Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Riepilogo

L'obiettivo di questo protocollo è quello di iniettare l'actina globulare coniugata con rhodamina negli embrioni di Drosophila e nell'assemblaggio dell'asta di actina intranucleare dell'immagine a seguito dello stress da calore.

Abstract

Lo scopo di questo protocollo è quello di visualizzare le barre di actina intranucleare che si assemblano in embrioni di melanogaster Drosophila vivi a seguito dello stress termico. Le canne Actin sono un segno distintivo di una risposta allo stress actina conservata e induttibile (ASR) che accompagna patologie umane, tra cui la malattia neurodegenerativa. In precedenza, abbiamo dimostrato che l'ASR contribuisce ai fallimenti della morfogenesi e alla ridotta vitalità degli embrioni in via di sviluppo. Questo protocollo consente di continuare lo studio dei meccanismi alla base dell'assemblaggio dell'asta di actina e dell'ASR in un sistema modello altamente suscettibile di imaging, genetica e biochimica. Gli embrioni vengono raccolti e montati su una coverlip per prepararli all'iniezione. L'actina globulare coniugata con rodamina (G-actina^Rossa)viene diluita e caricata in un microneedle. Una singola iniezione viene effettuata al centro di ogni embrione. Dopo l'iniezione, gli embrioni vengono incubati a temperatura elevata e le barre di actina intranucleare vengono quindi visualizzate mediante microscopia confocale. Il recupero della fluorescenza dopo esperimenti di fotobleaching (FRAP) può essere eseguito sulle barre di actina; e altre strutture ricche di actina nel citoplasma possono anche essere immagini. Scopriamo che G-actin^Red polimerizza come l'endogeno G-actina e non interferisce, da solo, con il normale sviluppo embrionale. Una limitazione di questo protocollo è che occorre fare attenzione durante l'iniezione per evitare gravi lesioni all'embrione. Tuttavia, con la pratica, iniettare G-actina^Rossa negli embrioni di Drosophila è un modo rapido e affidabile per visualizzare le aste di actina e può essere facilmente utilizzato con mosche di qualsiasi genotipo o con l'introduzione di altri stress cellulari, tra cui ipossia e stress ossidativo.

Introduzione

Questo protocollo descrive come iniettare G-actin^{Red per} visualizzare l'assemblaggio di barre di actina intranucleare in embrioni stressati dal calore che stanno subendo un'induttibile risposta allo stress actina (ASR)¹. Abbiamo sviluppato questo protocollo per aiutare gli studi dell'ASR, che negli embrioni porta a morfogenesi interrotta e ridotta vitalità, e nei tipi di cellule umane adulte è associato a patologie tra cui insufficienza renale^2,miopatie^{muscolari 3}e morbo di Alzheimer e Huntington^4,5,6,7,8. Questa ASR è indotta da numerose sollecitazioni cellulari, tra cui shock^{termico 9,10,11,}stress ossidativo^4,6,ridotta sintesi ATP¹²e huntingtina anomala o oligomerizzazione β-amiloide^{4,5,6,7,9,13,14,15,16}. Un segno distintivo dell'ASR è l'assemblaggio di aste di actina aberrante nel citoplasma o nel nucleo delle cellule colpite, che è guidato dall'iperattivazione indotta dallo stress di una proteina che interagisce con l'actina, Cofilin^1,5,6,10. Sfortunatamente, permangono lacune chiave in materia di conoscenze per quanto riguarda l'ASR. Ad esempio, la funzione delle aste actin non è nota. Non capiamo perché le aste si formano nel citoplasma di alcuni tipi di cellule, ma il nucleo di altri. Né è chiaro se l'ASR sia protettivo o disadattiva per cellule o embrioni sottoposti a stress. Infine, non conosciamo ancora i meccanismi dettagliati alla base dell'iperattività cofilin o dell'assemblaggio dell'asta actina. Pertanto, questo protocollo fornisce un saggio rapido e versatile per sondare l'ASR visualizzando la formazione e la dinamica dell'asta di actina nel sistema sperimentale altamente trattabile dell'embrione di mosca della frutta vivente.

Il protocollo per microiniettare G-actin^Red in embrioni viventi di Drosophila è stato inizialmente sviluppato per studiare la dinamica delle normali strutture dell'actina citoplasmatica^{17 durante} gli eventi di costruzione dei tessuti. In questi studi, abbiamo scoperto che l'iniezione di G-actina^Red non ha influito negativamente sui primi processi di sviluppo nell'embrione, tra cui citocinesi o gastrulazione^17,18. Abbiamo quindi modificato il protocollo, adattando la manipolazione dell'embrione e l'iniezione G-actin^Red per consentire l'imaging di aste di actina in embrioni stressati dal calore sottoposti all'ASR¹. Altri metodi oltre all'iniezione di G-actin^Red possono essere utilizzati per visualizzare l'actina negli embrioni. Questi metodi si basano sull'esprimere proteine fluorescenti (FP) taggate ad actina o a domini di proteine che legano l'actina, come Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP e Moesin-GFP (recensito in¹⁹). Tuttavia, l'uso di queste sonde FP richiede cautela perché possono stabilizzare o interrompere alcune strutture actina, non etichettano allo stesso modo tutte le strutture actin²⁰e, nel caso dell'actina-GFP, sono altamente sovraespresse – problematiche per l'analisi dell'assemblaggio dell'asta che non dipende solo dallo stress, ma agisce anche nella concentrazione^{dipendente 1}. Pertanto, G-actin^{Red è} la sonda preferita per gli studi sulle aste negli embrioni di mosca e le grandi dimensioni dell'embrione ne consentono la facile iniezione.

Il flusso di lavoro di questo protocollo è simile ad altre consolidate tecniche di microiniezione che sono state utilizzate per iniettare proteine, acidi nucleici, farmaci e indicatori fluorescenti negli embrioni di Drosophila ^{21,22,23,24,25,26,27}. Tuttavia, in seguito alla microiniezione di G-actin^Red qui, gli embrioni sono esposti a un leggero stress termico per indurre l'ASR e l'assemblaggio intranucleare dell'asta di actina. Per i laboratori con accesso alle mosche e un impianto di iniezione, questo metodo dovrebbe essere facilmente implementabile e adattabile per specifiche linee di studio per quanto riguarda l'ASR, compresa la sua induzione da diversi stress o modulazione in contesti genetici distinti.

Protocollo

1. Preparare tazze per la raccolta degli embrioni e piatti di agar di succo di mela

1. Cinque giorni prima dell'esperimento di iniezione, costruisci^{28 o} procura almeno due piccole tazze per la raccolta degli embrioni. Preparare piatti freschi di succo di mela da 60 mm da utilizzare con piccole tazze di raccolta²⁸. Conservare i piatti in scatole di plastica ricoperte da tovaglioli di carta umidi a 4 °C.
   NOTA: Piccole tazze per la raccolta degli embrioni, popolate con numeri di mosca come descritto al passaggio 1.3, forniranno numeri di embrioni sufficienti per esperimento, garantendo al contempo che la manipolazione e l'iniezione degli embrioni possano essere fatte in un tempo abbastanza breve da consentire l'imaging delle prime fasi di sviluppo.
2. Scaldare i piatti di succo di mela a 18 °C e aggiungere un tampone di pasta di lievito al centro del piatto. La pasta di lievito è una semplice pasta di lievito attivo e acqua distillata.
3. Per promuovere la deposizione delle uova più generosa, impostare tazze di raccolta con mosche 2 giorni prima dell'esperimento. Aggiungere almeno 100 femmine e 50 mosche maschili alle tazze di raccolta e in alto con un piatto di succo di mela preparato(Figura 1,passo 1). Nei giorni che portano all'esperimento di iniezione cambiare i piatti di succo di mela almeno due volte al giorno, una volta al mattino e una volta alla sera.
   NOTA: I migliori risultati di iniezione e imaging si ottengono quando le tazze per la raccolta degli embrioni sono mantenute a 18 °C con un ciclo di spegnimento / luce di luce di 12 ore.

2. Preparare una soluzione di stock di lavoro di G-actin^{Red per} la microiniezione

NOTA: Questa preparazione produce solo 2 μL di uno stock di lavoro di 5 mg/mL di G-actin^Red, quindi se gli utenti non sono abituati alla tecnica di microiniezione, è vantaggioso saltare al passaggio 3 e praticare le microiniezioni con un tampone di pH neutro per conservare il prezioso stock di lavoro. Lo stock da 10 μg di G-actin^Red del venditore può essere conservato nella sua confezione originale in un barattolo superiore a vite da 16 once con ~ 500 g di essiccante a 4 ° C per un massimo di 6 mesi.

1. Preparare in anticipo una soluzione di stock tampone G: Tris-HCl da 5 mM, CaCl₂da 0,2 mM, pH 8,0. Filtrare e conservare a temperatura ambiente.
2. Il giorno delle iniezioni, preparare 1 ml di una soluzione di lavoro G-buffer in un tubo di microcentrifugo a tappo a scatto fresco sul ghiaccio utilizzando la scorta tampone G del passo 2.1, integrata con le seguenti concentrazioni finali indicate: 1 mM ditiothreitol (DTT) e 0,2 mM ATP, pH 8.0.
   NOTA: Il volume di 1 mL della soluzione di lavoro G-buffer è superiore a quello necessario per un esperimento, ma semplifica la preparazione. L'eccesso può essere scartato dopo l'esperimento o gli utenti possono ridimensionarsi in base alle loro preferenze.
   1. Mantenendo lo^stock rosso G-actin da 10 μg sul ghiaccio, aggiungere prima 1 μL di acqua filtrata e distillata sulla parte superiore della goccia rosa di G-actin^{Rosso all'interno} del tubo.
   2. Aggiungere quindi 1 μL della soluzione di lavoro G-buffer fredda e preparata al momento dal passaggio 2.2. Pipettare su e giù ~20 volte per mescolare bene con il volume della pipetta impostato su 1 μL. Lo stock G-actin^Red sarà ora alla diluizione finale di 5 mg/mL.
3. Incubare il G-actin Rosso preparato^{per 30} minuti sul ghiaccio indisturbato.
4. Centrifugare il G-actin^{Rosso preparato} a 16.000 x g per 20 min a 4 °C in un microcentrifugo per rimuovere qualsiasi precipitato.
5. Pipettare con cura 1,5 μL del supernatante in un tubo di microcentrifugo fresco snap cap sul ghiaccio, evitando il pellet rosa scuro.
6. Conservare il supernatante G-actin^Red preparato sul ghiaccio per un massimo di 6 ore fino a quando non è pronto per il caricamento in un microneedle.
   NOTA: Le microneedle possono essere estratte in anticipo da tubi capillari su un estrattore di micropipette, quindi conservate a temperatura ambiente su una striscia di argilla modellante in una piastra di Petri da 100 x 20 mm. I parametri suggeriti per l'estrazione del microneedle sono disponibili nel Pipette Cookbook²⁹.

3. Raccogliere embrioni e montare per iniezione

1. Lasciare che le mosche depongono embrioni per 30 minuti su piatti di succo di mela con pasta di lievito a 18 °C.
2. Mentre le mosche sono sdraiate, pre-riscaldare una piastra di agar succo di mela senza pasta di lievito a temperatura ambiente, tagliare un cuneo rettangolare di 4 cm x 1 cm di succo di mela agar con una lama di rasoio e posizionare su uno scivolo di vetro da 25 mm x 75 mm.
   1. Raccogli la piastra dalla raccolta di 30 minuti e gli embrioni di decoorionato versando candeggina fresca, diluita 1:1 con acqua distillata, sul piatto e ruotando il piatto per 1 minuto, come descritto al^{punto 28} (Figura 1,fase 2).
      NOTA: Diverse marche di candeggina sono vendute a diverse concentrazioni. La candeggina qui utilizzata è il 6% di ipoclorito di sodio dalla bottiglia e viene diluita a una concentrazione finale del 3% di ipoclorito di sodio. Altre marche di candeggina a concentrazioni leggermente inferiori funzioneranno altrettanto bene.
   2. Versare la candeggina e gli embrioni dechorionati in un cestello di raccolta (un colino cellulare da 70 μm) e sciacquare il piatto due volte con acqua distillata da una bottiglia di schizzi, aggiungendo questi lavaggi al cesto di raccolta.
   3. Risciacquare vigorosamente gli embrioni dechorionated nel cesto di raccolta con acqua distillata fino a quando non sono visibili grumi di lievito e il cestello non lascia segni rosa dalla candeggina in eccesso quando macchiato su un tovagliolo di carta.
3. Utilizzando un pennello con setole inumidite con acqua distillata, trasferire embrioni dechorionati e lavati dal cesto di raccolta sul cuneo di agar del succo di mela preparato sullo scivolo di vetro.
4. Utilizzare un paio di pinzette a punta fine o un ago di sezionazione per disporre dieci embrioni in linea retta lungo il lungo asse del cuneo agar rettangolare (Figura 1, fase 3). Disporre gli embrioni testa a coda, in modo che il loro polo anteriore sia rivolto verso il lato destro e dorsale sia rivolto verso il ricercatore(Figura 1,fase 3, ingrandito).
5. Tagliare 0,5 cm dell'estremità di una punta della pipetta P200 con una lama di rasoio e immergersi nella "colla embrionale" (descritta in²⁸). Rivestire generosamente una regione di 5 mm di larghezza (Figura 1, passo 4) lungo il bordo lungo di un copricapo rettangolare da 24 mm x 50 mm e lasciare asciugare, incollare il lato verso l'alto. L'asciugatura richiederà ~ 30 s ed è completa una volta che l'intera regione rivestita di colla appare opaca piuttosto che bagnata o lucida.
   NOTA: Preparare "colla embrionale" con almeno 48 ore di anticipo. Aggiungere n-eptano a strisce di nastro a doppia mano in una fiala a scintillazione come descritto nel²⁸.
6. Una volta che la "colla embrionale" si è asciugata, posizionare delicatamente il lato della colla di coprisciuga in cima alla fila di embrioni allineati sull'agar, lasciando 2-3 mm di spazio tra il bordo del coverslip e la fila di embrioni.
   NOTA: Attaccare gli embrioni troppo vicino al bordo del coverslip può portare all'essiccazione troppo degli embrioni nel corso dell'esperimento.
7. Capovolgere il coverslip in modo che gli embrioni siano ora rivolti verso l'alto. Devono essere bloccati in una linea lungo un lungo bordo del coverslip e la loro regione ventrale rivolta verso il bordo più vicino del coverslip (Figura 1, passo 4, ingrandito).
8. Essiccare gli embrioni posizionando delicatamente il coperchio con embrioni sopra 150 g di essiccante blu fresco conservato in un barattolo superiore a vite da 16 once. Avvitare saldamente il coperchio e incubare per 8-10 minuti(Figura 1,fase 5).
9. Dopo l'essiccazione, rimuovere il coverslip dal barattolo essiccante e nastro ogni lato corto del coverslip a uno scivolo del microscopio, lato embrioneverso l'alto, con due^{pezzi da 4} cm 2 di nastro a doppia mano in modo che il coverslip dell'embrione si adattiallo stadio di iniezione (Figura 1,fase 6).
10. Aggiungere 2-3 gocce di olio di Alocarbonio 27 con una pipetta Pasteur per coprire gli embrioni allineati e proteggerli da un'ulteriore disidratazione (Figura 1, fase 6).

4. Embrioni di iniezione e stress termico per promuovere la formazione di aste di actina

NOTA: Tutte le iniezioni vengono fatte in una stanza a temperatura controllata a 18 °C.

1. Preparare camere di incubazione umide da una piastra di Petri in vetro di dimensioni di almeno 100 mm x 20 mm e allineare la camera con torsioni di tergicristalli di laboratorio inumiditi con acqua distillata(Figura 1,fase 8). Pre-riscaldare le camere di incubazione a 32 °C o la temperatura di incubazione desiderata prima di iniettare embrioni.
2. Aprire la valvola di flusso d'aria per il microiniettore e accendere il microiniettore (è adatta aria compressa o aria di casa con una pressione di almeno 90 psi).
3. Mentre gli embrioni sono in essiccazione, scaricare il supernatante G-actin^Red precedentemente preparato nel microneedle utilizzando una punta del micro caricatore. Impostare la pipetta per disegnare 1-1,5 μL.
   NOTA: A causa della viscosità dell'actina, i volumi di carico potrebbero non essere accurati e potrebbe esserci abbastanza actina per caricare almeno uno o due microneedle in più. È possibile iniettare fino a 60 embrioni per microneedle caricato se il microneedle è calibrato correttamente e non si intasa nel corso dell'esperimento.
4. Fissare il microneedle al supporto dell'ago e stringere la vite. Collegare il tubo dell'aria al microiniettore e assicurarsi che la pressione di riflusso sugli equilibrati del microneedle si equilibra a 30 hPa.
5. Calibrare le impostazioni del microiniettore per espellere una bolla di 100 μm di diametro di G-actin^Rosso (~500 pL) su un micrometro a scorrimento. Ruotare la manopola di pressione (500-1500 hPa) e la manopola del tempo dell'impulso di iniezione (0,1-0,5 s) sul microiniettore per ottenere la giusta dimensione della bolla. Regolare queste impostazioni ogni volta che viene caricato un nuovo microneedle per tenere conto della variabilità nella viscosità dell'actina e nella dimensione della punta del microneedle.
   NOTA: Il G-actin^{Rosso preparato è} viscoso e ci può essere aria nella punta del microrischio che deve essere espulsa prima di iniettare embrioni. Se il G-actin^{Red non} espelle facilmente dalla punta del microneedle, rompere delicatamente la punta del microneedle contro il bordo del micrometro di scorrimento.
6. Posizionare lo scivolo con embrioni montati sullo stadio del microscopio.
   NOTA: Ogni configurazione di iniezione sarà diversa, quindi i ricercatori dovranno regolare il loro metodo di iniezione di conseguenza. Qui gli embrioni vengono spostati rispetto a un microneedle stazionario, iniettando ogni embrione facendo correre l'embrione nel microneedle.
7. Regolare lo stadio del micromanipolatore e mettere a fuoco l'obiettivo 10x sul microscopio luminoso in modo che gli embrioni siano visibili. Gli embrioni si trovano nel piano focale corretto quando i contorni della membrana vitellina sono più nitidi e l'embrione appare più grande. Scegli embrioni da iniettare che si trovano nella fase di sviluppo corretta, in modo che quando l'incubazione post-iniezione è completa, la maggior parte della frizione raggiunge lo stadio di sviluppo desiderato (ad esempio, iniettare embrioni allo stadio 2-3³⁰ di Bownes per osservare le aste alla cellularizzazione dopo lo stress termico a 32 °C).
8. Utilizzare i controlli del microneedle per portare l'ago nello stesso piano focale degli embrioni.
   NOTA: Se il microneedle cattura il coperchio durante lo spostamento dello stadio o del microneedle, il microneedle è troppo vicino allo scivolo e non si trova nel piano focale corretto. Il microneedle deve essere parallelo al coverslip e non ad un angolo significativo (Figura 1, fase 7).
9. Inserire il microneedle nell'embrione in modo che colpisca l'embrione al centro della sua regione ventrale, all'embrione "equatore". Innesco dell'iniezione con il pedale o il pulsante "iniettare" quando la punta del microneedle è visibile all'interno del centro dell'embrione (Figura 1, fase 7).
10. Iniettare il G-actin^Red una volta e rimuovere lentamente il microneedle. Spostare lo stadio e ripetere per ogni embrione dello stadio di sviluppo appropriato.
    NOTA: L'espansione dell'embrione è normale in quanto il rosso G-actina viene iniettato e un po 'di citoplasma può fuoriuscire dall'embrione.
11. Dopo che tutti gli embrioni sono stati iniettati, posizionare lo scivolo con gli embrioni nella camera di incubazione umida preparata e chiudere il coperchio(Figura 1,fase 8). Se si cerca di ottenere embrioni che raggiungono la cellularizzazione, il calore stressa gli embrioni a 32 °C per 60-75 min nella camera di incubazione umida.
    NOTA: Si notano tempi di incubazione che consentono la visualizzazione delle aste negli embrioni stressati dal calore cellularizzanti. Il tempo di incubazione sarà più lungo per gli embrioni di controllo dello stress non termico perché lo sviluppo sarà più lento a una temperatura^{inferiore 31}. Questi embrioni di controllo possono essere incubati in camere umide a temperature come 18 °C o 25 °C, a seconda della progettazione dell'esperimento specifico e della domanda da fare. Il tempo minimo di incubazione necessario affinché il G-actin^{Rosso si disffondono} in tutto l'embrione è di 30 minuti.

5. Aste di actina dell'immagine in embrioni stressati dal calore mediante microscopia confocale

1. Mentre gli embrioni sono stressati dal calore, accendere il microscopio confocale e selezionare il canale laser a 561 nm.
2. Spostare l'obiettivo (25x, 40x o 63x consigliato) nella posizione di lavoro.
3. Se si imaging embrioni stressati dal calore, impostare l'incubatore di stadio riscaldato per raggiungere una temperatura interna di 32 °C. Un termometro point-and-shoot o infrarosso può essere utilizzato per controllare la temperatura a o vicino all'obiettivo.
4. Rimuovere lo scivolo con embrioni iniettati dalla camera di incubazione umida al termine dell'incubazione(Figura 1,fase 9).
5. Lavorando rapidamente, indiscrere delicatamente i pezzi di nastro a doppia mano utilizzati per aderire al coverslip con embrioni montati allo scivolo (Figura 1, fase 9).
   ATTENZIONE: Sii gentile durante questi passaggi poiché i coprispasmi possono facilmente frantumarsi se viene applicata troppa forza.
6. Attaccare insieme due pezzi lunghi 2,5 cm di nastro a doppia mano e tagliare il nastro a metà longitudinalmente per realizzare due strisce, lunghe 2,5 x 0,5 cm(Figura 1,passo 10).
7. Attaccare due terzi della lunghezza di ogni striscia di nastro sul primo coverslip, fiancheggiando ogni lato degli embrioni nell'olio di Alocarbonio 27(Figura 1,passo 10, arancione),lasciando un terzo delle strisce di nastro appese al bordo del primo coverslip dove gli embrioni sono bloccati. Usa le mani guantate e fai attenzione a non toccare gli embrioni durante questo passaggio.
8. Posizionare delicatamente un secondo coverslip rettangolare sopra le strisce di nastro per inserire gli embrioni tra le copertine(Figura 1,passo 10, blu). Allineare i bordi di 25 mm ma mantenere i bordi di 50 mm sfalsati l'uno dall'altro di 1 cm di larghezza.
   NOTA: La superficie completa di questo secondo coverslip diventerà la nuova superficie di imaging che affronterà l'obiettivo, quindi fai attenzione a non ottenere impronte digitali o olio di Alocarbonio 27 su questa seconda superficie di coverslip. L'offset è necessario in modo che sia possibile aggiungere olio extra di Alocarbonio 27 per immergere uniformemente gli embrioni. Se necessario, aggiungere l'olio di Alocarbonio 27 nella cucitura in cui i due copriscili si incontrano nella parte superiore del panino e rivestirà gli embrioni per azione capillare (vedi linee tratteggiate nella Figura 1, fase 10).
9. Toccare delicatamente le aree del coverslip che si trovano direttamente sopra le strisce di nastro con il lato smussato di un razorblade per ottenere il coverslip per aderire al nastro.
10. Capovolgere il sandwich di coverslip e posizionarlo su un tergicristallo di laboratorio per mantenere pulita la superficie di imaging e portarlo al microscopio confocale (Figura 1, passo 11). Assicurarsi che il nastro sia completamente attaccato a entrambe le copertine prima dell'imaging.
11. Verificare che lo stadio riscaldato sia a temperatura e, se si utilizza un microscopio invertito, aggiungere liquido ad immersione sull'obiettivo selezionato.
12. ^Posizionare il sandwich di copra sul palco con attenzione per assicurarsi che la nuova superficie di imaging (2 ° coverslip) sia quella che tocca il liquido ad immersione(Figura 1,fase 11).
    NOTA: Se necessario, aderire al sandwich di coverlip al palco con due piccoli pezzi di nastro a doppia faccia per evitare movimenti inutili durante l'imaging se i coprispavimenti non si adattano bene allo stadio riscaldato.
13. Concentrarsi su un embrione in cellularizzazione (Bownes stage 4a³⁰) o sullo stadio di sviluppo desiderato utilizzando luce trasmessa o fluorescenza.
14. Una volta che un embrione è stato messo a fuoco, passare alla modalità di acquisizione laser sul microscopio confocale e regolare la potenza e il guadagno laser, le dimensioni del fotogramma, la piastrellatura e le impostazioni di proiezione a piacere.
15. Guarda le immagini della vista superficiale attraverso i piani focali dei nuclei dell'embrione per trovare barre di actina intranucleari. Le aste devono apparire in più orientamenti come striature o punti luminosi all'interno dei nuclei relativamente scuri (Figura 2A, 2C).

6. Esperimenti di imaging alternativi

1. Eseguire FRAP per studiare il turnover dell'actina lungo la lunghezza delle aste di actina intranucleare o nelle strutture dell'actina citoplasmatica, come le punte dei solchi della membrana plasmatica durante la cellularizzazione.
2. Nel software di imaging, scegliere una regione rettangolare attorno a punte di solco o aste actin in cui acquisire l'esperimento.
3. Scegliere una piccola regione quadrata al centro di un'asta actina all'interno della regione di acquisizione rettangolare per sbiancare. Assicurarsi che le punte dell'asta actina siano visibili e non vengano sbiancate nel corso dell'esperimento per consentire un tracciamento accurato dell'asta all'interno del nucleo.
4. Impostare il laser a candeggina per iterare 50x e impostare la potenza laser della candeggina al massimo.
5. Scegli un percorso orario per acquisire immagini ogni secondo per un totale fino a 120 s alla massima velocità di abitare dei pixel e imposta il laser per sbiancare dopo i primi due secondi di acquisizione dell'immagine.
6. Quantificare i dati per determinare l'half-time del recupero della fluorescenza¹.

Risultati

Un flusso di lavoro schematico di gestione degli embrioni è illustrato nella figura 1e un calendario per un esperimento tipico è presentato nella tabella 1. Una stima per un buon risultato sperimentale è che per ogni 10 embrioni iniettati, almeno la metà degli embrioni visualizzati sarà nella fase di sviluppo corretta, integra, e mostrerà una ROBUSTA ASR con stress termico a 32 °C. Questo ASR sarà evidenziato dall'assemblaggio di barre di actina intranucleare, come ...

Discussione

Il significato di questo metodo è che utilizza il protocollo ben consolidato di microiniezione negli embrioni di Drosophila ^{21,22, 23,24,25,26,27} per consentire nuove ricerche riguardanti l'ASR e l'assemblaggio dell'asta di actina di accompagnamento. Uno dei principali vantaggi del...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine triphosphate (ATP)	Millipore-Sigma	A23835G	Component of G buffer
Apple juice, Mott's, 64 fl oz	Mott's	014800000344	Component of apple juice plates
Bacto Agar	BD	214010	Component of apple juice plates
Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite	KIK International	059647210020	For dechorionating embryos
Calcium chloride	Millipore-Sigma	C1016500G	Component of G buffer
Cell strainer, 70 μm	Falcon	352350	For collecting dechorionated embryos
Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan	Zeiss	0000001994956	For imaging intranuclear actin rods
Desiccant	Drierite	24001	For desiccating embryos
Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom	Zeiss	4350649000000	For arranging embryos on agar wedge
Dissecting needle, 5 in	Fisher Scientific	08965A	For arranging embryos on agar wedge
Dithiothreitol (DTT)	Fisher Scientific	BP1725	Component of G buffer
Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in	3M	021200010323	For making embryo glue
Embryo collection cage	Genessee Scientific	59100	For housing adult flies and collecting embryos
Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5	Electron Microscopy Sciences	72701D	For arranging embryos on agar wedge
Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm	World Precision Instruments, Inc.	TW1004	For microneedles
Halocarbon oil 27	Millipore-Sigma	H8773100ML	For hydration of embryos
Heated stage incubator	Zeiss	4118579020000, 4118609020000, 4118609010000	For confocal imaging
Lab Tissue Wipers, KimWipes	Kimberly-Clark	34155	Lab tissue wipers
Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished	Zeiss	Discontinued	Injection microscope
Methyl-4-hydroxybenzoate	Millipore-Sigma	H36471KG	Component of apple juice plates
Microinjector, FemtoJet4x	Eppendorf	5253000025	Microinjector
Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL	Eppendorf	5242956003	For loading microneedles
Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment	Bernard Instruments, Inc (Houston, TX)	Custom	For performing microinjections
Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown	Sutter Instruments	P97	For pulling capillary tubes to make microneedles
Microscope cover glass 24x50-1.5	Fisher Scientific	12544E	For mounting embryos
Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm	Fisher Scientific	22037081	For mounting embryos for injection
n-Heptane	Fisher Scientific	H3601	Component of embryo glue
Objective, 10x	Zeiss	Discontinued	10x objective for injection microscope
Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS	Zeiss	4217679971711	40x water objective for confocal
Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm)	Zeiss	4208529871000	25x mixed immersion objective for confocal
Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA	Zeiss	4207829900799	63x oil objective for confocal
Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2	Daler-Rowney	038372016954	For transferring embryos
Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white	Kimberly-Clark	884266344845	For blotting cell strainer
Pasteur pipette, 5 3/4 in	Fisher Scientific	1367820A	For covering embryos with oil
Petri dish, glass, 100 x 20 mm	Corning	3160102	For humid incubation chamber
Petri dish, plastic, 60 x 15 mm	VWR	25384092	For apple juice plates
Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL	Eppendorf	2231000604	For loading the microneedle
Pipette tip, xTIP4 250 μL	Biotix	63300006	For adding embryo glue to coverslip
Razor blade	VWR	55411050	For cutting agar wedge, tape, pipette tips
Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 μg)	Cytoskeleton, Inc.	APHR-A	G-actin^Red
Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps	Fisher Scientific	033377	For making embryo glue
Screw top jar, 16 oz	Nalgene	000194414195	For desiccating embryos
Stage micrometer	Electron Microscopy Sciences	602104PG	For calibrating volume of G-actin injection
Sucrose	Millipore-Sigma	840971KG	Component of apple juice plates
Trizma base	Millipore-Sigma	T15031KG	Component of G buffer
Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz	Lesaffre Yeast Corporation	117929157002	Component of yeast paste