلى 30 ه ب.
5. معايرة إعدادات الميكروين لطرد 100 μm قطر فقاعة من G-actin^الأحمر (~ 500 pL) على ميكرومتر الشريحة. تدوير مقبض الضغط (500-1500 ه بي سي) وحقن نبض مقبض الوقت (0.1-0.5 s) على الحقن المجهري للحصول على حجم فقاعة الحق. ضبط هذه الإعدادات في كل مرة يتم تحميل microneedle جديدة لحساب التباين في اللزوجة actin وصغر الحجم تلميح.
   ملاحظة: إعداد G-actin^الأحمر هو لزجة، وقد يكون هناك الهواء في غيض من microneedle التي ينبغي طرد قبل حقن الأجنة. إذا كان G-actin^الأحمر لا يطرد بسهولة من غيض من microneedle، كسر بلطف تلميح microneedle ضد حافة ميكرومتر الشريحة.
6. ضع الشريحة مع الأجنة المثبتة على مرحلة المجهر.
   ملاحظة: كل حقن إعداد سيكون مختلفا، لذلك سوف يكون الباحثون لضبط طريقة الحقن وفقا لذلك. هنا يتم نقل الأجنة فيما يتعلق ميكرونيدل ثابتة، وحقن كل جنين عن طريق تشغيل الجنين في microneedle.
7. ضبط مرحلة micromanipulator والتركيز من الهدف 10x على المجهر الخفيف بحيث تكون الأجنة مرئية. الأجنة هي في الطائرة المحورية الصحيحة عندما الخطوط العريضة للغشاء ال vitelline هي الأكثر حدة والجنين يظهر أكبر. اختيار الأجنة لحقن التي هي في مرحلة النمو الصحيح، بحيث بحلول الوقت الذي يتم الانتهاء من الحضانة بعد الحقن، ومعظم مخلب تصل إلى مرحلة النمو المطلوب (على سبيل المثال، حقن الأجنة في مرحلة بوونيس 2-3³⁰ من أجل مراقبة قضبان في الخلية بعد الإجهاد الحراري في 32 درجة مئوية).
8. استخدم أدوات التحكم الدقيقة لإدخال الإبرة إلى نفس المستوى البؤري الذي تستخدمه الأجنة.
   ملاحظة: إذا كان المصيد microneedle على غطاء بينما تتحرك المرحلة أو microneedle، ثم microneedle هو قريب جدا من الشريحة وليس في الطائرة البؤرية الصحيحة. يجب أن يكون microneedle موازية للأغطية ، وليس في زاوية كبيرة (الشكل 1، الخطوة 7).
9. أدخل المايكرونيدل في الجنين بحيث يضرب الجنين في وسط منطقة البطن، عند "خط الاستواء" للجنين. حقن الزناد مع دواسة القدم أو "حقن" زر عندما تلميح microneedle مرئيا داخل منتصف الجنين (الشكل 1، الخطوة 7).
10. حقن G-actin^الأحمر مرة واحدة وإزالة ببطء microneedle. حرك المرحلة وكرر لكل جنين من المرحلة التنموية المناسبة.
    ملاحظة: توسيع الجنين أمر طبيعي كما يتم حقن G-actin^الأحمر وقليلا من السيتوبلازم قد تسرب من الجنين.
11. بعد حقن جميع الأجنة، ضع الشريحة مع الأجنة في غرفة الحضانة الرطبة المعدة، واغلق الغطاء (الشكل 1، الخطوة 8). إذا كان يحاول الحصول على الأجنة التي تصل إلى الخلية، والحرارة الإجهاد الأجنة في 32 درجة مئوية لمدة 60-75 دقيقة في غرفة الحضانة الرطبة.
    ملاحظة: لوحظ أن أوقات الحضانة تسمح بالتصور للقضبان في الأجنة المعالجة بالحرارة. وسوف يكون وقت الحضانة أطول للأجنة غير الإجهاد الحرارة السيطرة لأن التنمية ستكون أبطأ في درجة حرارة أقل³¹. ويمكن احتضان هذه الأجنة التحكم في غرف رطبة في درجات حرارة مثل 18 درجة مئوية أو 25 درجة مئوية، اعتمادا على تصميم تجربة محددة والسؤال الذي يتعين طرحه. الحد الأدنى من وقت الحضانة اللازم^لـ G-actin Red لنشره في جميع أنحاء الجنين هو 30 دقيقة.

5. صورة actin قضبان في الأجنة وشدد الحرارة عن طريق المجهر confocal

1. في حين يجري الأجنة وشدد الحرارة، تشغيل المجهر confocal واختيار قناة الليزر 561 نانومتر.
2. نقل عدسة الهدف (25x، 40x أو 63x الموصى بها) إلى موقف العمل.
3. إذا كان التصوير حرارة وشدد الأجنة، ثم تعيين حاضنة مرحلة ساخنة لتحقيق درجة حرارة داخلية من 32 درجة مئوية. يمكن استخدام مقياس حرارة نقطة واطلاق النار أو الأشعة تحت الحمراء للتحقق من درجة الحرارة في أو بالقرب من الهدف.
4. إزالة الشريحة مع الأجنة المحقونة من غرفة الحضانة الرطبة بعد اكتمال الحضانة (الشكل 1، الخطوة 9).
5. تعمل بسرعة، برفق ابعاد قطع الشريط على الوجهين التي كانت تستخدم في التمسك الأغطية مع الأجنة شنت على الشريحة (الشكل 1، الخطوة 9).
   تنبيه: كن لطيفًا أثناء هذه الخطوات حيث يمكن أن تتحطم الأغطية بسهولة إذا تم تطبيق الكثير من القوة.
6. عصا اثنين 2.5 سم طويلة قطعة من الشريط على الوجهين معا وقطع الشريط في نصف بالطول لجعل اثنين من شرائط، 2.5 × 0.5 سم طويلة (الشكل 1، الخطوة 10).
7. عصا ثلثي طول كل شريط الشريط على الغطاء الأول، يحيط كل جانب من الأجنة في زيت الهالوكربون 27 (الشكل 1, الخطوة 10, البرتقالي), ترك ثلث الشريط شرائط تتدلى قبالة حافة الغطاء الأول حيث عالقون الأجنة. استخدمي اليدين القفازتين، وتوخي الحذر من لمس الأجنة خلال هذه الخطوة.
8. ضع بلطف غطاء مستطيل ثان على رأس أشرطة الشريط لشطائر الأجنة بين الأغطية (الشكل 1، الخطوة 10 ، الأزرق). محاذاة حواف 25 ملم ولكن الحفاظ على حواف 50 مم إزاحة من بعضها البعض بمقدار 1 سم في العرض.
   ملاحظة: هذا الغطاء الثاني 'ق السطح الكامل سوف تصبح سطح التصوير الجديد الذي سوف يواجه عدسة الهدف، لذلك الحرص على عدم الحصول على بصمات الأصابع أو زيت الهالكربون 27 على هذا السطح يغطي الثاني. الإزاحة ضروريّة أنّ أنّ إضافيّة هالوكاربون 27 زيت يستطيع كنت أضفت أن يزجّت أجنة بتعادل. إذا لزم الأمر، إضافة زيت الهالكربون 27 في التماس حيث يغطي اثنين يجتمع في الجزء العلوي من شطيرة وسوف معطف الأجنة عن طريق عمل الشعرية (انظر خطوط متقطعة في الشكل 1، الخطوة 10).
9. اضغط بلطف على المناطق من الأغطية التي هي مباشرة على رأس الشريط الشريط مع الجانب الحاد من razorblade للحصول على غطاء للتمسك الشريط.
10. اقلب ساندويتش الأغطية وضعه على ممسحة نسيج معملية للحفاظ على سطح التصوير نظيفًا وتحمله إلى المجهر confocal (الشكل 1، الخطوة 11). تأكد من أن الشريط عالق تمامًا في كل من الأغطية قبل التصوير.
11. تأكد من أن المرحلة الساخنة في درجة الحرارة وإذا كان استخدام المجهر المقلوب، إضافة السائل الغمر على عدسة الهدف المحدد.
12. ضع ساندويتش الأغطية على المسرح بعناية لضمان أن سطح التصوير الجديد^{(2 nd} coverslip) هو واحد لمس السائل الغمر(الشكل 1، الخطوة 11).
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، قم بلصق شطيرة الأغطية على المسرح بقطعتين صغيرتين من الشريط المزدوج الجانب لمنع الحركة غير الضرورية أثناء التصوير إذا لم تكن الأغطية مناسبة بشكل جيد في المرحلة الساخنة.
13. التركيز على الجنين الذي هو في الخلية (Bownes المرحلة 4a³⁰) أو مرحلة النمو المطلوب باستخدام إما الضوء المنقولة أو الفلوريس.
14. بمجرد أن يتم التركيز على الجنين، انتقل إلى وضع اقتناء الليزر على المجهر confocal وضبط قوة الليزر والمكاسب، وحجم الإطار، والتبليط، وإعدادات الإسقاط حسب الرغبة.
15. خذ صورًا للعرض السطحي عبر الأسطح المحورية لنويات الجنين للعثور على قضبان أكتين داخل النواة. يجب أن تظهر قضبان في اتجاهات متعددة كما الشرائط أو النقاط الساطعة داخل نواة مظلمة نسبيا (الشكل 2A, 2C).

6- تجارب التصوير البديلة

1. أداء FRAP للتحقيق في دوران actin على طول قضبان actin داخل النواة أو في هياكل أكتين السيتوبلازمي, مثل نصائح من الشقوق غشاء البلازما أثناء خلوية.
2. في برنامج التصوير، اختر منطقة مستطيلة حول نصائح جفن أو قضبان actin التي للحصول على التجربة.
3. اختيار منطقة صغيرة مربعة من مركز قضيب actin داخل منطقة اقتناء مستطيلة لتبييض. تأكد من أن نصائح قضيب actin مرئية ولا يتم تبييضها أثناء التجربة للسماح بالتتبع الدقيق للقضيب داخل النواة.
4. تعيين ليزر التبييض لتكفير 50x وتعيين قوة الليزر التبييض إلى أقصى حد.
5. اختر دورة زمنية للحصول على الصور كل ثانية بإجمالي يصل إلى 120 ثانية بأقصى سرعة بكسل وتعيين الليزر على التبييض بعد أول ثانيتين من الحصول على الصور.
6. كمّيّة البيانات لتحديد نصف الوقت من ال [فلويسنسّنسّا ريستنس^1].

النتائج

يتم تصوير سير عمل تخطيطي للتعامل مع الأجنة في الشكل 1، ويتم عرض جدول زمني لتجربة نموذجية في الجدول 1. تقدير لنتيجة تجريبية جيدة هو أنه لكل 10 أجنة حقن، ما لا يقل عن نصف الأجنة ينظر إليها سيكون في مرحلة النمو الصحيح، غير التالفة، وتظهر ASR قوية مع الإجهاد الحراري في 32 در...

Discussion

أهمية هذه الطريقة هي أنها تستخدم بروتوكول راسخ من الحقن المجهري في الأجنة دروسوفيليا ^{21,22,23,24,25,26,27} لتمكين البحوث الجديدة بشأن ASR و المرافقة actin قضبان التجميع....

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine triphosphate (ATP)	Millipore-Sigma	A23835G	Component of G buffer
Apple juice, Mott's, 64 fl oz	Mott's	014800000344	Component of apple juice plates
Bacto Agar	BD	214010	Component of apple juice plates
Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite	KIK International	059647210020	For dechorionating embryos
Calcium chloride	Millipore-Sigma	C1016500G	Component of G buffer
Cell strainer, 70 μm	Falcon	352350	For collecting dechorionated embryos
Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan	Zeiss	0000001994956	For imaging intranuclear actin rods
Desiccant	Drierite	24001	For desiccating embryos
Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom	Zeiss	4350649000000	For arranging embryos on agar wedge
Dissecting needle, 5 in	Fisher Scientific	08965A	For arranging embryos on agar wedge
Dithiothreitol (DTT)	Fisher Scientific	BP1725	Component of G buffer
Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in	3M	021200010323	For making embryo glue
Embryo collection cage	Genessee Scientific	59100	For housing adult flies and collecting embryos
Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5	Electron Microscopy Sciences	72701D	For arranging embryos on agar wedge
Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm	World Precision Instruments, Inc.	TW1004	For microneedles
Halocarbon oil 27	Millipore-Sigma	H8773100ML	For hydration of embryos
Heated stage incubator	Zeiss	4118579020000, 4118609020000, 4118609010000	For confocal imaging
Lab Tissue Wipers, KimWipes	Kimberly-Clark	34155	Lab tissue wipers
Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished	Zeiss	Discontinued	Injection microscope
Methyl-4-hydroxybenzoate	Millipore-Sigma	H36471KG	Component of apple juice plates
Microinjector, FemtoJet4x	Eppendorf	5253000025	Microinjector
Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL	Eppendorf	5242956003	For loading microneedles
Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment	Bernard Instruments, Inc (Houston, TX)	Custom	For performing microinjections
Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown	Sutter Instruments	P97	For pulling capillary tubes to make microneedles
Microscope cover glass 24x50-1.5	Fisher Scientific	12544E	For mounting embryos
Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm	Fisher Scientific	22037081	For mounting embryos for injection
n-Heptane	Fisher Scientific	H3601	Component of embryo glue
Objective, 10x	Zeiss	Discontinued	10x objective for injection microscope
Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS	Zeiss	4217679971711	40x water objective for confocal
Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm)	Zeiss	4208529871000	25x mixed immersion objective for confocal
Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA	Zeiss	4207829900799	63x oil objective for confocal
Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2	Daler-Rowney	038372016954	For transferring embryos
Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white	Kimberly-Clark	884266344845	For blotting cell strainer
Pasteur pipette, 5 3/4 in	Fisher Scientific	1367820A	For covering embryos with oil
Petri dish, glass, 100 x 20 mm	Corning	3160102	For humid incubation chamber
Petri dish, plastic, 60 x 15 mm	VWR	25384092	For apple juice plates
Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL	Eppendorf	2231000604	For loading the microneedle
Pipette tip, xTIP4 250 μL	Biotix	63300006	For adding embryo glue to coverslip
Razor blade	VWR	55411050	For cutting agar wedge, tape, pipette tips
Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 μg)	Cytoskeleton, Inc.	APHR-A	G-actin^Red
Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps	Fisher Scientific	033377	For making embryo glue
Screw top jar, 16 oz	Nalgene	000194414195	For desiccating embryos
Stage micrometer	Electron Microscopy Sciences	602104PG	For calibrating volume of G-actin injection
Sucrose	Millipore-Sigma	840971KG	Component of apple juice plates
Trizma base	Millipore-Sigma	T15031KG	Component of G buffer
Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz	Lesaffre Yeast Corporation	117929157002	Component of yeast paste