Anwendung der Laser-Mikrodissektion zur Aufdeckung der regionalen Transkriptomik im menschlichen Nierengewebe

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll für die Lasermikrodissektion von Untersegmenten der menschlichen Niere, einschließlich des Glomerulus, proximalen Tubuli, dick aufsteigender Gliedmaße, Sammelkanal und Interstitium. Die RNA wird dann aus den erhaltenen Kompartimenten isoliert und die RNA-Sequenzierung wird durchgeführt, um Veränderungen in der transkriptomischen Signatur innerhalb jedes Teilsegments zu bestimmen.

Zusammenfassung

Die Genexpressionsanalyse des menschlichen Nierengewebes ist ein wichtiges Werkzeug, um Homöostase und Krankheitspathophysiologie zu verstehen. Es ist notwendig, die Auflösung und Tiefe dieser Technologie zu erhöhen und sie auf die Ebene der Zellen im Gewebe auszudehnen. Obwohl die Verwendung von einzelnuklearen und einzelzelligen RNA-Sequenzierungen weit verbreitet ist, behalten die Expressionssignaturen von Zellen, die aus der Gewebedissoziation gewonnen werden, keinen räumlichen Kontext bei. Lasermikrodissektion (LMD) auf Basis spezifischer fluoreszierender Marker würde die Isolierung spezifischer Strukturen und Zellgruppen von Interesse mit bekannter Lokalisierung ermöglichen und so den Erwerb von räumlich verankerten transkriptomischen Signaturen im Nierengewebe ermöglichen. Wir haben eine LMD-Methodik optimiert, die von einem schnellen fluoreszenzbasierten Fleck geleitet wird, um fünf verschiedene Kompartimente innerhalb der menschlichen Niere zu isolieren und anschließende RNA-Sequenzierungen von wertvollen menschlichen Nierengewebeproben durchzuführen. Wir stellen auch Qualitätskontrollparameter vor, um die Angemessenheit der gesammelten Proben beurteilen zu können. Der in diesem Manuskript beschriebene Workflow zeigt die Durchführbarkeit dieses Ansatzes, subsegmentale transkriptomische Signaturen mit hoher Sicherheit zu isolieren. Der hier vorgestellte methodische Ansatz kann auch auf andere Gewebetypen mit Substitution relevanter Antikörpermarker angewendet werden.

Einleitung

Technologische Fortschritte bei der Untersuchung von Gewebeproben haben das Verständnis des Gesundheitszustands und der Krankheit in verschiedenen Organen verbessert. Solche Fortschritte haben unterstrichen, dass Pathologie in begrenzten Regionen oder in bestimmten Zelltypen beginnen kann, aber wichtige Auswirkungen auf das gesamte Organ hat. Daher ist es im gegenwärtigen Alter der personalisierten Medizin wichtig, die Biologie sowohl auf Zell- als auch auf regionaler Ebene zu verstehen und nicht nur weltweit¹. Dies gilt insbesondere für die Niere, die aus verschiedenen spezialisierten Zellen und Strukturen besteht, die differenziell pathologischen Stress initiieren und/oder darauf reagieren. Die Pathogenese verschiedener Arten menschlicher Nierenerkrankungen ist noch immer nicht gut verstanden. Die Generierung einer Methodik zur Untersuchung von Veränderungen der Genexpression in bestimmten röhrenförmigen Segmenten, Strukturen oder Bereichen des Interstitiums in der menschlichen Niere wird die Fähigkeit verbessern, regionale spezifische Veränderungen aufzudecken, die über die Pathogenese von Krankheiten informieren könnten.

Menschliche Nierenbiopsie-Proben sind eine begrenzte und wertvolle Ressource. Daher sollten Technologien, die Transkriptomik im Nierengewebe verhören, optimiert werden, um Gewebe zu sparen. Zu den verfügbaren Methoden zur Untersuchung der Transkriptomik auf Zell- und Regionaler Ebene gehören die einzellige RNA-Sequenzierung (scRNaseq), die einzelne kernatoische RNaseq (snRNaseq), die räumliche In-situ-Hybridisierung und die Lasermikrodissektion (LMD). Letzteres eignet sich gut für die präzise Isolierung von Regionen oder Strukturen von Interesse innerhalb von Gewebeabschnitten, für die nachgeschaltete RNA-Sequenzierung und -Analyse^2,3,4,5. LMD kann angenommen werden, um sich auf die Identifizierung bestimmter Zelltypen oder Strukturen basierend auf validierten Markern zu verlassen, die fluoreszenzbasierte Bildgebung während der Zerlegung verwenden.

Zu den einzigartigen Merkmalen der lasermikrodissektionengestützten regionalen Transkriptomik gehören: 1) die Erhaltung des räumlichen Kontextes von Zellen und Strukturen, die Einzelzelltechnologien ergänzt, bei denen Zellen durch Expression und nicht durch Histologie identifiziert werden; 2) die Technologie informiert und wird durch andere Bildgebungstechnologien informiert, weil ein Antikörpermarker Ausdruckssignaturen definiert; 3) die Fähigkeit, Strukturen zu identifizieren, auch wenn sich Marker in Derkrankheit ändern; 4) Nachweis von niedrig exprimierenden Transkripten in etwa 20.000 Genen; und 5) bemerkenswerte Gewebewirtschaft. Die Technologie ist skalierbar für eine Nierenbiopsie mit einer Dicke von weniger als 100 m eines Kerns, der für eine ausreichende RNA-Erfassung notwendig ist, und ermöglicht die Verwendung von archiviertem gefrorenem Gewebe, das in großen Repositories oder akademischen Zentren allgemein verfügbar ist⁶.

In der anschließenden Arbeit beschreiben wir die regionale und Massen-Transkriptomik-Technologie im Detail, optimiert mit einem neuartigen schnellen Fluoreszenz-Färbeprotokoll für die Verwendung mit menschlichem Nierengewebe. Dieser Ansatz verbessert die klassischen LMD-Explorationen, da er separate Ausdrucksdaten für die Interstitium- und Nephron-Untersegmente im Gegensatz zu aggregierter tubulointerstitialer Expression bereitstellt. Dazu gehören die Qualitätssicherungs- und Kontrollmaßnahmen, die zur Gewährleistung von Strenge und Reproduzierbarkeit durchgeführt werden. Das Protokoll ermöglicht die Visualisierung von Zellen und Interessensgebieten, was zu einer zufriedenstellenden Erfassung von RNA aus diesen isolierten Bereichen führt, um eine nachgeschaltete RNA-Sequenzierung zu ermöglichen.

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Protokoll

Die Studie wurde vom Institutional Review Board (IRB) der Indiana University genehmigt.

HINWEIS: Verwenden Sie dieses Protokoll mit Nierennephrektomiegewebe (bis zu 2 cm in der X- und Y-Dimension), das in der Verbindung optimale Schnitttemperatur (OCT) konserviert und bei -80 °C gelagert wird. Führen Sie alle Arbeiten in einer Weise durch, die die RNA-Kontamination begrenzt, verwenden Sie saubere Einweghandschuhe und eine Gesichtsmaske. Sorgen Sie für die Sauberkeit aller Oberflächen. Die Ausrüstung, für die dieses Protokoll optimiert wurde, ist ein Laser-Mikrodissektionssystem mit gepulsten UV-Laser.

1. Kryosektion

1. 1,2 m LMD-PPS-Membran (Poly(p-Phenylensulfid) diaglyzieren, um 30 Minuten lang, unmittelbar vor dem Kryosektions-, UV-Licht (in einer laminaren Strömungshaube) der Gewebekultur aussetzen. Bewahren Sie die Dias bei Raumtemperatur auf, um eine optimale Gewebehaftung zu gewährleisten.
2. Kühlen Sie den Kryostat auf -20 °C. Reinigen Sie die Arbeitsflächen und installieren Sie eine neue Schneidklinge.
3. Legen Sie eine kleine Schiebebox (mit RNase Oberflächendekontaminationslösung gereinigt) in die Kryostatkammer, um Dias mit frisch geschnittenem Gewebe zu lagern.
4. Die Probe in OCT an einem Gewebehalter kleben und einige Minuten ausgrenzen lassen, um die Kammertemperatur zu erreichen und die Haftung zwischen dem OCT-Block und dem Halter zu stärken. Helfen Sie den Prozess mit einem Wärmeabscheider.
5. Schneiden Sie die Probe auf eine Dicke von 12 m und befestigen Sie sie mit dem Schiebeadapter auf dem speziellen LMD-Schlitten. Jede Folie enthält einen Nephrektomieabschnitt pro Folie oder bis zu zwei Nierenbiopsieabschnitte pro Folie. Bewahren Sie die Dias bei -80 °C mit einer Entweichpatrone und in einer dicht verschlossenen Plastiktüte auf, um zu verhindern, dass sich überschüssige Feuchtigkeit in der Schiebebox ansammelt.
6. Beschriften Sie jede Folie mit einer Muster-ID, einem Datum und einer Foliennummer.
7. Verwenden Sie die Dias mit Proben innerhalb von 10 Tagen ab dem ursprünglichen Datum der Kryosektion.

2. Laser-Mikrodissektion

1. Bereiten Sie unmittelbar vor der Färbung den Antikörpermix (Ab-Mix) in 10% BSA in RNase-freier PBS vor, indem Sie folgendes hinzufügen: 4 l FITC-Phalloidin, 1,5 l DAPI, 2 L Tamm-Horsfall Protein (THP) Antikörper, die direkt mit Alexa Fluor 546 konjugiert werden, 3,3 l RNase-Inhibitor und 89,2 l von 10 % BSA in PBS (um ein Volumen von 100 l zu erreichen).
   HINWEIS: Anstelle des THP-Antikörpers können alternative Antikörper verwendet werden. Zum Beispiel können 2 l megalin/LRP2-Antikörper, direkt konjugiert mit Alexa Fluor 568, verwendet werden, um den proximalen Tubuli zu kennzeichnen. Der Ab-Mix enthält entweder LRP2- oder THP-Antikörper (zur Visualisierung von proximalen Tubuli bzw. dicken aufsteigenden Gliedmaßen). Andere Antikörper können je nach Benutzerwunsch validiert werden.
2. Waschen Sie die Rutsche in eiskalt (-20 °C) 100% Aceton für 1 min und bewegen Sie es in die Feuchtigkeitskammer.
3. Waschen Sie die Oberseite des Schlittens mit RNase-freien PBS für 30 s. Wiederholen.
4. Waschen Sie die Oberseite der Folie mit 10% BSA in RNase-freier PBS für 30 s. Wiederholen.
5. Tragen Sie den Ab-Mix für 5 min auf.
6. Waschen Sie die Oberseite der Folie mit 10% BSA in RNase-freier PBS für 30 s. Wiederholen.
7. Trocknen Sie den Schlitten 5 min lang an der Luft und laden Sie ihn auf die Laser-Mikrodissektionsschneideplattform.
8. Installieren Sie die für pcR-Arbeiten geeigneten Sammelrohre (autoklavierte 0,5 ml Mikrozentrifugenrohre), die 50 l Extraktionspuffer aus dem RNA-Isolationskit enthalten.
9. Fahren Sie mit LMD fort. Schließen Sie jede LMD-Sitzung innerhalb von höchstens 2 Stunden ab.
   1. Sammeln Sie Immunfluoreszenzbilder vor und nach der LMD, indem Sie die Mikroskopkamera verwenden, um die Sezierung für die Variabilität zwischen den Bedienern sowie für Archivierungszwecke, Schulungen und Qualitätsbewertungen des durchgeführten Protokolls zu validieren. Um 0,5 – 1 ng RNA zu erhalten, ist ein Minimum von 500.000^m2 Fläche erforderlich. Dies erfordert oft die Verwendung von bis zu 8 x 12 m dicken Abschnitten, um eine ausreichende Materialmenge für alle Teilsegmente von Interesse zu erhalten.
   2. Identifizieren Sie Regionen von Interesse durch Färbung, Morphologie und Lage und verbrauchen Sie sie mit Laserleistung größer als 40.
      HINWEIS: Hier sind die Sezierkriterien. Die proximale Tubuli wird durch FITC-Phalloidin und LRP2-Etikettierung definiert. Die dicke aufsteigende Extremität wird durch THP-Beschriftung definiert. Der Sammelkanal wird durch kerntechnische Morphologie (DAPI) und das Fehlen anderer Färbungen definiert. Der Glomerulus wird durch FITC-Phalloidin und Morphologie definiert. Das Interstitium ist definiert als der Bereich zwischen gefärbten Tubuli.
10. Erhalten Sie eine Massenquerschnittsausdruckssignatur, indem Sie zwei 12-m-Abschnitte an einer LMD-Folie anbringen und die gesamten Abschnitte in den Extraktionspuffer sezieren.
11. Schließen Sie nach Abschluss des LMD-Prozesses die sammelnden Mikrozentrifugenrohre und flicken Sie sie kräftig, um sicherzustellen, dass der Inhalt von der Kappe nach unten bewegt wird.
12. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 3.000 x g für 30 s.
13. Inkubieren Sie die Rohre in 42 °C Wasserbad für 30 min.
14. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 3.000 x g für 2 min.
15. Den Überstand auf ein neues 0,5 ml-Rohr übertragen und in -80 °C lagern.

3. RNA-Isolation

HINWEIS: Für dieses RNA-Isolationsprotokoll haben wir ein Protokoll aus einem kommerziellen RNA-Isolationskit angepasst. Das Protokoll des Herstellers wurde geändert, um die für das Projekt festgelegten Anforderungen an die Qualitätskontrolle zu erfüllen.

1. Fügen Sie jeder RNA-Reinigungssäule (PC) 250 l Bedingten Puffer (CB) hinzu und inkubieren Sie 5 min bei Raumtemperatur.
2. Zentrifugieren Sie alle PCs für 1 min bei 16.000 x g.
3. Fügen Sie 50 l 70 % Ethanol (im Kit enthalten) in die Röhrchen mit Gewebeproben. Mischen Sie die Proben gut, indem Sie nach oben und unten. Wirbel nicht. Zentrifugieren Sie nicht.
4. Das Gemisch in konditionierte PCs und Zentrifuge für 2 min bei 100 x g (zur Bindung der RNA) übertragen, schnell mit Zentrifugation für 30 s bei 16.000 x g folgen (um durchfließen). Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn mehr als 1 Röhrchen mit Gewebeproben für ein bestimmtes Untersegment verfügbar sind.
5. Fügen Sie 100 l Waschpuffer 1 (WB1) in die PCs und Zentrifuge für 1 Minute bei 8.000 x g.
6. Bereiten Sie 40 l DNase pro Probe vor (Hinzufügen von 5 l DNase zu 35 L RDD-Puffer). Dann 40 l des Gemischs direkt auf die Membran des PCs geben und 15 min bei Raumtemperatur brüten.
7. Fügen Sie 40 l WB1 auf die Membran des PCs und Zentrifuge für 15 s bei 8.000 x g.
8. Fügen Sie 100 l Waschpuffer 2 (WB2) auf die Membran des PCs und Zentrifuge für 1 min bei 8.000 x g.
9. Fügen Sie 100 l WB2 auf die Membran des PCs, Zentrifuge für 2 min bei 16.000 x g, sofort folgen durch Zentrifugation für 1 min bei 16.000 x g.
10. Übertragen Sie den PC in ein neues 0,5 ml Rohr.
11. Fügen Sie 12 L Elution Buffer (EB) auf die Membran und inkubieren für 7 min bei Raumtemperatur. Somit beträgt das Endvolumen aller gepoolten sezierten Gewebeproben 12 L pro Teilsegment.
12. Zentrifugieren Sie die Proben für 1 min bei 1.000 x g und dann für 2 min bei 16.000 x g.
13. Übertragen Sie 2 l in ein frisches Rohr für die Bioanalyzer-Analyse (um Frost-Tau-Ereignisse zu verhindern).
14. Alle Rohre in -80 °C lagern, bis sie zur Weiterverarbeitung bereit sind.

4. RNA-Sequenzierung

1. Bewerten Sie jede Probe, die für die Sequenzierung bestimmt ist, auf Qualität mit einem kommerziellen Bioanalyzer und einem Chip, der der Messung kleiner RNA-Mengen gewidmet ist.
2. Folgende Qualitätskontrolle (QC) Parameter vor der Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung sind erforderlich: RNA-Menge größer als 4 ng für Bulk und größer als 0,5 – 1 ng für jedes Teilsegment; Der Prozentsatz der Transkripte, die länger als 200 Nukleotide (DV200) sind, muss für LMD-Proben mehr als 25 % betragen (optimal > 75%).
3. Durchführung der Bibliotheksvorbereitung mit einem kommerziellen cDNA-Bibliotheksvorbereitungskit, das für kleine Mengen degradierter RNA bestimmt ist. Für das kommerzielle Kit in der Ergänzung aufgeführt, Wir empfehlen, Option 2, die eine minimale DV200 von 25% und keine Fragmentierung erfordert. Einige Sequenzierungstechnologien erfordern möglicherweise höhere MINDEST-DV200-Schwellenwerte, z. B. 30 %⁷.
4. Fügen Sie cDNA-Adapter und Indizes hinzu.
5. Reinigen Sie die RNAseq-Bibliotheken mit magnetisch-perlen-Technologie.
6. Erpleft die ribosomale cDNA mit einem kommerziellen rRNA-Entfernungskit vor dem RnAseq-Bibliotheksamplifikationsschritt.
7. Reinigen Sie die endgültige RNAseq-Bibliothek mit magnetischer Perlentechnologie bei einer CDNA-Bibliothekskonzentration von 2 ng/L.
8. Führen Sie die RNA-Sequenzierung von 75 bp gepaartem Ende auf einem kommerziellen Sequenzierungssystem mit 30 Millionen Lese-/Proben für Bulk und 100 Millionen Lese-/Proben für teilsegmentale Abschnitte durch.
9. Verwenden Sie bei jedem Sequenzierungslauf eine Referenz-RNA (25 g), um die Steuerung des Batch-Effekts zu ermöglichen. Die Anfangskonzentration unserer Referenz-RNA beträgt 1 g/l, während die bei der Sequenzierung verwendete Endkonzentration 25 ng/l beträgt. Führen Sie die Referenz-RNA während der Bibliotheksvorbereitung als separate Probe aus und laufen Sie jeweils mit allen LMD-Proben.
10. Führen Sie datenanalysen unter Verwendung der FastQC-Anwendung durch, um die Qualität der Sequenzierung, intergene und mitochondriale Lesevorgänge zu bewerten und Lesevorgänge zu bestimmen, die einem Gen zugeschrieben werden.
11. Verwenden Sie Integrative Genomics Viewer (IGV) für Ausrichtung und edgeR/rbamtools für Transkriptexpressionsmessungen.
12. Entfernen Sie Proben mit weniger als 100.000 Lesevorgängen. Quantile normalisieren die Rohlesevorgänge im Datensatz, nachdem niedrig ausgedrückte Gene an einem benutzerdefinierten Schwellenwert herausgefiltert wurden.
13. Quantifizieren Sie den Ausdruck als Verhältnis des Teilsegments von Interesse zum Durchschnitt aller anderen Untersegmente und log2-transform. Die relative Expression desselben Gens kann über Untersegmente und Proben hinweg verglichen werden; Es ist jedoch nicht ideal, die relative Expression zwischen zwei verschiedenen Genen aufgrund möglicher Degradierungsunterschiede zwischen Genen und RNA-Arten zu vergleichen.
14. Führen Sie eine Anreicherungsanalyse durch, um die Genexpression für eine Reihe von Herstellern zu vergleichen, die für jedes Nephron-Untersegment spezifisch sind, während Referenz-RNA-Proben über Chargen hinweg verglichen werden. Ein Batcheffekt innerhalb von 1 Standardabweichung des mittelwertigen Ausdrucks mit R-Wert > 0,9 gilt als akzeptabel. Für eine höhere Batch-Effekt-Punktzahl ist eine zusätzliche Normalisierung erforderlich. Jede Ausführung, die vom akzeptierten Batcheffekt abweicht, kann gekennzeichnet werden. Der Q30 sollte für jeden Sequenzierungslauf größer als >90 % sein.

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Ergebnisse

Proben

Wir präsentieren Daten von neun Referenznephrektomien (3 Proben, die an der Indiana University gewonnen wurden, und 6 Proben, die durch das Kidney Precision Medicine Project gewonnen wurden), wobei das schnelle Fluoreszenz-Färbeprotokoll verwendet wird, um Nierennephronsegmente und interstitielle Bereiche zu isolieren. Die in diesem Prozess verwendeten Abschnitte wurden von verstorbenen Nierenspendern oder nicht betroffenen Tumornephrectomien gewonnen. Diese Proben ha...

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Diskussion

LMD-basierte Transkriptomik ist eine nützliche Technologie, die die Genexpression an bestimmten Bereichen im Gewebe verankert. Die Basis dieser Technologie und ihre mögliche Anwendung in der Niere wurde zuvor beschrieben⁸. Die Optimierung, Modernisierung und Rationalisierung der fluoreszenzbasierten Dissektion, die speziell auf eine hochpräzise Sesektion für die nachgeschaltete RNA-Sequenzierung ausgerichtet ist, ist jedoch weniger allgegenwärtig. Da diese Methode räumlich im Gewebe begründ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	270725-1L
AMPure Beads	Beckman Coulter	A63880
Bioanalyzer	Agilent	2100
BSA	VWR	0332-100G
DAPI	ThermoFisher	62248
Desiccant Cartridge	Bel-Art	F42046-0000
DNAse	Qiagen	79254	RDD buffer is included in the pakage
Laser Microdissection Microscope	Leica	LMD6500
Megalin/LRP2 Antibody	Abcam	ab76969	Directly conjugated to Alexa Fluor 568
Microcentrifuge tubes	ThermoFisher	AB-0350
Microscope camera	Leica	DFC700T
PBS (RNAse Free)	VWR	K812-500ML
Phalloidin (Oregon Green 488)	ThermoFisher	O7466
PicoPure RNA Isolation Kit	Applied Biosystems	KIT0204
PPS-membrane slides	Leica	11505268
qPCR Human Reference Total RNA 25 µg	Takara Clontech	636690
RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip	Agilent	5067-1513
RNAse Away	ThermoFisher	7000
RNAse Inhibitor	ThermoFisher	AM2696
Sequencer (HiSeq or NovaSeq)	Illumina	NA
SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2	Takara Clontech	634411
Tamm-Horsfall Protein Antibody	R&D Systems	AF5144	Directly conjugated to Alexa Fluor 546
Tissue-Tek® O.C.T. Compound	Sakura	4583