JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نقدم طريقة لتسجيل الاستجابات الكهربائية التي تثير الضوء من ظهارة صبغ الشبكية (RPE) في الفئران باستخدام تقنية تعرف باسم DC-ERGs التي وصفها لأول مرة مارمورشتاين، بيتشي، وزملاؤه في أوائل العقد الأول من القرن الحادي والعشرين.

Abstract

ظهارة صبغة الشبكية (RPE) هي أحادية متخصصة من الخلايا التي تقع بشكل استراتيجي بين الشبكية و choriocapillaris التي تحافظ على الصحة العامة والسلامة الهيكلية للمقبرات الضوئية. وRPE هو الاستقطاب، وعرض مستقبلات أو قنوات apically وبسيقل، ويؤدي النقل المتجه من المياه، الأيونات، المستقلبات، ويفرز العديد من السيتوكينات.

في القياسات غير الباضعة الدالة RPE يمكن إجراء باستخدام ERGs مباشرة مقرونة (DC-ERGs). كانت المنهجية وراء DC-ERG رائدة من قبل مارمورشتاين ، بيتشي ، وزملاؤه باستخدام نظام تسجيل التحفيز المصنوع خصيصًا ، وأظهر لاحقًا باستخدام نظام متاح تجاريًا. تستخدم تقنية DC-ERG الشعيرات الدموية الزجاجية المليئة بمحلول الملح المخزن (HBSS) من هانك لقياس الاستجابات الكهربائية الأبطأ لـ RPE التي تم الحصول عليها من تغيرات التركيز التي تثيرها الضوء في الفضاء دون الجانتري بسبب نشاط المستقبلات الضوئية. إن التحفيز الضوئي المطول وطول تسجيل DC-ERG يجعلانها عرضة للانجراف والضوضاء مما يؤدي إلى انخفاض العائد من التسجيلات القابلة للاستخدام. هنا، نقدم طريقة سريعة وموثوق بها لتحسين استقرار التسجيلات مع تقليل الضوضاء باستخدام ضغط الفراغ لتقليل / القضاء على الفقاعات الناتجة عن الـ هبلسزز و حامل القطب. بالإضافة إلى ذلك، يتم تخفيف التحف خط الطاقة باستخدام منظم الجهد / مكيف الطاقة. نحن نشمل بروتوكولات تحفيز الضوء اللازمة لنظام ERG المتاحة تجاريا، فضلا عن النصوص لتحليل مكونات DC-ERG: c-موجة، التذبذب السريع، ذروة الضوء، والاستجابة قبالة. نظراً لسهولة التسجيلات المحسنة وسير العمل السريع للتحليل، فإن هذا البروتوكول المبسط مفيد بشكل خاص في قياس التغيرات المرتبطة بالعمر في وظيفة RPE، وتطور المرض، وفي تقييم التدخل الدوائي.

Introduction

ظهارة صبغة الشبكية (RPE) هي طبقة أحادية من الخلايا المتخصصة التي تصطف في الجزء الخلفي من العين وتمارس وظائف حاسمة للحفاظ على التوازن الشبكية1. RPE يدعم فوتوراسيدات من خلال تجديد الصباغ البصري التقاط الفوتون في عملية تسمى الدورة البصرية2, من خلال المشاركة في البلعومات النهارية من سقيفة الجزء الخارجي نصائح3, وفي نقل المواد الغذائية والمنتجات الأيضية بين مستقبلات فوتونية و choriocapillaris4,5. تشوهات في وظيفة RPE يكمن وراء العديد من أمراض الشبكية البشرية, مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر6,اعورة لوبير الخلقية7,8 وأفضل ضمور البقعي البقعي vitelliform9. كما أنسجة العين المانحة غالبا ما يصعب الحصول عليها فقط لأغراض البحث, نماذج الحيوانات مع التعديلات الجينية يمكن أن توفر طريقة بديلة لدراسة تطور أمراض الشبكية10,11. بالإضافة إلى ذلك ، فإن ظهور وتطبيق تكنولوجيا CRISPR cas9 يسمح الآن مقدمات الجينوم (الضربة القاضية) أو الحذف (خروج المغلوب) في عملية بسيطة من خطوة واحدة تتجاوز قيود تقنيات استهداف الجينات السابقة12. الطفرة في توافر نماذج جديدة ماوس13 يتطلب بروتوكول تسجيل أكثر كفاءة لوظيفة RPE غير غير الغازية.

ويمكن قياس الاستجابات الكهربائية التي تثير الضوء من RPE يمكن أن يتحقق باستخدام تقنية تخطيط كهربائي مقرونة مباشرة (DC-ERG). عند استخدامها في تركيبة مع تسجيلات ERG التقليدية التي تقيس مستقبلات ضوئية (a-wave) و ثنائي القطب (b-wave) استجابات الخلية14، يمكن لـ DC-ERG تحديد كيفية تغيير خصائص الاستجابة لـ RPE مع انحطاط الشبكية15،16،17 أو ما إذا كان الخلل RPE يسبق فقدان الحساسية الضوئية. يصف هذا البروتوكول طريقة مقتبسة من عمل مارمورشتاين، بيتشي، والزملاء الذين طوروا أولا تقنية DC-ERG16،18،19،20 ويحسن على إعادة إنتاج وسهولة الاستخدام.

يصعب تنفيذ تسجيل DC-ERG بسبب وقت الاكتساب الطويل (9 دقائق) الذي يمكن أن يؤدي أي انقطاع أو إدخال للضوضاء إلى تعقيد تفسير البيانات. وميزة هذه الطريقة الجديدة هي أن خطوط الأساس تصل إلى حالة ثابتة في غضون فترة أقصر من الزمن مما يقلل من احتمال أن يستيقظ الحيوان قبل الأوان من التخدير وأقل عرضة لتشكيل الفقاعة في الأقطاب الشعرية.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول إرشادات رعاية الحيوانات الموضحة في بروتوكول دراسة الحيوانات الذي وافقت عليه لجنة رعاية الحيوان واستخدامه في المعهد الوطني للعيون.

1. استيراد بروتوكولات التحفيز الضوئي لDC-ERG

ملاحظة: اتبع الإرشادات أدناه لاستيراد بروتوكولات تحفيز الضوء لـ DC-ERG في برنامج نظام ERG(جدول المواد). البروتوكول يتكون من 0.5 دقيقة قبل التحفيز الفاصل الزمني، تليها خطوة من الضوء (10 cd/m2)لمدة 7 دقائق، وتنتهي مع 1.5 دقيقة فترة ما بعد التحفيز. تم اختيار شدة الضوء من 10 cd/m2 (1 log10 cd/m2) لأنه يثير ما يقرب من نصف الاستجابة القصوى لجميع مكونات DC-ERG في WT الفئران18,21. وموجة ج والتذبذب السريع ذات أهمية خاصة لأن أصول هذه الاستجابات الكهربائية تتميز بشكل جيد ويمكن عزلها ودراستها بشكل أكبر في نماذج RPE المختبرية (مثل iPSC-RPE). تطبيق من أخرى ضوء شدة يستطيع استخرجت معلومة إضافيّة, مثلا, الإستجابة منيّ يمرّ عكس من قطبيّة في أكثر إشراقا ضوء محفزات ويمكن يبدي فروق في الشدة في أيّ هذا عكس يتمّ. المستخدم هو حر في تغيير إعدادات شدة الضوء في تقديرهم.

  1. افتح برنامج نظام ERG.
  2. انقر على مركز قاعدة البيانات.
  3. انقر على جديد (توفير اسم ملف قاعدة بيانات جديدة). انقر على حفظ. سيتم عرض مربع المنبثقة: "قاعدة بيانات تم إنشاؤها، هل تريد الاتصال بملف قاعدة البيانات الجديد." انقر على نعم. يجب أن يعكس اسم قاعدة البيانات الحالي اسم الملف الجديد.
  4. انقر على نقل في في قاعدة بيانات مركز التحكم النافذة.
  5. حدد الملف التكميلي 1: LightProtocols - TRANSFER. EXP. انقر على فتح.
  6. انقر على إغلاق (مركز التحكم في قاعدة البيانات) عند الانتهاء من شريط التقدم.
  7. انقر على زر "ابدأ" الأخضر.
  8. انقر على جديد على نافذة تحديد المريض. إنشاء اسم عائلة مريض جديد يصف نموذج الماوس، أدخل تاريخ الميلاد (DOB، mm/dd/yyyy)، قم بتبديل الزر gender (M/F) إلى الوصف المناسب. انقر على إغلاق لحفظ التفاصيل التجريبية.
  9. انقر على البروتوكولات. يجب أن يكون بروتوكولا ERG و DC-ERG المتكيفين مع الظلام مرئيين الآن.
  10. وأخيراً، ضع ملف Flash.col طويل في المجلد التالي C:\ERG ملفات المستخدم\Long Flash.col.

2. إعداد القطب الشعري

  1. قطع الشعيرات الدموية الزجاجية 1.5 ملم في النصف باستخدام بلاط السيراميك(جدول المواد)لتسجيل الزجاج وكسر لهم نظيفة باستخدام طاولة لتوفير القوة المضادة المادية وتثبيت الزجاج.
    ملاحظة: ينتهى القطع حسب الضرورة.
  2. باستخدام بونسن الموقد(جدول المواد)تسمح للحرارة لجعل منعطف صغير في شعرية في حين عقد على اللهب مع ملقط.

3. تعبئة أقطاب الشعيرات الدموية

  1. قم بتوصيل جهاز الاحتكاك الفراغي بخط فراغ المختبر من خلال فلتر داخل الخط (جدول المواد).
  2. صب 30 مل من الحل الملح المتوازن هانكس (HBSS) (جدول المواد) في مفتوحة 50 مل أنبوب مخروطي ووضعها (مع غطاء إزالتها) في غرفة فراغ.
  3. بدوره على فراغ و degas HBSS أثناء تشغيل الكمبيوتر ومعدات التسجيل.
  4. بعد 5\u201210 دقيقة إيقاف تشغيل الفراغ واستخدام HBSS degassed لملء حقنة 12 مل من خلال إبرة 25 G المرفقة. استخدامه لملء قواعد أصحاب القطب الكهربائي اتخاذ احتياطات إضافية لعدم إدخال فقاعات.
    1. للقيام بذلك، وإزالة غطاء المسمار مترابطة وشريحة بعناية إبرة حقنة من خلال طوقا المطاط السيليكون للوصول إلى الجدار الخلفي (الفضة / الفضة كلوريد بيليه) من حامل.
      ملاحظة: الكريات كلوريد الفضة /الفضة هي مفيدة على أصحاب التي تستخدم الأسلاك الفضية لأنها توفر مساحة أكثر سطح مما أدى إلى خط أساس منخفض الضوضاء مستقرة. ومع ذلك، فضي / الفضة كلوريد الكريات تتطلب واجهة سائلة خالية من فقاعات الهواء لتحقيق اتصال جيد. ولذلك، تأخذ عناية كبيرة لعدم إدخال فقاعات الهواء خلال هذه العملية.
    2. حقن تدريجيا HBSS لملء كامل microelectrode في حين تراجع ببطء إبرة الحقنة. إعادة إرفاق الغطاء مترابطة ولكن لا تشديد. أعد إدخال إبرة الحقنة لملء المساحة الفارغة داخل الغطاء مع HBSS. ثم ملء الشعيرات الدموية الزجاجية في حين عقد أفقي لمنع الحل من الهروب من الطرف الآخر.
    3. عقد الشعرية الزجاجية من نهاية عازمة وإدراج ببطء الطرف المعاكس من خلال الغطاء خففت ثم تشديد الغطاء المسمار في مكانه.
      ملاحظة: تحافظ الأقطاب الكهربائية الزجاجية المملوءة بـ HBSS على تزييت عين الماوس وتمنع جفاف القرنية الذي سيحدث مع استخدام أقطاب حلقة ذهبية قياسية.
  5. ضع أصحاب القطب الكهربائي مع أقطاب الشعيرات الشعرية مائلة إلى الأعلى للسماح للفقاعات بالتدفق. تشغيل فراغ لمدة 5\u201210 دقيقة إلى ديغا. الغاز الهروب من الزجاج والأسطح البلاستيكية سوف تدفع HBSS من أصحاب القطب.
  6. توقف ثم قم بتحرير الفراغ ببطء. إعادة ملء أصحاب القطب الكهربائي والشعيرات الدموية الزجاجية كما هو موضح سابقا.
    ملاحظة: فقاعات تميل إلى جمع على أو بالقرب من طوقا المطاط السيليكون ويمكن أيضا الاختباء في الأخا الأخاطي من الغطاء مترابطة، لذلك يجب إيلاء اهتمام خاص للحفاظ على هذه المناطق خالية من فقاعة.
  7. تثبيت وتأمين حامل microelectrode في العرف الصنع T-كليب / موقف مشترك الكرة المغناطيسية(الشكل 1A، inset). لجعل موقف مخصص لحامل microelectrode، تعديل T-كليب (5/16"-11/32" OD الأنابيب) #8 (جدول المواد)عن طريق إزالة مقاطع متعددة الخصية السوداء على جانب واحد. يكون قاعدة اسطوانة من المفاصل الكرة المغناطيسية تشكيلها في نصف لضبط ارتفاع (جدول المواد). تأمين تعديل T-مقاطع إلى الكرة المغناطيسية تصاعد مسامير مع المكسرات M3 الحجم.
  8. ضع حامل microelectrode في مقطع T المعدلة وعقد بإحكام في مكان عن طريق الانزلاق في ما يقرب من مقبض خشبي مدبب 1 بوصة مصنوعة من كسر القطن يميل عصا التنظيف(جدول المواد)في زاوية. استخدم قاعدة أسطوانة مغناطيس الأرض النادرة لوضع حامل القطب المخصص بشكل آمن على اللوحة المعدنية للمرحلة مما يتيح دوران 360 درجة على محور 180 درجة.

4. اختبار الأقطاب الكهربائية

  1. صب HBSS في حاوية صغيرة (على سبيل المثال، غطاء أنبوب مخروطي 50 مل).
  2. خفض بلطف تجميعها بالكامل، HBSS مليئة الشعيرية microelectrodes في الغطاء الذي يحتوي على HBSS لتكليل ما قبل الأقطاب الكهربائية ووضع القطب الأرض إبرة (الذيل / الساق الخلفية) و Ag/AgCl مُتبدّل بيليه المرجعية القطب (الفم) في نفس HBSS لإكمال الدائرة (الشكل 1A).
    ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات اللاحقة ضمن الضوء الأحمر خافت. استخدم مصباحاً ضوئياً أحمر الضوء لوضع الماوس والأقطاب الشعرية. تذكر أن تطفئ جميع مصادر الضوء تمامًا قبل بدء التسجيل.
  3. حدد أو إنشاء معرف مناسب (اسم العائلة) لوصف الماوس الذي سيتم اختباره وحدد بروتوكول DC-ERG الذي سيتم تنفيذه عن طريق إكمال التسجيل وفقًا للأمر التالي.
    1. انقر على البروتوكولات. حدد DC-ERG. انقر على تشغيل. مربع حوار سوف المنبثقة: "المريض الحالي هو XXX [DOB: XX/XX/XX) هل هذا صحيح للاختبار الذي يجري تنفيذه؟" انقر على نعم. ثم انتقل إلى "الخطوة 1/6".
  4. أغلق الأبواب أمام قفص فاراداي
  5. عرض وضع المعاوقة عن طريق النقر على المعاوقة والتحقق من أن القيم للمرجع الفم، الأرض الذيل، وتسجيل الأقطاب مقبولة (انظر الشكل 1B).
  6. اختبار الاستقرار خط الأساس (الضوضاء والانجراف) عن طريق النقر على الخطوة (السهم إلى الأمام) لتحديد الخطوة 4/6 "فلاش طويل لا ضوء".
    ملاحظة: كمية الانجراف التي لوحظت عند وضع الأقطاب الكهربائية في حمام HBSS عادة أقل من 500 ميكروفولت لكل 80 s بمجرد استقرارها وهي تعادل الانجراف الذي لوحظ عند توصيل الأقطاب بالماوس. وهكذا، فإن القراءة الكهربائية للأقطاب الكهربائية في حمام HBSS هي مؤشر مهم لحالة الأقطاب الكهربائية. الضوضاء، تقاس بأنها الذروة إلى الذروة، عموما ~ 10\u201215٪ أكبر في الماوس مما كانت عليه في الحمام HBSS. هذا هو على الارجح بسبب إضافة التحف الحركة من التنفس.
  7. ابدأ في عرض الآثار بالنقر على معاينة. يجب أن تكون الآثار منخفضة الضوضاء مع ذروة إلى الذروة السعة <200 μV. والانجراف الطفيف (<500 ميكروفولت/80ثان) الذي يتلاشى تدريجياً إلى خط الأساس مقبول(الشكل 1C).

5. الماوس والالكترود تحديد المواقع

  1. الحفاظ على الفئران بين عشية وضحاها في مربع الضوء ضيق التهوية بشكل جيد للتكيف الظلام.
  2. تخدير الحيوانات عن طريق الحقن داخل الصفتون من الكيتامين (80 ملغ / كجم) والزيلازين (8 ملغ / كجم).
  3. تطبيق انخفاض 0.5٪ بروباراكايان HCl موضعيا لتخدير القرنية وكذلك انخفاض 2.5٪ فينيليفرين HCl و 0.5٪ tropicamide لتمدد التلاميذ.
  4. تقليم شعيرات الماوس مع مقص لمنع ارتعاش غير مقصود من إزعاج أقطاب الشعيرات الدموية الزجاجية أثناء التسجيل.
    ملاحظة: بروتوكول التحفيز DC-ERG داخل نظام ERG لديه العديد من إجراءات التحفيز المضمنة التي يمكن تحديدها بالنقر فوق الخطوة (السهم إلى الأمام) أو الخطوة (سهم إلى الخلف). الخطوات 1 و4 و5 فقط في البرنامج مطلوبة لإعداد وتنفيذ تسجيل DC-ERG.
  5. في برنامج نظام ERG تحقق من تحديد المريض الصحيح. انقر على زر البروتوكولات الخضراء. ضمن وصف بروتوكول حدد DC-ERG. ثم انقر على تشغيل. تحقق من أن هذا هو الاختبار الصحيح الذي يتم تنفيذه بالنقر فوق نعم.
  6. استخدم الخطوة 1/6 المعينة الضوء الأحمر التحفيز لتشغيل الضوء الأحمر داخل القبة للمساعدة في وضع الماوس والأقطاب الكهربائية مع مراقبة التغيرات في مقاومة.
  7. ضع الماوس على طاولة تسجيل ساخنة وخيمة بعناية جلد الساق الخلفية باستخدام ملقط. عقد القطب الإبرة بقوة في يد واحدة وإدراجها تحت الجلد في الساق الخلفية لتأمينه في مكانه.
  8. وضع المرجع Ag / AgCl القطب(جدول المواد) داخل الفم بحيث بيليه مُتَلَدَّد تقع على طول الخد الخلفي ويُحتجز في مكانه خلف الأسنان.
    ملاحظة: لا ينبغي استخدام أقطاب أسلاك الذهب كأقطاب كهربائية مرجعية في الفم حيث أن لها خصائص مقاومة مختلفة وتزيد من الضوضاء من الذروة إلى الذروة.
  9. قبل وضع الأقطاب الشعرية إلى عين الماوس ، عقد حامل القطب مع الشعيرات الدموية الزجاجية عمودي ، نفض الغبار حامل القطب مع السبابة لإزالة أي فقاعات التي قد تم إدخالها. املأ النصيحة بـ HBSS باستخدام إبرة 25 G متصلة بحقنة وافحصها للتأكد من عدم وجود فقاعة هوائية محاصرة في الطرف. ضع حامل القطب الكهربائي بحيث يكون الطرف المفتوح من الشعيرات الدموية المملوءة بـ HBSS على اتصال لطيف مع القرنية.
  10. استخدام احتياطات خاصة لتجنب إدخال فقاعات الهواء عن طريق عقد مواد موزع هلام العين المقلوبة ومواد التشحيم والتخلص من قطرات الأولية. ضع قطرة من جل العين المُشحن على كل عين للحفاظ على الموصلية ومنع الجفاف أثناء التسجيل.

6. DC-ERG تسجيل

  1. انقر على الخطوة (السهم إلى الأمام) لتحديد الخطوة 4/6 "فلاش طويل لا لى".
  2. انقر على المعاوقة. استخدم شاشة التحقق من المعاوقة لفحص مقاومة العينين اليمنى واليسرى. ومن المتوقع أن تكون قيم المعاوقة لتسجيل الأقطاب الكهربائية في كل عين متشابهة (~ 39 كيلو أوم). ومن المتوقع أن تكون قيم المعاوقة لكل من الأقطاب الأرضية والكهربية المرجعية أقل من 10 كيلو أوم).
  3. انقر على معاينة لعرض آثار للعين اليسرى واليسرى. انتظر حتى يتم تحقيق خط أساس ثابت (<10 دقيقة). انقر على إيقاف للخروج من معاينة التتبع.
    ملاحظة: لن تتحسن التغيرات المفاجئة في اتجاه الانجراف أو الضوضاء الشاذة في التسجيل مع مرور الوقت وسوف تتطلب تحديد القطب الشعري الذي يتطلب الانتباه. السبب الأكثر احتمالا هو فقاعة أدخلت إلى غيض من القطب. أعد ملء الطرف مع HBSS. انقر فوق معاينة مرة أخرى للتحقق من الأساس.
  4. انقر على الخطوة (السهم إلى الأمام) لتحديد الخطوة 5/6 "فلاش طويل 10 مؤتمر نزع السلاح 7 دقيقة".
  5. انقر فوق تشغيل لبدء التسجيل (الشكل 1D).

7- تصدير البيانات

  1. حدد "المريض" (اسم العائلة) الذي يصف تسجيل الماوس ليتم تصديره.
  2. انقر على الاختبارات القديمة.
  3. ضمن وصف البروتوكول حدد DC-ERG. انقر على زر التحميل الأخضر لتحميل البيانات التي تم الحصول عليها من قبل.
  4. انقر على الخطوة (السهم إلى الأمام) للتقدم إلى الخطوة 5/6 "فلاش طويل 10 مؤتمر نزع السلاح 7 دقيقة".
  5. انقر على تصدير.
  6. توفير اسم الملف (مثل اسم الملف.csv). يجب أن يبدأ اسم ملف صالح بحرف متبوعاً بأحرف أو أرقام أو تسطيرات أسفل السطر. لا تستخدم الأحرف الخاصة أو الواصلات. يتطلب برنامج تحليل البيانات (DCERG_Analysis.exe) أن تفي إدخالات الجدول بمتطلبات أسماء المتغيرات.
  7. ضع علامة اختيار بجوار جدول البيانات. بجوار الفاصل، حدد علامة التبويب. ضع علامات الاختيار بجوار الخيارات (العناوين، عمودية)، وتشمل الكل (الخطوات، تشانس، النتائج) ، أعمدة البيانات (المحتويات، النتائج، الكنسات) ، والتنسيق (ملف).
  8. ثم انقر على تصدير (الشكل 1E). يؤدي ذلك إلى حفظ الملف *.csv إلى المجلد C:\Multifocal.

8 - تحليل البيانات

  1. تحميل وتثبيت المثبت وقت التشغيل المناسب (جدول المواد)
  2. قم بتنزيل مثبت DCERG_Analysis.exe وتثبيته.
    ملاحظة: هذا بتثبيت البرنامج النصي الذي سيقوم بتحليل مكونات DC-ERG ثم إنشاء اختصار لتشغيل البرنامج في مجلد قائمة ابدأ.
  3. انقر على الاختصار الذي تم إنشاؤه في القائمة ابدأ > مجلد البرامج.
  4. حدد ملف البيانات أو الملفات التي تم تصديرها (*.csv) للتحليل. استخدام Ctrl + اليسار انقر على الماوس لتحديد أكثر من ملف واحد.
    ملاحظة: الملف القابل للتنفيذ يولد نوعين من المؤامرات: 1) يتم رسم البيانات الخام مع خط تناسب أفضل تشير إلى الانجراف قياس; 2) يتم رسم استجابة الانجراف تصحيح بعد أن تم smoothed مع المتوسط المتحرك (مع امتداد ~ 5 s). من هذه المؤامرة يتم تحديد السعات والوقت إلى الذروة من مكونات DC-ERG: c-wave، التذبذب السريع، ذروة الضوء، والاستجابة قبالة. ثم يتم تصدير البيانات في تنسيق الجدول إلى excel حيث كل ورقة يتوافق مع تسجيل ماوس مختلفة. ويلي هذه الأوراق صحائف موجزة: '1' السعات المجمعة من DC-ERG (mV)؛ و'2' سعة النطاقات التي تم تجميعها في وحدة الـ 1000 وحدة تحكم في الأراضي(10). '2' مجمعة من وقت إلى ذروة DC-ERG (بداية الضوء، t = 0 دقيقة).

النتائج

الشكل 2 هو عينة من مجموعة البيانات من miR-204 ko/ko cre/+ (KO الشرطي) وفئران النوع البري (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ هي فئران مع خروج المغلوب المشروط من ميكرورنا 204 في ظهارة صبغة الشبكية. يتم إنشاء هذه الفئران عن طريق عبور الفئران miR-204 مفلوكس (التي تنتجها NEIGEF)22 مع VMD2-CRE الفئران2...

Discussion

الخطوات الهامة

يتطلب تسجيل DC-ERG الجيد أقطابًا كهربائية مستقرة خالية من الفقاعات التي تخلق القطع الأثرية والانجراف غير المرغوب فيه لأنها حساسة للغاية للتغيرات في درجة الحرارة والخروج. من الضروري أن يتم تحقيق خط أساس مستقر عندما يتم وضع الأقطاب الكهربائية في محلول ?...

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل صناديق داخل الثقافات. الكتاب نعترف بصدق الدكتور شيلدون ميلر لتوجيهه العلمي ، والمشورة التقنية ، والخبرة في علم وظائف الأعضاء RPE والمرض. يشكر المؤلفان ميغان كوبرا وموظفي رعاية الحيوانات على إدارة مستعمرات الماوس، والدكتور تارون بانسال وريموند تشو ويوان وانغ على الدعم الفني.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ag/AgCl (mouth) ElectrodeWPI IncEP1Mouth reference electrode for mouse
Ceramic TileSutter InstrumentCTSUsed to cut the glass capillary tube to an appropriate size
Cotton Tipped Cleaning StickPuritan Medical Products867-WC No GlueTo be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly
Electroretinogram (ERG) SystemDiagnosys LLCE3 SystemVisual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials
Bunsen BurnerArgos TechnologiesBW20002460Or equivlaent to shape glass under flame
Glass Capillary Tube (1.5 mm)Sutter InstrumentsBF150-75For filling with HBSS and making contact to the cornea
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS)Thermo Fisher Scientific Inc14175-095Commercially available. Maintain at RT
In-Line FilterWhatman6722-5001To protect vacuum pump from aerosols
Low Noise Cable for Microelectrode HoldersWPI Inc5372Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies
Magnetic Ball JointWPI Inc500871For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage
MatLabMathworksMatLab: For editing the analysis software
MatLab Curvefit ToolboxMathworksToolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)
MatLab CompilerMathworksToolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)
MatLab Runtime version 9.5MathworksR2018b (9.5)Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Microelectrode Holders (45 degrees)WPI IncMEH345-15For holding the capillaries
Needle (25 ga)Covidien8881250313For filling the capillary tubes with HBSS
Needle (ground) ElectrodeRhythmlink13mm - one elctrodeSubdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)
Regulator/Power ConditionerFurmanP-1800Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line
Syringe (12 mL)Monoject1181200777For filling the capillary tubes with HBSS
T-clipCole-Parmer06852-20For electrode holder assembly
Vacuum DesiccatorBel-Art420120000Clear polycarbonate bottom & cover
Pharmacological treatment
Lubricant eye gelAlcon0078-0429-47Helps lubricate corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes
Phenylephrine Hydrochloride 2.5%Akorn17478-201-15Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Proparacaine Hydrochloride 0.5%Akorn17478-263-12Local anesthetic for ophthalmic instillation
Tropicamide 0.5%Akorn17478-101-12Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
XylazineAnaSedsc-362949RxAnalgesic and muscle relaxant
Zetamine (Ketamine HCl)VetOne501072Anesthetic for intramuscular injections

References

  1. Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
  2. Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
  3. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
  4. Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).
  5. Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).
  6. Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).
  7. Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).
  8. Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis. Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).
  9. Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
  10. Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
  11. Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9 (4), (2020).
  12. Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
  13. Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).
  14. Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7 (7), (2017).
  15. Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).
  16. Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).
  17. Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).
  18. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).
  19. Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).
  20. Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
  21. Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).
  22. Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).
  23. Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).
  24. Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).
  25. He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).
  26. Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).
  27. Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).
  28. Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance". Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).
  29. Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).
  30. Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

161 DC ERG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved