فحص محسن وأدوات لقياس النوسسيبل الميكانيكي في يرقات دروسوفيليا

Summary

الهدف من هذا البروتوكول هو إظهار كيفية إجراء فحص محسن للانكارية الميكانيكية في يرقات دروسوفيليا. نستخدم الفحص هنا لإثبات أن فرط الحساسية الميكانيكية (الوسوفيا وhyperalgesia) موجود في يرقات دروسوفيليا.

Abstract

وقد أدت عمليات الفحص المنشورة للانكارسي في دروسوفيليا إلى تقييمات مختلفة للسلوك. هنا، نحن ملفقة، للاستخدام مع يرقات دروسوفيليا، مخصصة معدنية النيكل والتيتانيوم سبائك (نيتينول) خيوط. هذه المسابير الميكانيكية مماثلة لخيوط فون فراي المستخدمة في الفقاريات لقياس nociception الميكانيكية. هنا، ونحن نبين كيفية جعل ومعايرة هذه المسابير الميكانيكية وكيفية توليد استجابة الجرعة السلوكية الكاملة من subthreshold (غير ضارة أو غير ضارة النطاق) إلى المحفزات فوق الهد (منخفضة إلى عالية الضارة) المحفزات. لإثبات فائدة المسابير ، قمنا بالتحقيق في فرط الحساسية الناجمة عن تلف الأنسجة في يرقات دروسوفيليا. لم يتم بعد تحديد الحساسية الميكانيكية للتحفيز الميكانيكي غير الضار عادةً) وhyalgesia (الاستجابة المبالغ فيها لحافز ميكانيكي ضار) في يرقات دروسوفيليا. باستخدام المسابير الميكانيكية التي عادة ما تكون غير ضارة أو تحقيقات التي تثير عادة سلوكًا غير نشط ، وجدنا أن يرقات Drosophila تطور فرط الحساسية الميكانيكية (كلا من allodynia وhyalgesia) بعد تلف الأنسجة. وبالتالي، فإن المسابير الميكانيكية والمقايسة التي نوضحها هنا من المرجح أن تكون أدوات مهمة لتشريح الآليات الجزيئية/الوراثية الأساسية للحساسية الفائقة الميكانيكية.

Introduction

تظهر يرقات دروسو فيلها سلوك متداول مُميز مميز عند تعرضها لمحفزات ضارة مختلفة:^{الحرارية 1}، الميكانيكية²،^{والكيميائية 3}. هذا السلوك هو واضح يختلف عن الحركة العادية. هنا نحن وصف فحص ميكانيكية محسنة التي يمكن استخدامها لتقييم الحساسية الميكانيكية والحساسية الميكانيكية.

في دراسة حديثة، ونحن ملفقة فون فراي مثل خيوط باستخدام أسلاك نيتينول⁴. وقد بذلت تحقيقات ممارسة قوى وضغوط مختلفة من خلال تغيير أطوال وأطر الأسلاك نيتينول تشكيل كل مسبار. تم معايرة المسابير الميكانيكية وتم تحويل قيم القوة المقاسة (في الدخنونتون، mN) إلى ضغط (كيلوباسكال، كيلو باسكال)، استنادًا إلى منطقة الطرف لكل مسبار⁴. تلفيق مخصص من المسبر الميكانيكية يسمح لنا لتوليد subthreshold (≤200 كيلو باسكال) إلى أعلى من هه (225 كيلو باسكال إلى 5318 كيلو باسكال) الضغوط، والتي يمكن، من حيث المبدأ، أن تكون مفيدة لدراسة فرط الحساسية الميكانيكية. باستخدام هذه خيوط فون فراي الميكانيكية المحسنة ، أظهرنا أن الضغط⁴، على عكس القوة التي تم فحصها سابقًا^2،5،6 يرتبط بشكل أكثر اتساقًا بالاستجابة السلوكية الكارهة في يرقات دروسوفيليا. كما ساعد الفحص الميكانيكي المحسن الموصوف هنا على تحديد عامل نمو البطانية الوعائية المحفوظ (VEGF) المرتبط بمستقبلات التيروزين كيناز التي تشير إلى مسار ينظم التنامية الميكانيكية في الذباب والجرذان⁴.

االعينة الميكانيكية وhyalgesia، وهما طريقتان من فرط الحساسية، هي غير مدروسة نسبيا في يرقات دروسوفيليا، مقارنة مع الحرارية (الحرارة والبرد) والطرائق الكيميائية الحسية^{3،7،8،9،10}. وربما يرجع ذلك إلى عدم وجود تحقيقات ميكانيكية محددة تمتد من المحفزات الضارة إلى النطاق الضار العالي^2،5،6. حافز غير ضار عادةً يثير سلوك المتداول المتعرج النموذجي بعد تجربة يرقات دراوسوفيليا تلف الأنسجة^3،يشار إلى⁷ باسم الالوديانيا. ومن المعروف أن استجابة مبالغ فيها المتداول إلى حافز ضارة عادة كما هو مفرط^7. يتم تعريف المحفزات الضارة بأنها تلك التي تثير تلف الأنسجة ويمكن تنشيط nociceptors¹¹. المحفزات الضارة تسليمها إلى يرقات Drosophila الضرر إما البشرة الحاجز، والخلايا العصبية الحسية nociceptive الطرفية^3،4،7، أو كليهما.

في هذه المقالة، نُوضح كيفية تصنيع ومعايرة المجسّسات الميكانيكية التي تُشبه بـ "فون فري" والمناسبة ليرقات "دروسوفيليا". علاوة على ذلك ، نعرض كيفية استخدام هذه المسابير لمقايسة الاستجابات الناجسية الميكانيكية في يرقات دروسوفيليا. وأخيراً، نبرهن كذلك على فائدة هذه المسابير باستخدامها لإثبات وجود فرط الحساسية الميكانيكية، كلا من الالودينية والهايبرجيا، بعد تلف الأنسجة في يرقات دروسوفيليا (انظر نتائج التمثيل).

Protocol

1. بناء مسبار الميكانيكية

1. قطع كل خيوط النيتينول (الشكل 1B)، عمودي على محورها الطويل، إلى الطول المحدد (الشكل 1M-N) باستخدام قاطع أسلاك صغير (الشكل 1C). خيوط تأتي في ثلاثة أقطار محددة مسبقا مختلفة (الشكل 1B).
   ملاحظة: الأطوال المحددة هنا هي دليل لتحقيق الضغوط التقريبية المشار إليها، وذلك باستخدام بروتوكول مماثل لبناء جبل. في نهاية المطاف، بغض النظر عن طول قطع خيوط، وعمق الثقب في جبل، يجب أن تقاس خيوط / معايرة على التوازن للحصول على قوة بالضبط / قيمة الضغط.
2. فحص طرف خيوط تحت منظار مجسم لضمان عدم وجود حواف حادة أو غير منتظمة حيث يمكن أن تسبب هذه الخيوط تلفًا في الأنسجة لبشرة اليرقات وتتداخل مع المعايرة.
3. يدويا سلاسة الحواف الحادة للمسبار الميكانيكي باستخدام حجر شحذ حتى لا تستمر أي مخالفات حادة(الشكل 1D).
4. جعل حفرة قرب نهاية عصا الملوثات الخشبية الخشبية (الشكل 1E) باستخدام إبرة تحت الجلد (انظر جدول المواد). أدخل الإبرة على الأقل في منتصف الطريق من خلال ارتفاع عصا popsicle (الشكل 1E). هذا يخلق غرفة لإدراج خيوط النيتينول.
5. تطبيق الغراء الخشب على خيوط نيتينول واحد (الشكل 1F) وإدراج خيوط الغراء المغلفة في فتحة إبرة في عصا الملوثات الخشبية الخشبية (الشكل 1G). السماح لتجف ل~ 5 ساعة.
6. معايرة كل مسبار ميكانيكي عن طريق الضغط عليه ضد مقياس حتى ينحني المسبار الميكانيكي (الشكل 1H-L). هذه هي نقطة القوة القصوى التي يمكن تسجيلها في غرام. اعتمادا على أقطار خيوط (قبل تعيين) وأطوال (يحددها المستخدم) يمكن توليد مجموعة كاملة من القوى والضغوط.
7. تحويل الكتلة المسجلة في الخطوة 1.6 إلى قوة في الميلينوتون (mN) باستخدام الصيغة f = ma (القوة تساوي الكتلة مضروبة في تسارع الجاذبية). (و): القوة؛ م: كتلة; أ: تسارع الجاذبية (9.8 م / ث²) (الشكل 1M).
8. وأخيراً، قم بتحويل القوة المحسوبة إلى ضغط (قوة/منطقة) بالكيلوباسكال (كيلو باسكال) عن طريق تقسيم القوة المقاسة على مساحة سطح طرف خيوط (الشكل 1M). لحساب المنطقة، قم بتحويل قطر خيوط النيتينول المختلفة من بوصات (0.04"، 0.06 بوصة، و0.08 بوصة) إلى سنتيمتر. ثم يحدد πr² (حيث، ص = نصف قطر خيوط النيتينول) المنطقة (انظر الشكل 1M). إعداد مسابير متعددة باستخدام خيوط من أقطار وأطوال مختلفة سوف تولد مجموعة كاملة تمتد على نطاق استجابة ليرقات دروسوفيليا (مجموعة عينة هو مبين في الشكل 1N).
   ملاحظة: تحقق من كل مسبار ميكانيكي كل 3-4 أسابيع على الأقل. عندما ينحرف الضغط بأكثر من ± 3٪ من المقياس الأصلي، يجب أن يكون مسبار ميكانيكي جديد ملفقاً.

2- إعداد اليرقات

1. رفع سلالة التحكم (ث¹¹¹⁸) ذرية اليرقات أو اليرقات التي تحتوي على transgenes ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP (لتصور الضرر للخلايا العصبية الحسية) على الغذاء القياسي في حاضنة 25 درجة مئوية. عادة، يتم الاحتفاظ بالمخزونات بشكل روتيني عند 18 درجة مئوية ولكن يتم تربية كلا الوالدين وذرة اليرقات عند 25 درجة مئوية على الغذاء القياسي دقيق الذرة للتجارب.
   ملاحظة: الذباب البالغ (خمسة ذكور وعشرة الإناث، 1:2 نسبة) يتم الاحتفاظ بها في قارورة الذبابة، للسماح زرع البيض، لحوالي 24 ساعة. يبدأ الوقت بعد وضع البيض (AEL) من عند إزالة البالغين.
2. جمع اليرقات الثالثة، بعد ما يقرب من 96 ساعة من وضع البيض، عن طريق رش بلطف ماء الصنبور في الطعام ذبابة لينة تحتوي على اليرقات. اليرقات الهائمة التي تركت الطعام ، أو التي تم قذفها في الأبراج الأمامية أو الخلفية ، كبيرة جدًا / قديمة جدًا لهذا الفحص. اليرقات الثانية (~ أقل من 4 مم في الطول) صغيرة جدا.
3. صب محتويات الطعام ذبابة لينة في معيار نظيفة حجم طبق بيتري (100 مم × 15 ملم).
4. باستخدام ملقط، فرز منتصف الثالث إنستار، متوسطة الحجم، اليرقات (انظر الشكل 2A) من أصغر (الثانية فيستار والثالث في وقت مبكر instar) أو أكبر (أواخر أو تجول الثالث فيستار) يرقات. ينصح بالتلاعب اللطيف بالملباب لتجنب أي تلف في الأنسجة لليرقات.
   ملاحظة: يستند النقل باستخدام ملقط في الغالب على توتر المياه وليس عن طريق الضغط على اليرقات مع ريش من ملقط. بديل لاستخدام ملقط للمناورة اليرقات هو فرش الطلاء الناعمة. مع أي من الاداة، يجب على المستخدم ممارسة نقل الحيوانات، حتى لا يسبب تلف الأنسجة غير مقصودة التي يمكن أن تعقد القياسات السلوكية.
5. نقل اليرقات الثالثة المتوسطة، باستخدام ملقط، إلى طبق بيتري صغير (30 مم × 15 ملم) يحتوي على القابس صغير من الطعام المتطاير مبلل بالماء في درجة حرارة الغرفة. إبقاء اليرقات في طبق بيتري الصغيرة حتى يتم إجراء التجارب، ولكن ليس أكثر من 20 دقيقة.
   ملاحظة: عموما، نقل 20-30 اليرقات إلى المكونات الغذائية سوف تعطي عددا كافيا لمدة 20 دقيقة من الخضوع للتشهين السلوكي.

3. الميكانيكية nociception فحص

1. ضع يرقة متوسطة الثالثة (باستخدام ملقط) على لوحة رقيقة من الفينيل الأسود أو الداكن تحت مجسم مجسم حقل مشرق. يوفر اللون الداكن التباين الذي يحسن التصور من اليرقة. من الأفضل أن يكون لديك قطعة منقولة بحرية من الفينيل الداكن لأنه يسمح للمستخدم بمحاذاة اليرقة دون لمسها أو إيذائها.
2. وضع أضواء الألياف الضوئية بين العدسات الهدف المجهر ومنصة الفينيل الأسود أو الداكن; وهذا سيسمح كافية عالية التباين الإضاءة لرؤية اليرقة.
3. تخلص من اليرقات التي لا تظهر الحركة العادية بعد نقلها إلى الوسادة. يمكن أن تتداخل هذه مع الاستجابة السلوكية الناوسيبية العادية. للاطلاع على الحركة العادية، راجع الفيديو 1.
4. امسح، باستخدام منشفة ورقية، أي مياه زائدة تحيط باليرقة قد تتسبب في تعويم اليرقة على وسادة الفينيل.
5. توجيه اليرقة عن طريق تحريك لوحة الفينيل الداكنة. يجب أن يشير رأس / فم اليرقة إلى اليسار إذا كنت اليد اليمنى والعكس بالعكس إذا كنت أعسر(الشكل 2A -B).
6. تطبيق المسبار الميكانيكي المختار، عادة لمدة 1-2 s، على الجانب الظهري الخلفي من اليرقة في الجزء البطني تقريبا A8 (انظر الشكل 2B)،حتى ينحني المسبار وينتزع كمية الضغط التي تم قياسها سابقا (الشكل 2C). من المهم أن يضغط المسبار على السطح الظهري لليرقة ويضغط اليرقات في الوسادة الأساسية عند نقطة ملامسة المسبار.
   ملاحظة: عند نقطة التماس بين طرف خيوط النيتينول وبشرة الظهرية، تحقيقات أقل من 2300 كيلو باسكال، تنحني بشكل رئيسي دون اختراق الأنسجة الجلدية والأنسجة الأساسية. هذه المسابير نادرا ما تؤثر على وفيات اليرقات⁴. في ضغوط أعلى (>5000 كيلو باسكال) تحقيقات على حد سواء الانحناء و, أحيانا, اختراق الأنسجة التي كانت تحتها. يؤدي ثقب اليرقات إلى إعاقة بقاء^{اليرقات 4،} وإذا لوحظ ذلك، يتم التخلص من هذه اليرقات عادة من التحليل السلوكي.
7. سجل الاستجابة السلوكية لكل يرقة. يشار إلى استجابة إيجابية نُفُسّة(فيديو 2)إذا كانت اليرقة تظهر لفة كاملة من 360 درجة على طول محور جسمها في غضون 3 s. تعتبر الردود الأخرى (محاولة تشغيل، تتبع الارتباطات السريعة، وتلوّه) سلبية لأغراض هذا الفحص.
   ملاحظة: اليرقات حفزت مع التحفيز الميكانيكية subthreshold (200 كيلو باسكال) لم تثر استجابة نموذجية nociceptive أو المتداول(فيديو 3). بعض اليرقات لم تظهر ردود سريعة إلى الأمام أو لمسة خفيفة مثل التغييرات في اتجاه الحركة.
8. تخلص من اليرقة واحضر اليرقة التالية للتشايس ، وتكرار الخطوات من 3.1 إلى 3.7.
9. كرر الخطوات 3.1-3.7 حتى يتم الوصول إلى العدد المطلوب من اليرقات (ثلاث إلى ست مجموعات من ن = 10 يرقات استخدمت هنا لكل مسبار).
   ملاحظة: عند استخدام مسابير ميكانيكية ضغط أقل (174-462 كيلو باسكال)، فإن الفحص يستغرق وقتاً أكثر لكل يرقة. وذلك لأن غيض من خيوط أطول يتذبذب أكثر، مما يجعل من الصعب كزة اليرقة في وسط الجزء A8. الممارسة ضرورية مع هذه التحقيقات.

4. المجهر Confocal لتقييم مورفولوجيا الخلايا العصبية

1. ضع يرقة (من النمط الجيني ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP لتسمية الخلايا العصبية الحسية) التي تم تحفيزها سابقًا بخيوط نيتينول في غرفة أثير داخل جرة كوبلين تحتوي على كوبر 10 مل يحمل كرة قطنية غارقة في ~ 1 مل من الأثير الديثيل. دع اليرقة تجلس في الغرفة لمدة 5 دقائق تقريبًا.
   ملاحظة: يتم توفير بروتوكول مفصل لـ etherization في دراسة سابقة نشرتها مجموعتنا^12.
2. شطف اليرقة بلطف من غرفة الإيثيري في طبق بيتري صغير.
3. وقد الجاهزة شريحة مجهر واحد، واثنين من الأغطية الصغيرة (22 × 22 ملم)، و coverlip واحد طويل (22 × 54 ملم) (انظر جدول المواد).
4. إضافة قطرات صغيرة من الأثير : حل النفط (1:5 نسبة الايثيل الأثير إلى حل زيت الهالوكربون ، انظر جدول المواد) إلى طرفي الشريحة ، ثم ضع الأغطية الصغيرة على رأس قطرات صغيرة. يخلق هذا الترتيب فجوة صغيرة في المساحة حيث يمكن أن تناسب اليرقة.
   ملاحظة: اضغط على الأغطية الصغيرة مقابل شريحة المجهر حتى يصبح من الصعب الانزلاق.
5. إضافة بعض قطرات من الأثير: حل النفط في منتصف الشريحة المجهر ومن ثم وضع اليرقة، وذلك باستخدام ملقط، على مركز الشريحة المجهر (بين الأغطية الصغيرة). تأكد من أن المحور الأمامي لليرقة موازٍ للجانب القصير من الشريحة وأن الجانب الظهري يواجه لأعلى.
6. غطي اليرقات مع غطاء طويل يوضع فوق اليرقة واثنين من الأغطية الصغيرة.
   ملاحظة: اضغط بسخاء على الأغطية الطويلة حتى تصبح اليرقة مسطحة تقريبًا.
7. صورة الجزء A8 من اليرقة باستخدام مجهر confocal (انظر جدول المواد)باستخدام طول موجة الليزر 488 (GFP).
   ملاحظة: صورة اليرقة على الفور لأن التخدير عبر الأثير سوف تتلاشى بسرعة (~ 5-10 دقيقة) وسوف تستيقظ اليرقة وتتحرك، مما سيعقد التصوير أكثر.
8. التقاط الصور Z-المكدس في قرار من 1024 × 1024 بكسل باستخدام فتحة رقمية 20x (NA) 0.7 عدسة الهدف الجاف في 1x التكبير، حجم الخطوة من 1.5 μm.

5. كمية تلف الأنسجة

1. جمع وتحويل الصور المكدسة سلسلة Z، من القسم 4.8، إلى إسقاط Z واحد (تسطيح صور متعددة مأخوذة في مختلف المستويات البؤرية في صورة مركبة واحدة). ويمكن تنفيذ ذلك باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا (مثل أوليمبوس فلوفيو) أو أي منصة ما يعادلها من المصادر المفتوحة، مثل فيجي/الصورة J. احفظ الإسقاط الوحيد Z في شكل TIFF.
2. افتح برنامج تحليل الصور في فيجي/إيمج.
3. انقر فوق ملف، من شريط القوائم، وحدد فتح من النافذة المعروضة.
4. حدد إسقاط صورة مفردة مخزنة، محفوظة في تنسيق TIFF، ليتم تحليلها.
5. انقر على تحرير، من شريط القوائم، وحدد خيار عكس من النافذة التي يتم عرضها.
6. انقر على الصورة، من شريط القوائم، ثم حدد ضبط، من النافذة التي يتم عرضها، وأخيراً حدد خيار السطوع/التباين.
7. حدد الخيار شكل حر من شريط الأدوات لقياس مساحة الفجوة (إن وجدت).
8. انقر على تحليل، من شريط القوائم، وحدد خيار القياس. هذا وسوف يعرض منطقة الفجوة أو الجرح.

النتائج

قمنا بتطوير مسابير ميكانيكية مخصصة، وذلك باستخدام خيوط النتينول(الشكل 1A,N)،لاستخلاص السلوكيات التي تثيرها ميكانيكيا، وولّد منحنى استجابة الجرعات السلوكية الكاملة باستخدام كل من المسابير الميكانيكية الضارة وغير الضارة ذات الكثافة المختلفة(الشكل 2D)مما يدل على أنه يمكن استخدام هذه المسابير لدراسة خط الأساس (في غياب الإصابة) nociception الميكانيكية.

نتائجنا اختبار السلوكي تحديد أن تحقيقات ممارسة الضغوط أقل من 200 كيلو باسكال (~ 1.57 م)(الشكل 1M)،عند تطبيقها على يرقات دروسوفيليا، لا تثير استجابة المتداول aversive(الشكل 2D والفيديو 3). وكما هو متوقع، فإن هذه المسابير الميكانيكية غير الضارة أو غير الضارة (175 كيلو باسكال أو 200 كيلو باسكال) لم تثر تلف الأنسجة العصبية المرئية(الشكل 2E). لأنها لا تسبب الضرر، مثل هذه المسابير يمكن أن تكون مفيدة لتقييم الوهودينيا الميكانيكية (فرط الحساسية إلى المحفزات الميكانيكية غير ضارة عادة). وعلى العكس من ذلك، فإن المسابير فوق الهد أو الضارة (من 462 كيلو باسكال إلى 5116 كيلو باسكال) أثارت استجابة سلوكية معززة(الشكل 2D)بطريقة تعتمد على الجرعة - مع الضغوط الأعلى التي تثير استجابات سلوكية أقوى. كما هو متوقع، الضغط الميكانيكي فوق الرثهولد أيضا تسبب الضرر الأنسجة تعتمد على الجرعة إلى الخلايا العصبية الحسية المحيطية نفسها(الشكل 2E). وكانت المساحة المقاسة لتلف الأنسجة (في ميكرومتر² ± الانحراف المعياري) المأخوذة من أربع يرقات لكل مجموعة: 2,051.03 ± 703.81 (462 كيلو باسكال), 5,102. 29 ± 1,004.67 (2,283 كيلو باسكال)، و12,238.83 ± 3,724.11 (5,116 كيلو باسكال). وهكذا، فإن الضغوط أكبر من أو تساوي 462 كيلو باسكال (~63 م.ن)، والتي تثير استجابة متدحرجة (في 25٪ أو أكثر من اليرقات) وتسبب تلف الأنسجة العصبية المرئية(الشكل 2E)، يمكن أن تكون مناسبة لدراسة فرط الحساسية الميكانيكية (فرط الحساسية للمحفزات الميكانيكية الضارة عادة). تحقيقات الميكانيكية Nociceptive (≥462 كيلو باسكال) دائماً الحث على تلف الأنسجة (ن = 10، تقييم نوعي) ولكن لا تثير دائما استجابة المتداولة aversive.

لتقييم فرط الحساسية الميكانيكية (allodynia وhyalgesia)، استخدمنا نموذج يرقات Drosophila راسخة من الحساسية nociceptive التي تستخدم الأشعة فوق البنفسجية (UV) الإشعاع للحث على تلف الأنسجة^7،12. وقد ساعد هذا الفحص على تشريح الآليات الوراثية والخلوية للحساسية الحرارية النابية^{المفرطة 8،9،10،13،14،15}. لتحديد ما إذا كان العلاج بالأشعة فوق البنفسجية يسبب الحساسية الميكانيكية، منتصف التحكم في النجوم الثالثة(ث¹¹¹⁸⁾كانت اليرقات وهمية المشععة أو الأشعة فوق البنفسجية المشعة (15-20 mJ/cm²) (الشكل 3A). ثم تم اختبار اليرقات سلوكياً عند 2 ساعة و4 ساعات و8 ساعات و16 ساعة و24 ساعة بعد المعالجة بمسبار ميكانيكي تحت الهد (200 كيلو باسكال ، 1.57 م.ين). وقد استجاب ما يقرب من 20٪ من اليرقات في وقت مبكر من 2 ساعة بعد العلاج بالأشعة فوق البنفسجية في حين أن 50٪ استجابت في 4 ساعات ، مقارنة مع 6.6 ٪ و 8.3 ٪ وهمية الحيوانات الأشعة فوق البنفسجية المشعة ، على التوالي(الشكل 3B). وهذا يشير إلى أن تلف الأنسجة الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية يسبب الالودينيا الميكانيكية في 4 ح بعد التشعيع. في وقت لاحق من النقاط (8 ساعات، 16 ساعة، و 24 ساعة) كانت الاستجابة السلوكية لليرقات المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية في حدود 16٪ -20٪ مستجيبة (متوسط متوسط n = 3-6 مجموعات من 10 يرقات لكل من) ، زيادة طفيفة (ولكن ليس ذات دلالة إحصائية) مقارنة بمجموعة التحكم المشععة الوهمية (في حدود 3٪ -6٪ من المستجيبين، متوسط متوسط ن = 3-6 مجموعات من 10 يرقات لكل من ) (الشكل 3B).

للتحقيق في فرط الحساسية الميكانيكية ، وهو ضغط فوق الحساسية (462 كيلو باسكال ، 3.63 م ن) ، الذي يؤدي عادة إلى استجابة متدحرجة في ~ 20 ٪ من اليرقات (الشكل 2D)ويسبب تلف الأنسجة العصبية(الشكل 2E)، تم استخدامه. طبقنا مسبار 462 كيلو باسكال على الجانب الظهري من اليرقات مع أو بدون تلف الأنسجة الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية(الشكل 3A). وجدنا أن اليرقات مسبر في 4 ح، 8 ح، و 16 ح بعد العلاج بالأشعة فوق البنفسجية أظهرت زيادة كبيرة في استجابة المتداول aversive، مع 4 ح كونها ذروة فرط الحساسية السلوكية (~ 60٪ استجابة)؛ أظهرت الحيوانات الأشعة فوق البنفسجية المشعة وهمية ~ 27٪ من استجابة aversive(الشكل 3C). على غرار الالعيار الميكانيكي، الاستجابة السلوكية في 8 ساعات، 16 ح، و 24 ساعة من الحيوانات المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية (في حدود 36٪ -42٪) لا يمكن أن يتم تحديدها إحصائياً عن اليرقات غير المعالجة (في حدود 20٪ –26٪). اليرقات في مرحلة أواخر الثالث فيستار لم تظهر انخفاضا طفيفا من الاستجابة السلوكية الأساسية بالمقارنة مع المرحلة الثالثة الوسطى. نحن افترض أن هذا يمكن أن يكون إما بزيادة حجم اليرقات (الشكل 2A) أو زيادة سمك بشرة تغطي الجسم. يمكن أن تفسر هذه الحقيقة لماذا في مرحلة لاحقة من التنمية العلاج الأشعة فوق البنفسجية لا تحفز على زيادة التوعية الميكانيكية، كما لوحظ 4 ح العلاج بالأشعة فوق البنفسجية.

معا، تشير نتائجنا إلى أن يرقات دروسوفيليا تطوير كل من الالودينية الميكانيكية والهايبرجيا الميكانيكية بعد تلف الأنسجة الناجمة عن الأشعة فوق البنفسجية. وقت الذروة من الالودينيا الميكانيكية وhyperalgesia هو نفسه، 4 ح بعد العلاج بالأشعة فوق البنفسجية. ومع ذلك، هوبرالجيسيا الميكانيكية لديها ذيل الصدغي أكثر وضوحا كما أنه يعود إلى خط الأساس أكثر ببطء مقارنة مع الالوينيا الميكانيكية.

الشكل 1: تطوير أداة تشبه فون فراي لتقييم النوستيسيون الميكانيكي في يرقات دروسوفيليا. (أ) صورة مسبار ميكانيكي يستخدم لدراسة النوستيسيون الميكانيكي في يرقات دروسوفيليا. (ب)تظهر خيوط النيتينول وأقطارها النسبية بمقياس نسبي. (C) صورة قاطع الأسلاك القطري المستخدم لقطع خيوط النتينول. (D) تجانس الحواف الحادة لخيوط النيتينول المقطوعة مع حجر شحذ. (E) إبرة تحت الجلد تستخدم لجعل حفرة في مقبض عصا الملوثات الخشبية الخشبية للمسبار. يجب أن يصل طرف الإبرة إلى نصف ارتفاع مقبض عصا على الأقل من أجل إدخال خيوط آمنة. (F-G) مرفق خيوط النيتينول عن طريق الإلتصاق في مقبض عصا الملوثات الخشبية الخشبية مع ثقب الإدراج. (H-L) معايرة المسابير الميكانيكية عن طريق الضغط عليها ضد مقياس. (M)قيم القوة (في mN) والضغط (في كيلو باسكال) التي تم إنشاؤها بواسطة تحقيقات ميكانيكية مختلفة. طول كل خيوط النتينول المستخدمة لبناء المسابير (P1-P10؛ P: مسبار) مفصلة في السنتيمتر (سم). (N) صورة لمجموعة كاملة من المسابير الميكانيكية، تتراوح بين 174 كيلو باسكال إلى 5،116 كيلو باسكال. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: مقايسة nociception الميكانيكية: فون فراي مثل خيوط توليد منحنى الجرعة استجابة للسلوك المتداول aversive وتسبب تلف الأنسجة إلى الخلايا العصبية الحسية. (أ) صور للمراحل المختلفة (الثانية والثالثة من اليرقات الدوزوفيلية. شريط مقياس: 2 مم.(ب)الكرتون من وجهة نظر الظهر من يرقات الدروسوفيا الثالث. تشير النقطة الحمراء إلى الجزء البطني الذي يتم فيه تطبيق المسبار الميكانيكي. T: الجزء الصدري; A: الجزء البطني. وتوجد علامات أخرى على معالم تشريحية. (C) رسوم متحركة من المقايسة: يتم تطبيق مسبار ميكانيكي على الجانب الظهري من اليرقة حتى تنحني على السطح أدناه ثم يتم عقد لمدة 2 s. إذا كان الضغط مرتفعًا بما فيه الكفاية ، فإن هذا يثير استجابة متدحرجة عند الإصدار. (د) استجابة الجرعة السلوكية؛ كل نقطة زرقاء تمثل نسبة اليرقات التي استجابت ، مع المتداول المُلَكِف ، إلى التحفيز الميكانيكي ضمن مجموعة من 10. كمان مؤامرة من نسبة من السلوك المتداول aversive الناجمة عن تحقيقات ميكانيكية مختلفة. كيلو باسكال: كيلوباسكال. تمثل قطع الأراضي المربعة الوسيط (الأخضر)، والشعيرات (الحمراء) تمثل المئينين 10 و90. (E)تلف الأنسجة: تم فحص يرقات النجوم الثالثة (من النمط الجيني ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP لتسمية الخلايا العصبية الحسية النوفية) في الجزء الظهري A8 مع الضغوط المشار إليها. ثم تم فحص الخلايا العصبية الحسية ذات الفئة الرابعة من فئة ddaC (عبر خط الوسط الظهري) (انظر القسمين 4 و5). المناطق البيضاء (العلامات النجمية الحمراء) تمثل الثغرات أو تلف الأنسجة. شريط مقياس: 100 μm. في اللوحة B ، تظهر اليرقة في المنظر الظهري ، بينما في C هو المنظر الجانبي. تحقيقات ميكانيكية الضغط ضد الجانب البشرة البشرة الظهرية من اليرقة تنتج الاكتئاب مثل جيب عند نقطة التماس من غيض من التحقيق والمناطق المحيطة بها. الخط الأسود الصلب المنحني نحو الجانب البطني هو الجزء العلوي من الجيب، بينما يمثل الخط الجانبي الرمادي المتقطع الجانب الجانبي وأسفل الجيب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: فرط الحساسية الميكانيكية بعد تلف الأشعة فوق البنفسجية. (أ) التخطيطي للتصميم التجريبي لاختبار التوعية. منتصف الثالث instar كانت تعامل وهمية (غير الأشعة فوق البنفسجية) أو الأشعة فوق البنفسجية المشعة. ثم تم إجراء فحص الحساسية الميكانيكية في وقت مختلف (2 ساعة ، 4 ح ، 8 ح ، 16 ساعة ، و 24 ساعة) بعد العلاج الوهمي أو التشعيع. (ب) الالاثل النية الميكانيكية: النسبة المئوية لليرقات التي تظهر تدحرجاً مفتاراً بعد التحقيق مع حافز ميكانيكي عادة تحت الانبعاثات أو غير ضارة (200 كيلو باسكال، 1.57 م.ن) عند النقاط الزمنية المشار إليها بعد المعالجة الوهمية أو الإشعاع فوق البنفسجي. (C)فرط الحساسية الميكانيكية: النسبة المئوية لليرقات التي تظهر تدحرجاً مُنفَذاً بعد الادّح مع حافز ميكانيكي فوق الكبري أو ضار عادة (462 كيلو باسكال، 3.63 م.ن) عند نقاط الوقت المشار إليها بعد المعالجة الوهمية أو التشعيع فوق البنفسجي. وتشير شرائط الخطأ إلى متوسط +/- SEM. تم استخدام اختبار t-غيرمُبَدّد ذو ذيلين للتحليل الإحصائي: * p < 0.05، **p < 0.01؛ *p 0.05، **p < 0.01؛ *p 0.05، **p < 0.01؛ p 0.05، **p 0.01؛ ns: ليست كبيرة. كل نقطة حمراء، في اللوحات B و C، تمثل النسبة الوسطية لـ 10 يرقات، n = 3-6 مجموعات لكل نقطة زمنية/حالة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1: الحركة العادية ليرقات دروسوفيليا. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو 2: التحفيز الميكانيكي الضار ليرقات دروسوفيليا. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو 3: التحفيز الميكانيكي دون الكبر هو من يرقات دروسوفيليا. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.

Discussion

نحن تعديل اختبار الميكانيكية المنشأة^1،2،16 باستخدام مسابير ميكانيكية مخصصة ملفقة من خيوط النتينول. تسمح لنا هذه السبائك المعدنية باستخدام خيوط قطر أصغر تتناسب مع حجم يرقات دروسوفيليا. وقد سيطرت على الصيد على أساس خط monofilaments مجال nociception الميكانيكية الطيران حتى الآن^2,5,6,16. لدينا خيوط النيتينول الحفاظ على شكلها والضغط المقاس لمدة ~ ~ 3-5 أشهر (في تجربتنا). من خلال تغيير طول وقطر خيوط النتينول ، يمكن للمستخدم توليد مجموعة واسعة من الضغوط التي تمتد من subthreshold إلى استجابة المتداول كاملة تقريبا. على وجه الخصوص، مما يجعل subthreshold تحقيقات أبسط مع خيوط النيتينول قطرها الأصغر. باستخدام هذه التحقيقات، وجدنا أن الضغط، بدلا من القوة، يثير استجابات سلوكية أكثر اتساقا nocifensive⁴. نبرهن هنا، باستخدام نموذج توعية nociceptive مُنشأ من الأشعة فوق البنفسجية^7،10،13، أن هذه الخيوط هي أيضا أداة مفيدة لدراسة فرط الحساسية الميكانيكية - اللودينيا وفرط الاججيزيا.

وقد أدت الدراسات السابقة باستخدام مسابير ميكانيكية ملفقة من خط الصيد إلى بعض التباين في الاستجابة السلوكية^2،6،16،17. وقد تكون هناك عدة عوامل تُعدّ في الاعتبار. أولاً، لأن الضغط هو المتغير المهم، فإن تلميع طرف خيوط بحيث يتم تقريبه وليس لديه أي حواف حادة أمر بالغ الأهمية. ثانياً، إن الإبلاغ عن قيم الضغط بدلاً من القوة فقط مهم لقابلية تكرار التجارب، لأن المسابير الميكانيكية المختلفة التي تولد قوى مماثلة يمكن أن تثير ضغوطاً متباينة^4. ثالثاً، من المهم تطبيق تحفيز ميكانيكي واحد فقط لكل يرقة باستخدام مسابير ضارة، لأن هذه المسابير تنتج تلفًا يعتمد على الجرعة في الأنسجة التي تعتمد على الجرعة على مستويات الخلايا العصبية الجلدية^{والحسية} (الشكل 2E). ويمكن للمحفزات الميكانيكية الضارة الثانية أو اللاحقة، بعد أن يتم إحداث تلف الأنسجة، أن تضعف وظيفة الخلايا العصبية الحسية الطرفية المتأثرة وتنتزع استجابة سلوكية معدلة. في دراسة أخرى، اليرقات حفز مرتين مع مسابير ميكانيكية ضارة عرض في الغالب استجابة سلوكية معززة⁵، مما يشير إلى تطوير الحساسية الميكانيكية الحادة (hyperalgesia)، والتي قد تنتج عن تلف الأنسجة التي أثارها أول حافز ميكانيكي ضارة. على العكس من ذلك، أفاد مؤلفون آخرون⁶ عن استجابة سلوكية مختلطة (زيادة أو نقصان)، مما يشير إلى أن الاستجابة السلوكية المتغيرة يمكن أن تكون بسبب تلف/خلل في الأنسجة العصبية. تحفيز كل يرقة مرة واحدة فقط يزيل التباين المحتمل في الاستجابات السلوكية الناتجة إما عن التوعية أو تلف الأنسجة. رابعاً، نحن ميكانيكيا حفز الجزء A8، الذي هو أكثر الخلفي من الدراسات السابقة (المناطق المفضلة A3-A4)^2،5،16. لم المسابير بين ~ 3900 كيلو باسكال و 5300 كيلو باسكال المطبقة على أي من الجزء A2 أو A8 لم تظهر أي اختلافات سلوكية⁴. بالإضافة إلى ذلك ، من الأسهل تحفيز A8 ، مقارنة بـ A2 - A4 ، باستخدام المجسات الميكانيكية التي تولد ضغوطًا أقل (<300 كيلو باسكال) لأن اليرقة أرق في هذه المنطقة وبالتالي مضغوطة بسهولة أكبر. وأظهرت دراسات أخرى أن التحفيز الميكانيكي الضار للنهاية الخلفية لليرقة (التي ألقاها دبوس حشرة جامدة ، التي عقدت مع ملقط) أثار في الغالب الحركة إلى الأمام ، بدلا من استجابة 18 aversive أو^{المتداول.} يمكن أن تكون هذه الاستجابة السلوكية المختلفة بسبب الاختلافات في خصائص المواد المستخدمة (خيوط النيتينول القابلة للانحناء مقابل دبوس الحشرات غير المضغوطة) أو إلى ضغوط مختلفة تم تسليمها إلى اليرقات (لم يتم الإبلاغ عن قيمة ضغط دبوس الحشرة).

وقد مكن تطوير مقايسة nociception الميكانيكية ليرقات الدوزوفيليا الحقل لاكتشاف أن القنوات الأيونية الحسية الميكانيكية المختلفة والدوائر العصبية وساطة nociception الميكانيكية^5,6,16,17. ومع ذلك ، فإن دراسة فرط الحساسية الميكانيكية (allodynia وhyperalgesia) قد تخلفت ، مقارنة بالتوعية من طرائق الحسية الأخرى - الحرارة^7،8^،10،13،^14،الباردة⁹،^{والكيميائية 3}. وقد يرجع هذا التأخر جزئياً إلى عدم وجود مسابير ميكانيكية مناسبة يمكن أن تولد نطاقاً استجابة كاملة تمتد إلى الضغوط فوق الوثارس. ذات أهمية خاصة ، خاصةً لتقييم النياية الميكانيكية ، هي مسابير تحت الهودود لا تثير استجابة متدحرجة من اليرقات غير الموبّعة. أهمية المجس الميكانيكية المحسنة لدينا هي أنها يمكن أن تكون ملفقة لتمتد المحفزات غير ضارة (subthreshold ~ 174 كيلو باسكال -200 كيلو باسكال) أو من المنخفض إلى ارتفاع مجموعة ضارة (suprathreshold ~ 225 كيلو باسكال إلى ~ 5،116 كيلو باسكال). هنا ، نبرهن باستخدام خيوط تشبه nitinol von Frey التي تطور يرقات Drosophila كل من اللودينية الميكانيكية والهايبرجيا الميكانيكية بعد الإشعاع فوق البنفسجي. التوعية الميكانيكية تظهر بعض الاختلافات بالمقارنة مع التوعية الحرارية. كل من بداية وذروة التوعية الميكانيكية في وقت سابق (~ 4 ح) مقارنة بالحساسية الحرارية (الحرارة) (~ 8 ح لhyperalgesia و ~ 24 ساعة للالسودية)⁷. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الالوينيا الميكانيكية وhyperalgesia يصاحب (على حد سواء الذروة في ~ 4 ساعة). وعلاوة على ذلك، في حين التوعية الحرارة (allodynia وhyalgesia) يحل تماما في وقت لاحق نقاط⁷، أظهرت فرط الحساسية الميكانيكية ذيل طويل التي ظلت أعلى قليلا من خط الأساس. التوعية الباردة في دروسوفيليا ينطوي على التبديل في السلوكيات الباردة أثار⁹ وظهور سلوكيات جديدة أثار الباردة - وهي ظاهرة لا يلاحظ مع التحفيز الميكانيكي. هذه الاختلافات في بداية، والمدة، والسلوكيات الملاحظة تشير إلى أن كل طريقة الحسية يمكن التحكم بها من خلال مسارات إشارة مختلفة. الجمع بين الحساسية الموصوفة هنا مع الأدوات الوراثية القوية المتاحة في Drosophila ينبغي أن تسمح تشريح وراثي دقيق للحساسية الميكانيكية (allodynia وhyalgesia) لوحظ.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker	Fisher Scientific	02-540C	Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do.
Black (Arkansas) bench stone	Dan’s Whetstone	SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C	Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/
Confocal microscope	Olympus	FV1000	Any equivalent confocal microscope will do
Coplin Jar	Fisher Scientific	08-816	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816
Diethyl ether	Fisher Scientific	E138-500	For anesthetizing larvae.
Etherization chamber			This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape.
Fiber Optic Light Guide	Schott AG	A08575	Schott Dual Gooseneck 23 inch
Forceps	Fine Science Tool	FS-1670	For transferring larvae
Glue	Aleene's	N/A	Aleene's® Wood Glue, formerly called (Aleene's All-Purpose Wood Glue) https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue
Graspable holder	Loew Cornell	N/A	Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces.
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898-100ML
Hypodermic needle 30G 1/2"L	Fisher Scientific	NC1471286	BD Precisionglide® syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires
Large Petridish	Falcon	351007	60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish
Microscope (Zeiss) Stemi 2000	Carl Zeiss, Inc.	NT55-605	Any equivalent microscope will do
Microscope Cover Glass 22x22	Fisher	12-545-B
Microscope Cover Glass 22x40	Corning	2980-224	Tickness 1 1/2
Microscope Slides	Globe Scientific Inc.	1358Y
Mini Diagonal Cutter	Fisher Scientific	S43981	For cutting nitinol filaments
Nitinol filaments, Diameters: 0.004”, 0.006”, 0.008”	Mailin Co	N/A	Fifteen pieces of each diameter of 12” length were ordered. https://malinco.com/
Piece of black vinyl	Office Depot	N/A	We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva
Small Petridish	Falcon	351008	35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish
Spatula	Fisher Scientific	21-401-10	Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish
Wipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture.
W1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605	Control strain for behavioral assays
ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP	Bloomington Drosophila Stock Center	8749	Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons