直接耦合电雷电图（DC-ERG），用于记录小鼠视网膜颜料皮皮的光唤起电响应

摘要

在这里，我们提出了一种方法，使用马莫斯坦、佩奇和同事在21世纪早期首次描述的一种称为DC-ERG的技术，记录小鼠视网膜色素上皮（RPE）的光唤起电反应。

摘要

视网膜色素上皮 （RPE） 是位于视网膜和胆光分离之间的特殊单层细胞，可保持光受体的整体健康和结构完整性。RPE 是极化的，表现在基础和基础位置的受体或通道，并执行水、离子、代谢物和分泌多个细胞因子的矢量传输。

可以使用直接耦合ERG（DC-ERG）对RPE函数进行体内非侵入性测量。DC-ERG 背后的方法由 Marmorstein、Peachey 和同事率先使用定制的刺激记录系统，后来演示了使用市售系统。DC-ERG 技术使用充满 Hank 缓冲盐溶液 （HBSS） 的玻璃毛细管来测量由于光受体活动而导致的光线激发浓度变化导致的 RPE 的较慢电响应。DC-ERG 记录的长期光线刺激和长度使其易受漂移和噪音的影响，导致可用录像的收率低。在这里，我们提出了一种快速、可靠的方法，通过利用真空压力减少/消除 HBSS 和电极支架的加气产生的气泡，从而提高录像的稳定性，同时降低噪音。此外，使用压量器/电源调节器衰减电源线伪影。我们包括商用ERG系统的必要光刺激协议，以及用于分析DC-ERG组件的脚本:c波、快速振荡、光峰值和非响应。由于改进了易录音和快速分析工作流程，这种简化的协议在测量RPE功能、疾病进展和药理干预评估中与年龄相关的变化特别有用。

引言

视网膜色素上皮（RPE）是一个专用细胞的单层，它与眼睛的后段一起，发挥关键功能，维持视网膜平衡^1。RPE支持光感受器，在称为视觉周期²的过程中再生光子捕获视觉色素，参与棚外段^尖3的日生噬菌体，以及在光感受器和胆囊^4、5之间运输营养物质和代谢^产物。RPE功能异常是众多人类视网膜疾病的根据，如年龄相关的黄斑变性^6，勒伯的先天性阿龙病^7，8和最佳维泰利形成黄斑^{营养不良9。}由于供体眼组织往往很难仅仅用于研究目的，动物模型与基因修饰可以提供另一种方式来研究^{视网膜疾病的发展10，11。}此外，CRISPR cas9技术的出现和应用现在允许在一个简单的、单步的进程中引入基因组（敲击）或删除（敲出），超过先前基因靶向技术^{12的局限性}。新鼠标型号^{13 的可用性激增}，需要更高效的记录协议来非侵入式评估 RPE 功能。

使用直接耦合电雷电图 （DC-ERG） 技术可以测量 RPE 的光唤起电响应。当与测量光感受器（A 波）和双极（b 波）细胞反应¹⁴的传统ERG记录结合使用时，DC-ERG可以定义RPE的响应特性如何随着视网膜退化15、16、17的变化^而变化，或者RPE功能障碍是否先于光受体损失。该协议描述了一种改编自马莫尔斯坦、佩奇和同事的工作方法，他们首先开发了^{DC-ERG技术16、18、19、20，}并改进了可重复性和易用性。

DC-ERG 记录难以执行，因为采集时间长（9 分钟），在此期间，任何干扰或噪声引入都可能使数据解释复杂化。这种新方法的优点是基线在更短的时间内达到稳定状态，从而减少了动物过早从麻醉中醒来的可能性，并且不容易在毛细管电极中形成气泡。

研究方案

该协议遵循国家眼科研究所动物护理和使用委员会批准的动物研究协议中概述的动物护理指南。

1. 为DC-ERG导入光刺激协议

注:按照以下说明将 DC-ERG 的光刺激协议导入 ERG 系统软件（材料表）。该协议包括 0.5 分钟的预刺激间隔，然后是 7 分钟的光步（10 cd/m^2），最后为 1.5 分钟的刺激后间隔。选择光强为10 cd/m^2（1日志₁₀ cd/m^2），因为它唤起了WT小鼠^18，21中DC-ERG所有组件的最大响应^{量的大约一半}。c 波和快速振荡特别令人感兴趣，因为这些电响应的起源具有良好的特征性，可以在体外 RPE 模型（例如 iPSC-RPE）中进一步分离和研究。应用其他光强度可以提取额外的信息，例如，在更亮光刺激下，异常反应会发生极性反转，并且可能在此反转发生时显示差异。用户可以自行决定更改光强度设置。

1. 打开 ERG 系统软件。
2. 单击 数据库中心。
3. 单击" 新 "（提供新的数据库文件名）。单击"保存 "。弹出框将显示:"数据库已创建，是否要连接到新的数据库文件。单击 "是"。当前数据库名称现在应反映新的文件名。
4. 单击 数据库控制中心 窗口中的"传输"。
5. 选择补充文件 1:光协议 - 传输。EXP.单击"打开"。
6. 完成 进度条 后，单击"关闭"（数据库控制中心）。
7. 单击绿色"开始 " 按钮。
8. 单击" 选择 患者窗口 "上的"新"。创建描述鼠标模型的新患者姓氏，输入出生日期 （DOB， mm/dd/yyyy），将性别 （M/F） 按钮切换为相应的描述。单击" 关闭 "以保存实验详细信息。
9. 单击 协议。深色适应 ERG 和 DC-ERG 协议现在应该可见。
10. 最后，将长闪存.col 文件放入以下文件夹 C:\ERG 用户文件\Long Flash.col。

2. 毛细管电极制备

1. 使用瓷砖（材料表）将1.5毫米玻璃毛细管切成两半，对玻璃进行评分，并使用桌子将玻璃清洁地破碎，以提供物理反力并稳定玻璃。
   注:必要时模糊切割端。
2. 使用Bunsen燃烧器（材料表）允许热量在毛细管中弯曲，同时用钳子将火焰放在火焰上。

3. 填充毛细管电极

1. 通过内线过滤器（材料表）将真空干燥器连接到实验室的真空管路。
2. 将 30 mL 的汉克斯平衡盐溶液 （HBSS） （HBSS） 倒入 打开的 50 mL 锥形管中，然后将其（取下盖子）放入真空室中。
3. 打开吸尘器，在打开计算机和录音设备时，对 HBS 进行除气。
4. 5\u201210分钟后关闭真空吸尘器，使用脱气的HSS通过连接的25G针头填充12 mL注射器。使用它填充电极支架的底座，采取额外的预防措施，不引入气泡。
   1. 为此，拆下螺纹螺钉盖，小心地将注射器针滑过硅橡胶垫片，以到达支架的后壁（银/氯化银颗粒）。
      注:银/氯化银颗粒比使用银丝的颗粒具有优势，因为它们提供更多的表面积，从而形成稳定的低噪声基线。然而，银/氯化银颗粒需要一个无气泡的液体界面，才能实现良好的连接。因此，要非常小心，不要在这个过程中引入气泡。
   2. 逐渐注射HSSS以填充整个微电子，同时缓慢地收回注射器针头。重新连接螺纹盖，但请勿拧紧。重新插入注射器针头，用 HBSS 填充盖内的空间。然后将玻璃毛细管填充，同时水平握住它，以防止溶液从另一端逸出。
   3. 从弯曲端握住玻璃毛细管，通过松开的盖缓慢插入另一端，然后将螺钉盖拧紧到位。
      注:充满HSS的玻璃电极保持小鼠眼睛的润滑，并防止使用标准金环电极时可能发生角膜脱水。
5. 将毛细管电极向上倾斜的位置电极支架，以允许气泡流出。运行真空 5\u201210 分钟以脱气。气体从玻璃和塑料表面逸出，将 HBSS 从电极支架中推开。
6. 停止，然后慢慢释放真空。如前所述，重新填充电极支架和玻璃毛细管。
   注:气泡倾向于聚集在硅橡胶垫片上或附近，也可以隐藏在螺纹盖的凹槽中，因此必须特别注意保持这些区域无气泡。
7. 将微型电子支架安装并固定到定制的 T 形夹/磁球接头支架中（图 1A，内嵌）。要为微型电子支架制作定制支架，请通过移除一侧的黑色聚乙形夹来修改 T 形夹 （5/16"-11/32" OD#8）#8 （材料表）。将磁球接头的气缸底座加工为两半，以调整高度（材料表）。使用 M3 尺寸螺母将经过修改的 T 形夹固定到磁性球安装螺钉上。
8. 将微型电子支架放入经过修改的T形夹子中，并用一个角度打破棉尖清洁棒（材料表）制成的约1英寸锥形木柄，将它紧紧地握在位。使用稀土磁铁缸底座将定制的电极支架牢固地定位在舞台的金属板上，从而在 180° 轴上实现 360° 旋转。

4. 测试电极

1. 将 HBSS 倒入一个小容器中（例如，50 mL 锥形管的盖子）。
2. 轻轻降低完全组装的 HBS 填充毛细管微电极到包含 HBSS 的盖中，以预平衡电极，将针接地电极（尾/后腿）和 Ag/AgCl 烧结颗粒参考电极（嘴）放在同一 HBSS 中，以完成电路（图1A）。
   注:在昏暗的红灯下执行所有后续步骤。使用红灯手电筒定位鼠标和毛细管电极。请记住，在开始录制之前，请完全关闭所有光源。
3. 选择或创建适当的标识符（姓氏）来描述要测试的鼠标，然后选择要按照以下顺序完成注册以执行的 DC-ERG 协议。
   1. 单击 协议。选择 DC-ERG。单击"运行 "。将弹出一个对话框:"当前患者为 XXX [DOB: XX/XX/XX） 这是否对正在执行的测试正确？单击 "是"。然后继续执行"步骤 1/6"。
4. 关上法拉第笼子的门
5. 通过单击阻抗来 显示阻抗模式 ，并验证嘴参考、尾接地和记录电极的值是否可接受（参见 图 1B）。
6. 通过单击步进（前进箭头）选择步骤 4/6"长闪光灯无光"来测试基线稳定性（噪音和漂移）。
   注:当电极放置在HSSS浴池中时观察到的漂移量一般低于每80 s500μV，一旦稳定，相当于电极连接到鼠标时观察到的漂移量。因此，HBSS 浴池中电极的电气读出是电极状态的重要指标。在鼠标中，从峰值到峰值的噪声通常比在 HBSS 浴中高 ± 10\u201215%。这可能是由于从呼吸中增加了运动伪影。
7. 通过单击"预览"开始查看跟踪。跟踪应为低噪声，峰值振幅为 <200 μV。逐渐淡入基线的轻微漂移（<500 μV/80 s）是可以接受的（图1C）。

5. 鼠标和电极定位

1. 将小鼠放在通风良好的光密盒中过夜，进行深色适应。
2. 通过氯胺酮注射（80毫克/千克）和西拉辛（8毫克/千克）来麻醉动物。
3. 涂抹0.5%丙烷HCl局部麻醉角膜，以及降2.5%苯丙胺HCl和0.5%热带酰胺，以扩张瞳孔。
4. 用剪刀修剪鼠标胡须，防止在录制过程中意外抽搐干扰玻璃毛细管电极。
   注:ERG 系统中的 DC-ERG 刺激协议具有多个内置刺激例程，可以通过单击步进（前进箭头） 或 步进 （后退箭头 ）来选择。只需在软件中准备和执行 DC-ERG 录制所需的步骤 1、4 和 5。
5. 在 ERG 系统软件中，验证是否选择了正确的患者。单击绿色 协议按钮 。在 "协议说明" 下 选择 DC-ERG。 然后单击"运行 "。通过单击"是"来验证这是正在执行的正确 测试。
6. 使用步骤 1/6 指定的红灯刺激器打开圆顶内的红灯，以帮助定位鼠标和电极，同时观察阻抗的变化。
7. 将鼠标放在加热的录音桌上，用钳子小心地将后腿的皮肤搭起来。用一只手牢牢握住针电极，并将其皮下插入后腿，将其固定到位。
8. 将参考 Ag/AgCl 电极 （材料表） 放在嘴内，使烧结颗粒沿着后脸颊放置，并固定在牙齿后面。
   注:金丝电极不应用作嘴参考电极，因为它们具有不同的阻抗特性，并增加峰对峰噪声。
9. 在将毛细管电极放在鼠标的眼睛之前，将电极支架与玻璃毛细管垂直保持，用食指轻拂电极支架，以去除可能引入的任何气泡。使用附在注射器上 25 G 的针头填充尖端，并进行检查以确保尖端没有气泡。放置电极支架，使充满 HBSS 的毛细血管的开头与角膜温和接触。
10. 使用特殊的预防措施，通过保持润滑剂眼凝胶分配器倒置并丢弃初始滴液，避免引入气泡。将一滴润滑剂眼凝胶放在每只眼睛上，以保持导电性并防止在记录过程中干燥。

6. 直流-ERG 录制

1. 单击" 步进 "（前进箭头）选择步骤 4/6"长闪光无 Li"。
2. 单击 阻抗。使用 阻抗检查 屏幕检查左右眼的电阻。每个眼部记录电极的阻抗值预计相似（[39 k]）。接地和参考电极的阻抗值预期小于 10 kΩ）。
3. 单击 " 预览"可查看左眼和右眼的轨迹。等待实现稳定基线（<10 分钟）。单击" 停止 "退出跟踪预览。
   注:记录中漂移方向的突然变化或异常噪声不会随着时间的推移而改善，需要识别需要注意的毛细管电极。最可能的原因就是电极尖端的气泡。用 HBSS 重新填充尖端。再次单击 " 预览"以检查基线。
4. 单击" 步进 "（前进箭头）选择步骤 5/6"长闪光 10 CD 7 分钟"。
5. 单击 " 运行"以开始录制（图 1D）。

7. 数据导出

1. 选择要导出的鼠标录制的"患者"（姓氏）。
2. 单击旧 测试。
3. 在 协议说明下 选择 DC-ERG。单击绿色" 加载" 按钮以加载以前获取的数据。
4. 单击步 进 （前进箭头）前进至步骤 5/6"长闪光 10 CD 7 分钟"。
5. 单击导出。
6. 提供文件名（例如文件名.csv）。有效的文件名必须以字母开头，后跟字母、数字或下划线。不要使用特殊字符或连字符。数据分析程序（DCERG_Analysis.exe）要求表条目满足变量名称的要求。
7. 在数据表旁边放置一个复选标记。在分隔符旁边，选择"选项卡"。在选项（标题、垂直）、包括所有（步骤、Chans、结果）、数据列（内容、结果、扫描）和格式（文件）旁边放置复选标记。
8. 然后单击导出 （ 图1E）。这会将 *.csv保存到 C:\多焦文件夹。

8. 数据分析

1. 下载并安装适当的运行时安装程序 （材料表）
2. 下载并安装DCERG_Analysis.exe安装程序。
   注意:这将安装将执行 DC-ERG 组件分析的脚本，并创建一个快捷方式来运行"开始菜单"文件夹中的程序。
3. 单击"开始"菜单 > 程序 文件夹中 创建的 快捷方式。
4. 选择导出的数据文件或文件 （*.csv） 进行分析。使用 Ctrl = 鼠标左键单击以选择多个文件。
   注: 可执行文件生成两种类型的绘图: 1） 原始数据绘制时用指示测量漂移的最佳拟合线绘制;2） 漂移校正响应在用移动平均线平滑后绘制（跨度为 ±5 s）。在此图中，确定了 DC-ERG 分量的振幅和峰值时间:c 波、快速振荡、光峰值和非响应。然后以表格式导出数据，以表示每个工作表对应于不同的鼠标录制。这些工作表后跟两个摘要表:（一） 编译的 DC-ERG 振幅（mV）;（ii） 编译的 DC-ERG 峰值时间（光开始，t = 0 分钟）。

结果

图 2是 miR-204 ko/ko cre/= （条件 KO） 和野生类型 （WT） 小鼠的样本数据集。MiR-204 ko/ko cre/+ 是视网膜色素上皮中具有微RNA 204有条件淘汰的小鼠。这些小鼠是由交叉絮克miR-204小鼠（由NEIGEF生产^）22与VMD2-CRE小鼠²³生成。MiR-204在RPE中高度表达，它调节对保持紧密结完整（例如，结接完整性）、通过Kir 7.1钾通道的表达维持钾平衡以及几个视觉循环...

讨论

关键步骤

良好的 DC-ERG 记录需要稳定的电极，这些电极没有气泡，这些气泡会产生伪影和不需要的漂移，因为它们对排气和温度变化非常敏感。当电极放置在 HBSS 沐浴溶液中，然后继续进行鼠标记录时，必须实现稳定的基线。小气泡往往聚集在毛细管电极底部或硅胶垫片周围，一旦电极支架完全组装完毕，就很难看到。当存在几个气泡时，轻轻轻拂支架将释放它?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ag/AgCl (mouth) Electrode	WPI Inc	EP1	Mouth reference electrode for mouse
Ceramic Tile	Sutter Instrument	CTS	Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size
Cotton Tipped Cleaning Stick	Puritan Medical Products	867-WC No Glue	To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly
Electroretinogram (ERG) System	Diagnosys LLC	E3 System	Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials
Bunsen Burner	Argos Technologies	BW20002460	Or equivlaent to shape glass under flame
Glass Capillary Tube (1.5 mm)	Sutter Instruments	BF150-75	For filling with HBSS and making contact to the cornea
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific Inc	14175-095	Commercially available. Maintain at RT
In-Line Filter	Whatman	6722-5001	To protect vacuum pump from aerosols
Low Noise Cable for Microelectrode Holders	WPI Inc	5372	Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies
Magnetic Ball Joint	WPI Inc	500871	For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage
MatLab	Mathworks		MatLab: For editing the analysis software
MatLab Curvefit Toolbox	Mathworks		Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)
MatLab Compiler	Mathworks		Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)
MatLab Runtime version 9.5	Mathworks	R2018b (9.5)	Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Microelectrode Holders (45 degrees)	WPI Inc	MEH345-15	For holding the capillaries
Needle (25 ga)	Covidien	8881250313	For filling the capillary tubes with HBSS
Needle (ground) Electrode	Rhythmlink	13mm - one elctrode	Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)
Regulator/Power Conditioner	Furman	P-1800	Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line
Syringe (12 mL)	Monoject	1181200777	For filling the capillary tubes with HBSS
T-clip	Cole-Parmer	06852-20	For electrode holder assembly
Vacuum Desiccator	Bel-Art	420120000	Clear polycarbonate bottom & cover
Pharmacological treatment
Lubricant eye gel	Alcon	0078-0429-47	Helps lubricate corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes
Phenylephrine Hydrochloride 2.5%	Akorn	17478-201-15	Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Proparacaine Hydrochloride 0.5%	Akorn	17478-263-12	Local anesthetic for ophthalmic instillation
Tropicamide 0.5%	Akorn	17478-101-12	Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Xylazine	AnaSed	sc-362949Rx	Analgesic and muscle relaxant
Zetamine (Ketamine HCl)	VetOne	501072	Anesthetic for intramuscular injections