تطبيق Microdissection الليزر لكشف النسخ الإقليمية في أنسجة الكلى البشرية

Summary

نحن وصف بروتوكول للmicrodissection الليزر من أجزاء فرعية من الكلى البشرية، بما في ذلك كبيبات الكبيب، tubule القريب، سميكة صعود الطرف، وجمع القناة والتهائل. ثم يتم عزل الجيش الملكي النيبالي عن المقصورات التي تم الحصول عليها ويتم تنفيذ تسلسل الحمض النووي الريبي لتحديد التغييرات في التوقيع النسخي داخل كل جزء فرعي.

Abstract

تحليل التعبير الجيني للأنسجة الكلى البشرية هو أداة هامة لفهم التوازن والأمراض في الفيزيولوجيا. زيادة دقة وعمق هذه التكنولوجيا وتوسيعها إلى مستوى الخلايا داخل الأنسجة هناك حاجة. على الرغم من أن استخدام تسلسل الحمض النووي والرنا وحيد الخلية الواحد أصبح واسع الانتشار، فإن تواقيع التعبير للخلايا التي تم الحصول عليها من تفكك الأنسجة لا تحافظ على السياق المكاني. من شأن الميكروستيكشن بالليزر (LMD) القائم على علامات فلورية محددة أن يسمح بعزل هياكل محددة ومجموعات خلايا ذات أهمية مع التعريب المعروف، مما يسمح بالحصول على توقيعات مستنسخة ذات رسوخ مكانية في أنسجة الكلى. لقد قمنا بتحسين منهجية LMD ، مسترشدة بصبغة سريعة تستند إلى الفلورانس ، لعزل خمس مقصورات متميزة داخل الكلى البشرية وإجراء تسلسل الحمض النووي الريبي اللاحق من عينات أنسجة الكلى البشرية القيمة. كما نقدم معايير لمراقبة الجودة لتمكين تقييم مدى كفاية العينات التي تم جمعها. يُظهر سير العمل الموضح في هذه المخطوطة جدوى هذا النهج لعزل التوقيعات المستنسخة الجزئية الفرعية بثقة عالية. ويمكن أيضاً تطبيق النهج المنهجي المعروض هنا على أنواع الأنسجة الأخرى مع استبدال علامات الأجسام المضادة ذات الصلة.

Introduction

وقد تحسنت التطورات التكنولوجية في دراسة عينات الأنسجة فهم الحالة الصحية والمرض في مختلف الأجهزة. وقد أكدت هذه التطورات أن علم الأمراض يمكن أن تبدأ في مناطق محدودة أو في أنواع محددة من الخلايا، ولكن لها آثار هامة على الجهاز بأكمله. ولذلك ، في العصر الحالي من الطب الشخصي ، من المهم أن نفهم علم الأحياء على حد سواء الخلية والمستوى الإقليمي وليس فقط على الصعيد العالمي^1. وينطبق هذا بشكل خاص على الكلى ، التي تتكون من خلايا وهياكل متخصصة مختلفة تبدأ و / أو تستجيب بشكل متمايز للإجهاد المرضي. لا يزال المرض من أنواع مختلفة من أمراض الكلى البشرية غير مفهومة جيدا. ومن ثم فإن توليد منهجية لدراسة التغيرات في التعبير الجيني في أجزاء أنبوبية محددة أو هياكل أو مناطق من التداخل في الكلى البشرية سيعزز القدرة على الكشف عن التغيرات المحددة في المنطقة التي يمكن أن تُعلم عن التسبب في المرض.

عينات خزعة الكلى البشرية هي مورد محدود وثمين. لذلك، ينبغي تحسين التقنيات استجواب transcriptomics في أنسجة الكلى إلى الاقتصاد في الأنسجة. وتشمل الطرق المتاحة لدراسة النسخ على مستوى الخلية والمستوى الإقليمي تسلسل RNA خلية واحدة (scRNaseq)، RNaseq النووية واحدة (snRNaseq)، في التهجين المكاني في الموقع، والصغرى الليزر (LMD). وهذا الأخير مناسب تماماً لعزل المناطق أو الهياكل ذات الاهتمام الدقيق داخل أقسام الأنسجة، لتسلسل الحمض النووي الريبي في المصب^{وتحليله 2و3و4و5}. يمكن اعتماد LMD للاعتماد على تحديد أنواع أو هياكل محددة من الخلايا استنادًا إلى علامات معتمدة باستخدام التصوير القائم على الفلور أثناء التشريح.

وتشمل السمات الفريدة لتقنيات النسخ المجهرية بالليزر التي تساعد على ذلك: 1) الحفاظ على السياق المكاني للخلايا والهياكل، الذي يكمل تكنولوجيات الخلايا المفردة التي يتم فيها تحديد الخلايا بالتعبير وليس بالسنولوجيا؛ (2) الحفاظ على السياق المكاني للخلايا والهياكل؛ (2) الحفاظ على البيئة الجغرافية؛ (2) استخدام تكنولوجيات الخلايا المفردة؛ (2) الحفاظ على البيئة الجغرافية للخلايا والهياكل؛ (2) الحفاظ على الخلايا والهياكل؛ (2) الحفاظ على البيئة المكانية للخلايا والهياكل؛ (2) استخدام تكنولوجيات الخلايا الصغيرة التي يتم تحديدها باستخدامها في الهياكل المحددة؛ (2) الحفاظ على استخدام الخلايا الصغيرة في المناطق التي يتم فيها استخدام الخلايا الصغيرة في المناطق التي يتم فيها تحديدها باستخدامها في 2) التكنولوجيا بإعلام ويتم إبلاغها من قبل تقنيات التصوير الأخرى لأن علامة الأجسام المضادة يحدد توقيعات التعبير؛ 3) القدرة على تحديد الهياكل حتى عندما علامات تغيير في المرض؛ 4) الكشف عن المحاضر أعرب عن انخفاض في ما يقرب من 20،000 الجينات؛ و 5) اقتصاد الأنسجة ملحوظا. التكنولوجيا قابلة للتطوير إلى خزعة الكلى مع أقل من 100 μm سمك من نواة ضرورية للحصول على ما يكفي من RNA وتمكن من استخدام الأنسجة المجمدة المؤرشفة ، والتي تتوفر عادة في مستودعات كبيرة أو المراكز الأكاديمية⁶.

في العمل الذي أعقب ذلك، ونحن وصف التكنولوجيا النسخ الإقليمية والجملة بالتفصيل، الأمثل مع بروتوكول تلطيخ الفلوريسينس السريعة رواية للاستخدام مع أنسجة الكلى البشرية. هذا النهج يحسن على استكشافات LMD الكلاسيكية لأنه يوفر بيانات التعبير منفصلة للفصيلات الفرعية والنيفرون بدلا من التعبير توبولونترسالية الكلي. وتشمل هذه التدابير تدابير ضمان الجودة والرقابة التي تم تنفيذها لضمان الصرامة وقابلية التكرار. ويتيح البروتوكول تصور الخلايا والمناطق ذات الأهمية، مما يؤدي إلى الحصول على RNA بشكل مرض من هذه المناطق المعزولة للسماح بتسلسل الحمض النووي الريبي في المصب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على الدراسة لاستخدامها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) في جامعة إنديانا.

ملاحظة: استخدم هذا البروتوكول مع أنسجة استئصال الكلى (حتى 2 سم في كل من أبعاد X و Y) المحفوظة في مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) وتخزينها عند -80 درجة مئوية. أداء جميع الأعمال بطريقة تحد من التلوث RNA، واستخدام قفازات نظيفة يمكن التخلص منها وقناع الوجه. ضمان نظافة جميع الأسطح. المعدات التي تم تحسين هذا البروتوكول هو نظام microdissection الليزر تتميز ليزر الأشعة فوق البنفسجية نبض.

1. القاء الكرياء

1. 1.2 μm LMD PPS-غشاء (بولي (p-p-phenylene كبريتيد) الشرائح للأشعة فوق البنفسجية (في نسيج غطاء تدفق لارينار لثقافة) لمدة 30 دقيقة، مباشرة قبل cryosectioning. تخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة للانضمام الأمثل للأنسجة.
2. تبريد التبريد إلى -20 درجة مئوية. تنظيف أسطح العمل وتثبيت شفرة قطع جديدة.
3. ضع مربع شريحة صغيرة (تنظيفها مع RNase حل إزالة التلوث السطح) داخل غرفة التبريد لتخزين الشرائح مع الأنسجة قطع حديثا.
4. الانضمام إلى العينة في أكتوبر إلى حامل الأنسجة والسماح لها لتكليل لبضع دقائق للوصول إلى درجة حرارة الغرفة وتعزيز التصاق بين كتلة أكتوبر وحامل. المساعدة في العملية باستخدام مستخرج حراري.
5. قطع العينة إلى سمك 12 ميكرومتر ولصقها على الشريحة LMD المتخصصة، وذلك باستخدام محول الشريحة. تحتوي كل شريحة على قسم واحد لاستئصال الكلية لكل شريحة أو ما يصل إلى قسمين من خزعة الكلى لكل شريحة. قم بتخزين الشرائح عند -80 درجة مئوية بخراطيشة مجففة وداخل كيس بلاستيكي مغلق بإحكام لمنع تراكم الرطوبة الزائدة داخل مربع الشريحة.
6. تسمية كل شريحة مع معرف عينة وتاريخ ورقم الشريحة.
7. استخدم الشرائح مع العينات في غضون 10 أيام من التاريخ الأولي لتكرير الكرياض.

2. الليزر microdissection

1. مباشرة قبل تلطيخ، وإعداد مزيج الأجسام المضادة (Ab-ميكس) في 10٪ BSA في برنامج تلفزيوني RNase خالية من خلال إضافة ما يلي: 4 ميكرولتر من FITC-Phalloidin، 1.5 ميكرولتر من DAPI، 2 ميكرولتر من تام-هورسفال بروتين (THP) الأجسام المضادة مترافقة مباشرة إلى اليكسا فلور 546، 3.3 ميكرولتر من مثبط RNase، و 89.2 ميكرولتر من 10٪ BSA في برنامج تلفزيوني (للوصول إلى حجم 100 ميكرولتر).
   ملاحظة: يمكن استخدام الأجسام المضادة البديلة بدلاً من الأجسام المضادة THP. على سبيل المثال، يمكن استخدام 2 ميكرولتر من الأجسام المضادة ميغالين/LRP2، مترافق مباشرة مع فلور اليكسا 568، لتسمية الأنابيب القريبة. يحتوي Ab-Mix على جسم مضاد LRP2 أو THP (لتصور إما أنابيب قريبة أو أطراف صاعدة سميكة، على التوالي). قد يتم التحقق من صحة الأجسام المضادة الأخرى وفقا لاحتياجات المستخدم.
2. غسل الشريحة في الجليد البارد (-20 درجة مئوية) 100٪ الأسيتون لمدة 1 دقيقة ونقله إلى غرفة الرطوبة.
3. غسل الجزء العلوي من الشريحة مع برنامج تلفزيوني RNase خالية لمدة 30 s. كرر.
4. غسل الجزء العلوي من الشريحة مع 10٪ BSA في برنامج تلفزيوني RNase خالية لمدة 30 s. كرر.
5. تطبيق Ab-Mix لمدة 5 دقائق.
6. غسل الجزء العلوي من الشريحة مع 10٪ BSA في برنامج تلفزيوني RNase خالية لمدة 30 s. كرر.
7. الهواء الجافة الشريحة لمدة 5 دقائق وتحميله على منصة قطع microdissection الليزر.
8. تثبيت أنابيب جمع (autoclaved 0.5 مل أنابيب microcentrifuge) مناسبة لعمل PCR، التي تحتوي على 50 ميكرولتر من مخزن الاستخراج من طقم العزلة RNA.
9. المضي قدما مع LMD. أكمل كل جلسة LMD في غضون ساعتين على الأكثر.
   1. جمع الصور قبل وما بعد LMD immunofluorescence، وذلك باستخدام كاميرا المجهر للتحقق من صحة تشريح للتباين بين المشغلين، فضلا عن أغراض المحفوظات والتدريب وتقييم الجودة للبروتوكول المنجز. من أجل الحصول على 0.5 - 1 نانوغرام من الجيش الملكي النيبالي، مطلوب ما لا يقل عن 500،000 μm² المساحة. وهذا يتطلب في كثير من الأحيان استخدام ما يصل إلى 8 μm 8 أجزاء سميكة μm للحصول على كمية كافية من المواد لجميع القطاعات الفرعية من الفائدة.
   2. تحديد المناطق ذات الأهمية عن طريق تلطيخ، مورفولوجيا وموقع ومكوس لهم باستخدام قوة الليزر أكبر من 40.
      ملاحظة: هنا معايير تشريح. يتم تعريف الأنبوبة القريبة بواسطة FITC-Phalloidin و LRP2 التسمية. يتم تعريف الطرف الصاعد سميكة من قبل THP وضع العلامات. يتم تعريف قناة التجميع بواسطة مورفولوجيا النووية (DAPI) وعدم وجود تلطيخ آخر. يتم تعريف الكبيبات من قبل FITC-Phalloidin ومورفولوجيا. ويعرف الخلية على أنها المنطقة بين الأنابيب الملون.
10. الحصول على توقيع تعبير مقطعي مقطعي مجمع عن طريق لصق قسمين 12 ميكرومتر على شريحة LMD وتشريح المقاطع بأكملها في مخزن الاستخراج المؤقت.
11. عند الانتهاء من عملية LMD، قم بإغلاق أنابيب microcentcentuge جمع ونفض الغبار بقوة لضمان أن المحتوى انتقل من الغطاء إلى أسفل الأنبوب
12. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 3000 س ز لمدة 30 s.
13. احتضان الأنابيب في 42 درجة مئوية حمام مائي لمدة 30 دقيقة.
14. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 3000 س ز لمدة 2 دقيقة.
15. نقل عظمى إلى أنبوب 0.5 مل جديدة وتخزينها في -80 درجة مئوية.

3. RNA العزل

ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول عزل RNA، قمنا بتكييف بروتوكول من مجموعة العزل RNA التجارية. تم تعديل بروتوكول الشركة المصنعة لتلبية متطلبات مراقبة الجودة التي تم تعيينها للمشروع.

1. أضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت المشروط (CB) لكل عمود تنقية RNA (PC) وحضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
2. أجهزة الطرد المركزي جميع أجهزة الكمبيوتر لمدة 1 دقيقة في 16،000 س ز.
3. إضافة 50 ميكرولتر من 70٪ الإيثانول (المقدمة في عدة) في الأنابيب مع عينات الأنسجة. مزيج العينات جيدا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا. لا دوامة. لا الطرد المركزي.
4. نقل الخليط إلى أجهزة الكمبيوتر مكيفة والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 100 × ز (لربط RNA)، اتبع بسرعة مع الطرد المركزي لمدة 30 s في 16،000 س ز (لإزالة تدفق من خلال). كرر هذه الخطوة إذا كان أكثر من 1 أنبوب مع عينات الأنسجة المتاحة لأي شريحة فرعية معينة.
5. إضافة 100 μL من الغسيل العازل 1 (WB1) في أجهزة الكمبيوتر وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 8000 س ز.
6. إعداد 40 ميكرولتر من DNase لكل عينة (أضف 5 ميكرولتر من DNase إلى 35 ميكرولتر من العازلة RDD). ثم إضافة 40 μL من الخليط مباشرة على غشاء الكمبيوتر واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
7. إضافة 40 ميكرولتر من WB1 على غشاء PC، والطرد المركزي لمدة 15 s في 8000 x ز.
8. إضافة 100 μL من غسل العازلة 2 (WB2) على غشاء PC، والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 8،000 س ز.
9. إضافة 100 μL من WB2 على غشاء PC، والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 16،000 س ز،تليها مباشرة من قبل الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 16،000 س ز.
10. نقل الكمبيوتر إلى أنبوب جديد 0.5 مل.
11. أضف 12 ميكرولتر من عازلة Elution (EB) على الغشاء واحتضان لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وبالتالي، فإن الحجم النهائي لجميع العينات التشريحية تجمع الأنسجة هو 12 ميكرولتر لكل جزء فرعي.
12. الطرد المركزي العينات لمدة 1 دقيقة في 1000 س ز ثم لمدة 2 دقيقة في 16000 س ز.
13. نقل 2 ميكرولتر إلى أنبوب جديد لتحليل Bioanalyzer (لمنع تجميد ذوبان).
14. تخزين جميع الأنابيب في -80 درجة مئوية حتى جاهزة لمزيد من المعالجة.

4. تسلسل الجيش الملكي النيبالي

1. تقييم كل عينة، مخصصة لتسلسل، للجودة باستخدام Bioanalyzer التجارية ورقاقة مخصصة لقياس كميات صغيرة من الحمض النووي الريبي.
2. المعلمات التالية لمراقبة الجودة (QC) قبل الإعدادية للمكتبة وتسلسل مطلوبة: كمية من RNA أكبر من 4 نانوغرام لكميات كبيرة وأكبر من 0.5 - 1 نانوغرام لكل جزء فرعي; في المئة من النصوص أطول من 200 النيوكليوتيدات (DV200) مطلوب أن تكون أكبر من 25٪ لعينات LMD (الأمثل > 75٪).
3. تنفيذ الإعدادية مكتبة مع إعداد مكتبة cDNA التجارية طقم إعداد مكتبة مخصصة لكميات صغيرة من الحمض النووي الريبي المتدهورة. بالنسبة للمجموعة التجارية المذكورة في الملحق ، نقترح استخدام الخيار 2 ، الذي يتطلب الحد الأدنى من DV200 من 25 ٪ وعدم التجزئة. قد تتطلب بعض تقنيات التسلسل عتبات DV200 الحد الأدنى الأعلى ، مثل 30٪⁷.
4. إضافة محولات وفهارس cDNA.
5. تنقية المكتبات RNAseq باستخدام تكنولوجيا الخرز المغناطيسي.
6. نضوب الريبوسومال cDNA باستخدام مجموعة إزالة rRNA التجارية قبل RNAseq مكتبة خطوة التضخيم.
7. تنقية مكتبة RNAseq النهائي باستخدام تكنولوجيا حبة المغناطيسي في تركيز مكتبة cDNA 2 نانوغرام /ميكرولتر.
8. تنفيذ تسلسل الحمض النووي الريبي من 75 نقطة بريتيش بتروليوم يقترن نهاية على نظام تسلسل التجارية مع 30 مليون يقرأ / عينة للجملة و 100 مليون يقرأ / عينة لأقسام فرعية.
9. استخدم RNA المرجعي (25 ميكروغرام) مع كل تشغيل تسلسل للسماح بالسيطرة على تأثير الدفعة. التركيز الأولي للرنا المرجعي لدينا هو 1 ميكروغرام/ميكرولتر، في حين أن التركيز النهائي المستخدم في التسلسل هو 25 نانوغرام/ميكرولتر. تشغيل الحمض النووي الريبي المرجعي كعينة منفصلة أثناء إعداد المكتبة وتشغيلها مع جميع عينات LMD في كل مرة.
10. إجراء تحليل البيانات باستخدام تطبيق FastQC لتقييم جودة تسلسل، intergenic و القراءة الميتوكوندريا وتحديد قراءات المنسوبة إلى الجينات.
11. استخدام المتكاملة الجينوم عارض (IGV) للمحاذاة وحافة / rbamtools لمقاييس التعبير عن النص.
12. إزالة العينات مع أقل من 100،000 يقرأ. Quantile تطبيع يقرأ الخام في مجموعة البيانات بعد تصفية الجينات أعرب عن انخفاض في عتبة محددة من قبل المستخدم.
13. كمّي التعبير كنسبة من الجزء الفرعي من الفائدة إلى متوسط جميع الأجزاء الفرعية الأخرى و log2-transform. ويمكن مقارنة التعبير النسبي لنفس الجين عبر الأجزاء الفرعية والعينات؛ ومع ذلك، فإنه ليس من المثالي لمقارنة التعبير النسبي بين اثنين من الجينات المختلفة بسبب الاختلافات المحتملة في التدهور عبر الجينات وأنواع الحمض النووي الريبي.
14. إجراء تحليل للإثراء لمقارنة التعبير الجيني لمجموعة من صانعي محددة لكل شريحة فرعية من النيفرون، في حين تتم مقارنة عينات RNA المرجعية عبر دفعات. يعتبر تأثير الدُفعة ضمن انحراف معياري 1 للتعبير المتوسط مع قيمة R > 0.9 مقبولاً. مطلوب التطبيع إضافية للحصول على درجة تأثير دفعة أعلى. يمكن وضع علامة على أي تشغيل ينحرف عن تأثير الدفعة المقبول. يجب أن يكون Q30 أكبر من > 90٪ لكل تشغيل تسلسل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

عينات

نقدم بيانات من تسعة زرع الكلية المرجعية (3 عينات تم الحصول عليها في جامعة إنديانا و 6 عينات تم الحصول عليها من خلال مشروع طب دقة الكلى)، وذلك باستخدام بروتوكول تلطيخ الفلوريسين السريع لعزل أجزاء الكلى والمناطق الخلالية. تم الحصول على الأقسام المستخدمة في هذه ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

LMD المستندة إلى transcriptomics هي تقنية مفيدة التي ترسي التعبير الجيني لمناطق محددة داخل الأنسجة. وقد وصفت أساس هذه التكنولوجيا وتطبيقها المحتملة في الكلى سابقا⁸. ومع ذلك ، فإن التحسين والتحديث وتبسيط التشريح القائم على الفلور الذي يهدف على وجه التحديد إلى تشريح الدقة العالية لتسلس...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	270725-1L
AMPure Beads	Beckman Coulter	A63880
Bioanalyzer	Agilent	2100
BSA	VWR	0332-100G
DAPI	ThermoFisher	62248
Desiccant Cartridge	Bel-Art	F42046-0000
DNAse	Qiagen	79254	RDD buffer is included in the pakage
Laser Microdissection Microscope	Leica	LMD6500
Megalin/LRP2 Antibody	Abcam	ab76969	Directly conjugated to Alexa Fluor 568
Microcentrifuge tubes	ThermoFisher	AB-0350
Microscope camera	Leica	DFC700T
PBS (RNAse Free)	VWR	K812-500ML
Phalloidin (Oregon Green 488)	ThermoFisher	O7466
PicoPure RNA Isolation Kit	Applied Biosystems	KIT0204
PPS-membrane slides	Leica	11505268
qPCR Human Reference Total RNA 25 µg	Takara Clontech	636690
RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip	Agilent	5067-1513
RNAse Away	ThermoFisher	7000
RNAse Inhibitor	ThermoFisher	AM2696
Sequencer (HiSeq or NovaSeq)	Illumina	NA
SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2	Takara Clontech	634411
Tamm-Horsfall Protein Antibody	R&D Systems	AF5144	Directly conjugated to Alexa Fluor 546
Tissue-Tek® O.C.T. Compound	Sakura	4583