Un saggio e strumenti migliorati per misurare la nocicezione meccanica nelle larve di Drosophila

Riepilogo

L'obiettivo di questo protocollo è mostrare come eseguire un saggio migliorato per la nocicezione meccanica nelle larve di Drosophila. Usiamo il saggio qui per dimostrare che l'ipersensibilità meccanica (allodinia e iperalgesia) esiste nelle larve di Drosophila.

Abstract

I saggi pubblicati per la nocicezione meccanica in Drosophila hanno portato a valutazioni variabili del comportamento. Qui abbiamo fabbricato, per l'uso con larve di Drosophila, filamenti personalizzati in lega nichel-titanio (nitinol). Queste sonde meccaniche sono simili ai filamenti di von Frey usati nei vertebrati per misurare la nocicezione meccanica. Qui, dimostriamo come realizzare e calibrare queste sonde meccaniche e come generare una risposta alla dose comportamentale completa da stimoli sottosoglie (innocui o non-noxious) a stimoli soprasospeciati (da bassa a alta gamma noxiosa). Per dimostrare l'utilità delle sonde, abbiamo studiato l'ipersensibilità indotta da danni ai tessuti nelle larve di Drosophila. L'allodinia meccanica (ipersensibilità a uno stimolo meccanico normalmente innocuo) e l'iperalgesia (reattività esagerata a uno stimolo meccanico noxioso) non sono ancora state stabilite nelle larve di Drosophila. Utilizzando sonde meccaniche normalmente innocue o sonde che tipicamente provocano un comportamento avverso, abbiamo scoperto che le larve di Drosophila sviluppano ipersensibilizzazione meccanica (sia allodinia che iperalgesia) dopo danni ai tessuti. Pertanto, le sonde meccaniche e il saggio che illustriamo qui saranno probabilmente strumenti importanti per sezionare i meccanismi molecolari / genetici fondamentali dell'ipersensibilità meccanica.

Introduzione

Le larve di Drosophila mostrano un caratteristico comportamento di rotolamento avverso quando esposte a diversi stimoli noxious:^{termico 1,meccanico 2}e chimico³. Questo comportamento è chiaramente distinto dalla normale locomozione. Qui descriviamo un saggio meccanico migliorato che può essere utilizzato per valutare la nocicezione meccanica e la sensibilizzazione meccanica.

In un recente studio, abbiamo fabbricato filamenti simili a von Frey usando fili di nitinolo⁴. Le sonde che esercitavano forze e pressioni diverse erano fatte variando le lunghezze e i diametri dei fili di nitinolo che formavano ogni sonda. Le sonde meccaniche sono state calibrate e i valori di forza misurati (in millinewton, mN) sono stati convertiti in pressione (kilopascal, kPa), in base all'area di punta^{di ciascuna sonda 4.} La fabbricazione personalizzata di sonde meccaniche ci ha permesso di generare sottosoglie (≤200 kPa) per sovratreshold (da 225 kPa a 5318 kPa) pressioni, che potrebbero, in linea di principio, essere utili per lo studio dell'ipersensibilità meccanica. Utilizzando questi filamenti meccanici migliorati simili a von Frey, abbiamo dimostrato che la^{pressione 4}, a differenza della forza^{precedentemente esaminata 2,5,6} è correlata in modo più coerente con la reattività comportamentale avversa nelle larve di Drosophila. Il miglior saggio meccanico qui descritto ha anche contribuito a identificare un recettore della tirosina chinasi legato al recettore vascolare conservato (VEGF) che segnala una via che regola la nocicezione meccanica nelle mosche e nei ratti⁴.

L'allodinia meccanica e l'iperalgesia, due modalità di ipersensibilità, sono relativamente sottostudiate nelle larve di Drosophila, rispetto alle modalità sensoriali termiche (calore e freddo) e^{chimiche 3,7,8,9,10}. Ciò è probabilmente dovuto alla mancanza di specifiche sonde meccaniche che vanno da stimoli innocui all'alta gamma noxiosa^2,5,6. Uno stimolo normalmente innocuo che suscita il tipico comportamento di rotolamento avverso dopo che le larve di Drosophila sperimentano danni ai^{tessuti 3,7} è indicato come allodinia. Una risposta ondulata esagerata a uno stimolo tipicamente noxious è nota come iperalgesia⁷. Gli stimoli noxious sono definiti come quelli che provocano danni ai tessuti e possono attivare^{nocicettori 11}. Gli stimoli nocivi consegnati alle larve di Drosophila danneggiano l'epidermide barriera, i neuroni sensoriali nocicettivi periferici^3,4,7o entrambi.

In questo articolo, dimostriamo come fabbricare e calibrare su misura sonde meccaniche simili a von Frey appropriate per le larve di Drosophila. Inoltre, mostriamo come usare queste sonde per saggiare le risposte nocicettive meccaniche nelle larve di Drosophila. Infine, dimostriamo ulteriormente l'utilità di queste sonde utilizzandole per dimostrare la presenza di ipersensibilità meccanica, sia allodinia che iperalgesia, a seguito di danni ai tessuti nelle larve di Drosophila (vedi Risultati rappresentativi).

Protocollo

1. Costruzione di sonde meccaniche

1. Tagliare ogni filamento di nitinolo (Figura 1B), perpendicolare al suo asse lungo, alla lunghezza specificata (Figura 1M-N) utilizzando una piccola fresa a filo(Figura 1C). I filamenti sono disponibili in tre diversi diametri pre-impostati (Figura 1B).
   NOTA: Le lunghezze qui specificate sono una guida per ottenere le pressioni approssimative indicate, utilizzando un protocollo simile per la costruzione del supporto. In definitiva, indipendentemente dalla lunghezza del taglio del filamento e dalla profondità del foro nel supporto, i filamenti devono essere misurati / calibrati su un equilibrio per ottenere l'esatto valore di forza / pressione.
2. Esaminare la punta del filamento sotto uno stereomicroscopio per assicurarsi che non rimangano bordi affilati o irregolari in quanto questi potrebbero causare danni ai tessuti alla pelle delle larve e interferire con la calibrazione.
3. Smussare manualmente i bordi affilati della sonda meccanica utilizzando una pietra affilata fino a quando non persistono irregolarità bruschi (Figura 1D).
4. Fare un foro verso l'estremità di un bastoncino di ghiacciolo di legno (Figura 1E) utilizzando un ago ipodermico (vedi Tabella dei materiali). Inserire l'ago almeno a metà dell'altezza del bastone del ghiacciolo (Figura 1E). Questo crea una camera per l'inserimento del filamento di nitinolo.
5. Applicare la colla di legno su un singolo filamento di nitinolo (Figura 1F) e inserire il filamento rivestito di colla nella fessura dell'ago in un bastoncino di ghiacciolo di legno (Figura 1G). Lasciare asciugare per ~5 h.
6. Calibrare ogni sonda meccanica premendola contro una scala fino a quando la sonda meccanica non si piega (Figura 1H-L). Questo è il punto di massima forza che può essere registrato in grammi. A seconda dei diametri del filamento (pre-impostato) e delle lunghezze (determinate dall'utente) è possibile generare una gamma completa di forze e pressioni.
7. Convertire la massa registrata nel passaggio 1.6 in forza in millinewton (mN) usando la formula f = ma (La forza è uguale alla massa moltiplicata per l'accelerazione gravitazionale). f: forza; m: massa; a: accelerazione gravitazionale (9,8 m/s²) (Figura 1M).
8. Infine, convertire la forza calcolata in pressione (forza/area) in kilopascal (kPa) dividendo la forza misurata per la superficie della punta del filamento(figura 1M). Per calcolare l'area, convertire il diametro dei diversi filamenti di nitinolo da pollici (0,04", 0,06" e 0,08") in centimetri. Quindi, πr² (dove, r = il raggio del filamento nitinolo) determina l'area (vedere figura 1M). La preparazione di più sonde utilizzando filamenti di diversi diametri e lunghezze genererà un set completo che copre l'intervallo reattivo per le larve di Drosophila (set di campioni mostrato nella figura 1N).
   NOTA: Controllare ogni sonda meccanica almeno ogni 3-4 settimane. Quando la pressione si discosta di oltre ± del 3% dalla misura originale, deve essere fabbricata una nuova sonda meccanica.

2. Preparazione delle larve

1. Aumentare il ceppo di controllo (w¹¹¹⁸) progenie larvale o larve contenenti i transgeni ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP (per visualizzare i danni ai neuroni sensoriali) sugli alimenti standard in un incubatore di 25 °C. Tipicamente, le scorte sono regolarmente mantenute a 18 °C, ma sia i genitori che la prole larvale vengono allevati a 25 ° C su cibo di farina di mais standard per esperimenti.
   NOTA: Le mosche adulte (cinque maschi e dieci femmine, rapporto 1:2) sono tenute nelle fiale della mosca, per consentire la deposizione delle uova, per circa 24 ore. Il tempo dopo la deposizione delle uova (AEL) inizia da quando gli adulti vengono rimossi.
2. Raccogli le terze larve instar, dopo circa 96 ore di deposizione delle uova, spruzzando delicatamente acqua del rubinetto nel cibo morbido contenente le larve. Le larve errante che hanno lasciato il cibo, o che hanno estroverso spiracoli anteriori o posteriori, sono troppo grandi / vecchie per questo saggio. Le seconde larve instar (~ meno di 4 mm di lunghezza) sono troppo piccole.
3. Versare il contenuto del soft fly food in una piastra di Petri di dimensioni standard pulite (100 mm x 15 mm).
4. Usando le forcep, ordinare le larve di terzo instar medio, di medie dimensioni (vedi Figura 2A)da larve più piccole (seconda instar e prima terza instar) o più grandi (terza instar tardiva o errante). Si raccomanda una manipolazione delicata con forcep per evitare danni ai tessuti alle larve.
   NOTA: Il trasferimento con forcep si basa principalmente sulla tensione dell'acqua e non applicando pressione alle larve con le lame delle forcep. Un'alternativa all'uso di forcep per manovrare le larve sono i pennelli morbidi. Con entrambi gli strumenti, l'utente dovrebbe esercitarsi a trasferire gli animali, in modo da non causare danni involontari ai tessuti che potrebbero complicare le misurazioni comportamentali.
5. Trasferire le larve medie del terzo instar, usando le forcep, in una piccola piastra di Petri (30 mm x 15 mm) contenente una piccola spina di fly food inumidita con acqua a temperatura ambiente. Mantenere le larve nella piccola piastra di Petri fino a quando gli esperimenti non vengono eseguiti, ma non più di 20 minuti.
   NOTA: Generalmente, il trasferimento di 20-30 larve nella spina del cibo darà un numero adeguato per 20 minuti di test comportamentali.

3. Saggio di nocicezione meccanica

1. Posizionare una larva instar di metà terzo (usando le forcep) su un sottile cuscinetto di vinile nero o scuro sotto uno stereomicroscopio a campo luminoso. Il colore scuro fornisce un contrasto che migliora la visualizzazione della larva. È preferibile avere un pezzo liberamente mobile di vinile scuro perché consente all'utente di allineare la larva senza toccarla o ferirla.
2. Metti le luci in fibra ottica tra le lenti oggettive del microscopio e il cuscinetto in vinile nero o scuro; ciò consentirà un'adeguata illuminazione ad alto contrasto per vedere la larva.
3. Scartare le larve che non mostrano una normale locomozione dopo il trasferimento sul pad. Questi possono interferire con la normale risposta comportamentale nocicettiva. Per la locomozione normale, vedere Video 1.
4. Pulire, usando un tovagliolo di carta, qualsiasi acqua in eccesso che circonda la larva che potrebbe causare il galleggiamento della larva sul cuscinetto in vinile.
5. Orientare la larva spostando il cuscinetto in vinile scuro. La testa/bocca della larva dovrebbe puntare a sinistra se si è destrimani e viceversa se si è mancini (Figura 2A-B).
6. Applicare la sonda meccanica scelta, tipicamente per 1-2 s, sul lato dorsale posteriore della larva a circa il segmento addominale A8 (vedere figura 2B), fino a quando la sonda si piega e provoca la quantità di pressione precedentemente misurata (Figura 2C). È importante che la sonda premono contro la superficie dorsale della larva e comprime le larve nel pad sottostante nel punto di contatto della sonda.
   NOTA: Nel punto di contatto tra la punta del filamento nitinolo e la cuticola dorsale-epidermide, le sonde inferiori a 2.300 kPa, si piegano principalmente senza penetrare la cuticola e i tessuti sottostanti. Tali sonde raramente influenzano la mortalità larvale⁴. A pressioni più elevate (>5.000 kPa) le sonde si piegano e, occasionalmente, penetrano nella cuticola e nei tessuti sottostanti. La foratura delle larve compromette la sopravvivenza larvale^{4 e,} se osservata, queste larve vengono tipicamente scartate dall'analisi comportamentale.
7. Registrare la risposta comportamentale per ogni larva. Una risposta nocicettiva positiva (Video 2) è indicata se la larva mostra un rotolo completo di 360° lungo l'asse del suo corpo entro 3 s. Altre risposte (tentativo di girare, scansione rapida e deformazione) sono considerate negative ai fini di questo saggio.
   NOTA: Le larve stimolate con uno stimolo meccanico subreshold (200 kPa) non hanno suscitato la tipica risposta nocicettiva o laminazione (Video 3). Alcune larve hanno mostrato risposte rapide in avanti o al tocco leggero come cambiamenti nella direzione del movimento.
8. Scartare la larva e preparare quella successiva per il saggio, ripetendo i passaggi da 3.1 a 3.7.
9. Ripetere i passaggi da 3,1 a 3,7 fino a raggiungere il numero desiderato di larve (qui sono stati utilizzati da tre a sei insiemi di n = 10 larve per ogni sonda).
   NOTA: Quando si utilizzano sonde meccaniche a pressione inferiore (174-462 kPa), il saggio richiederà più tempo per larva. Questo perché la punta dei filamenti più lunghi oscilla di più, rendendo più difficile colpire la larva al centro del segmento A8. La pratica è necessaria con queste sonde.

4. Microscopia confocale per valutare la morfologia neuronale

1. Posizionare una larva (di genotipo ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP per etichettare i neuroni sensoriali) precedentemente stimolata con un filamento nitinolo in una camera di eterizzazione all'interno di un barattolo coplin contenente un becher da 10 mL che trasporta un batuffolo di cotone imbevuto di ~ 1 mL di etere dietile. Lascia che la larva si sieda nella camera per ~ 5 minuti.
   NOTA: Un protocollo dettagliato per l'eterizzazione è fornito in un precedente studio pubblicato dal nostro^{gruppo 12}.
2. Risciacquare delicatamente la larva dalla camera di etherizzazione in una piccola piastra di Petri.
3. Avere pronto un vetrino per microscopio, due piccoli copripavimenti (22 x 22 mm) e un lungo coverslip (22 x 54 mm) (vedi Tabella dei materiali).
4. Aggiungere piccole gocce di soluzione di etere:olio (rapporto 1:5 tra etere etilico e soluzione di olio alocarbonio, vedere Tabella dei materiali) su entrambe le estremità dello scivolo, quindi posizionare i piccoli copripavimenti sopra le piccole goccioline. Questa disposizione crea un piccolo spazio vuoto in cui la larva può adattarsi.
   NOTA: Premere i piccoli coprisparsi contro lo scivolo del microscopio fino a quando non è difficile scivolare.
5. Aggiungere alcune gocce di soluzione etere:olio al centro dello scivolo del microscopio e quindi posizionare la larva, usando le forcep, al centro dello scivolo del microscopio (tra i piccoli copripivai). Assicurarsi che l'asse anteroposterior della larva sia parallelo al lato corto dello scivolo e che il lato dorsale sia rivolto verso l'alto.
6. Coprire le larve con il lungo coverslip posto sopra la larva e i due copripasci più piccoli.
   NOTA: Premere generosamente il lungo coverslip fino a quando la larva è quasi piatta.
7. Segmento di immagine A8 della larva utilizzando un microscopio confocale (vedi Tabella dei materiali) utilizzandola lunghezza d'onda laser 488 (GFP).
   NOTA: Immagine immediata della larva perché l'anestesia tramite etere svanirà rapidamente (~ 5-10 minuti) e la larva si sveglierà e si muoverà, il che complicherà ulteriori immagini.
8. Cattura immagini Z-stack con una risoluzione di 1024 x 1024 pixel usando un obiettivo obiettivo secco 20x (NA) 0,7 con zoom 1x, dimensioni del passo di 1,5 μm.

5. Quantificazione dei danni ai tessuti

1. Raccogli e converti le immagini dello stack della serie Z, dalla sezione 4.8, in un'unica proiezione Z (appiattimento di più immagini scattate su piani focali diversi in un'unica immagine composita). Questo può essere eseguito utilizzando software disponibile in commercio (ad esempio, Olympus Fluoview) o qualsiasi piattaforma open source equivalente, ad esempio Fiji/ Image J. Salva la singola proiezione Z nel formato TIFF.
2. Aprire il programma di analisi delle immagini Fiji/ImageJ.
3. Fare clic su Filedalla barra dei menu e selezionare Apri dalla finestra visualizzata.
4. Selezionare la singola proiezione dell'immagine memorizzata, salvata nel formato TIFF, da analizzare.
5. Fare clic suModifica dalla barra dei menu e selezionare l'opzione Inverti dalla finestra visualizzata.
6. Fare clic sull'immagine, sulla barra dei menu, quindi selezionare Regoladalla finestra visualizzata e infine selezionare l'opzione Luminosità/Contrasto.
7. Selezionate l'opzione Forma a mano libera (Freehand Shape) dalla barra degli strumenti per misurare l'area dello spazio (se disponibile).
8. Fare clic suAnalizza dalla barra dei menu e selezionare l'opzione Misura. In questo modo verrà visualizzata l'area dello spazio o della ferita.

Risultati

Abbiamo sviluppato sonde meccaniche personalizzate, utilizzando filamenti di nitinolo (Figura 1A,N), per suscitare comportamenti evocati meccanicamente e generato una curva di risposta alla dose comportamentale completa utilizzando sonde meccaniche innocue e nocive di varia intensità(Figura 2D)dimostrando che queste sonde possono essere utilizzate per studiare la nocicezione meccanica di base (in assenza di lesioni).

I risultati del nostro saggio comportamentale hanno determinato che le sonde che esercitano pressioni inferiori a 200 kPa (~1,57 mN) (Figura 1M), se applicate alle larve di Drosophila, non provocano una risposta di rotolamento avversa (Figura 2D e Video 3). Come previsto, queste sonde meccaniche subsocie o non sciorose (175 kPa o 200 kPa) non hanno causato danni visibili ai tessuti neuronali (Figura 2E). Poiché non inducono danni, tali sonde potrebbero essere utili per valutare l'allodinia meccanica (ipersensibilità a stimoli meccanici normalmente non scioccati). Al contrario, sonde sopratende o noxious (da 462 kPa a 5.116 kPa), hanno suscitato una risposta comportamentale aumentata (Figura 2D) in modo dipendente dalla dose , con le pressioni più elevate che suscitano risposte comportamentali più forti. Come previsto, la pressione meccanica soprasoglie ha anche indotto danni al tessuto dose-dipendenti ai neuroni sensoriali periferici stessi (Figura 2E). L'area misurata di danno tissutale (in^{μm 2} ± deviazione standard) prelevata da quattro larve per ciascun gruppo era: 2.051,03 ± 703,81 (462 kPa), 5.102.102.29 ± 1.004,67 (2.283 kPa) e 12.238,83 ± 3.724,11 (5.116 kPa). Pertanto, pressioni superiori o uguali a 462 kPa (~63 mN), che evocano una risposta di rotolamento avversa (nel 25% o più delle larve) e causano danni visibili al tessuto neuronale(Figura 2E), potrebbero essere appropriate per studiare l'iperalgesia meccanica (ipersensibilità a stimoli meccanici normalmente noxious). Le sonde meccaniche nocicettive (≥462 kPa) inducono sempre danni ai tessuti (n = 10, valutati qualitativamente) ma non sempre provocano una risposta di rotolamento avversa.

Per valutare l'ipersensibilità meccanica (allodinia e iperalgesia), abbiamo utilizzato un consolidato modello larvale drosophila di sensibilizzazione nocicettiva che utilizza l'irradiazione della luce ultravioletta (UV) per indurre danni ai^{tessuti 7,12}. Questo saggio ha contribuito a sezionare i meccanismi genetici e cellulari dell'ipersensibilità nocicettiva^{termica 8,9,10,13,14,15}. Per determinare se il trattamento UV provoca l'allodinia meccanica, le larve a metà del terzo instar (w¹¹¹⁸) sono state irradiate finte o irradiate dai raggi UV (15-20 mJ/cm²) (Figura 3A). Quindi, le larve sono state testate comportamentalmente a 2 h, 4 h, 8 h, 16 h e 24 h post-trattamento con una sonda meccanica normalmente sottosoglie (200 kPa, 1,57 mN). Circa il 20% delle larve ha risposto già 2 ore dopo il trattamento UV, mentre il 50% ha risposto a 4 ore, rispetto rispettivamente al 6,6% e all'8,3% di finti animali irradiati dai raggi UV(figura 3B). Ciò indica che i danni ai tessuti indotti dai raggi UV causano allodinia meccanica a 4 ore dopo l'irradiazione. Nei punti di tempo successivi (8 h, 16 h e 24 h) la risposta comportamentale delle larve trattate con UV era compresa tra il 16% e il 20% di risponditori (media di n = 3-6 set di 10 larve ciascuna), leggermente aumentata (ma non statisticamente significativa) rispetto al gruppo di controllo finto irradiato (nell'intervallo del 3%-6% dei soccorritori, media di n = 3-6 insiemi di 10 larve ciascuno)(Figura 3B).

Per studiare l'iperalgesia meccanica, è stata utilizzata una pressione sopratesi (462 kPa, 3,63 mN), che normalmente induce una risposta di rotolamento avversa in ~ 20% delle larve (Figura 2D) e causa danni ai tessuti neuronali (Figura 2E). Abbiamo applicato la sonda da 462 kPa sul lato dorsale delle larve con o senza danni ai tessuti indotti dai raggi UV (Figura 3A). Abbiamo scoperto che le larve sondate a 4 ore, 8 ore e 16 ore dopo il trattamento UV hanno mostrato un aumento significativo della risposta di rotolamento avverso, con 4 h che sono il picco dell'ipersensibilità comportamentale (~ 60% reattiva); finti animali irradiati dai raggi UV hanno mostrato un ~27% di risposta avversa(figura 3C). Simile all'allodinia meccanica, la risposta comportamentale a 8 ore, 16 ore e 24 ore di animali trattati con UV (nell'intervallo 36%-42%) era statisticamente indistinguibile dalle larve non trattate (nell'intervallo 20%-26%). Le larve alla fine del terzo stadio instar hanno mostrato una leggera diminuzione della risposta comportamentale di base rispetto al terzo stadio instar medio. Ipotizzamo che ciò potrebbe essere o dall'aumento delle dimensioni delle larve (Figura 2A) o dall'aumento dello spessore della cuticola che copre il corpo. Questo fatto potrebbe spiegare perché in una fase successiva di sviluppo il trattamento UV non induce una maggiore sensibilizzazione meccanica, come osservato 4 ore dopo il trattamento UV.

Nel complesso, i nostri risultati indicano che le larve di Drosophila sviluppano allodinia meccanica e iperalgesia meccanica a seguito di danni ai tessuti indotti dai raggi UV. Il tempo di picco di allodinia meccanica e iperalgesia è lo stesso, 4 ore dopo il trattamento UV; tuttavia, l'iperalgesia meccanica ha una coda temporale più pronunciata in quanto ritorna alla linea di base più lentamente rispetto all'allodinia meccanica.

Figura 1: Sviluppo di uno strumento simile a Von Frey per valutare la nocicezione meccanica nelle larve di Drosophila. (A) Immagine di una sonda meccanica utilizzata per studiare la nocicezione meccanica nelle larve di Drosophila. (B) I filamenti di nitinolo e i loro diametri relativi sono indicati in scala relativa. (C) Immagine della fresa a filo diagonale utilizzata per tagliare i filamenti di nitinolo. (D) Levigare i bordi affilati del filamento di nitinolo tagliato con una pietra affilatrice. (E) Ago ipodermico utilizzato per fare un foro nella maniglia del bastone di ghiacciolo di legno della sonda. La punta dell'ago deve raggiungere almeno la metà dell'altezza del bastone della maniglia per un inserimento sicuro del filamento. (F-G) Attacco del filamento di nitinolo incollando in una maniglia di bastone di ghiacciolo di legno con foro di inserimento. (H–L) Taratura delle sonde meccaniche premendole su una bilancia. (M) Valori di forza (in mN) e pressione (in kPa) generati da diverse sonde meccaniche. La lunghezza di ogni filamento di nitinolo utilizzato per costruire le sonde (P1-P10; P: sonda) è dettagliato in centimetri (cm). (N) Immagine di una serie completa di sonde meccaniche, che vanno da 174 kPa a 5.116 kPa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Saggio di nocicezione meccanica: i filamenti simili a von Frey generano una curva dose-risposta del comportamento di rotolamento avverso e causano danni ai tessuti ai neuroni sensoriali. (A) Immagini delle diverse fasi (seconda e terza instar) delle larve di Drosophila. Barra di scala: 2 mm. (B) Cartone animato della vista dorsale delle larve di Drosophila della terza stella. Il punto rosso indica il segmento addominale in cui viene applicata la sonda meccanica. T: segmento toracico; A: segmento addominale. Altri punti di riferimento anatomici sono etichettati. (C) Cartone animato del saggio: Una sonda meccanica viene applicata sul lato dorsale della larva fino a quando non si piega contro la superficie sottostante e viene quindi tenuta per 2 s. Se la pressione è sufficientemente elevata, ciò provoca una risposta di rotolamento avversa al momento del rilascio. (D) Risposta comportamentale alla dose; ogni punto blu rappresenta la percentuale di larve che hanno risposto, con laminazione avversa, alla stimolazione meccanica all'interno di un set di 10 animali. Grafico per violino della percentuale di comportamento di rotolamento avverso indotto da diverse sonde meccaniche. kPa: kilopascal. I box plot rappresentano i baffi mediani (verdi), i baffi (rossi) rappresentano il 10 ° e il 90 ° percentili. (E) Danni ai tessuti: terze larve instar (di genotipo ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP per etichettare i neuroni sensoriali nocicettivi) sono state sondate al segmento dorsale A8 con le pressioni indicate. Sono stati quindi esaminati i neuroni sensoriali accoppiati di classe IV ddaC (attraverso la linea mediana dorsale) (vedi sezioni 4 e 5). Le aree bianche (asterischi rossi) rappresentano spazi vuoti o danni ai tessuti. Barra di scala: 100 μm. Nel pannello B, la larva è mostrata nella vista dorsale, mentre in C è la vista laterale. Sonde meccaniche premute contro il lato della cuticola dorsale-epidermide della larva producono una tasca simile alla depressione nel punto di contatto della punta della sonda e delle aree circostanti. La solida linea nera curva verso il lato ventrale è la parte superiore della tasca, mentre la linea laterale grigia tratteggiata rappresenta il lato laterale e la parte inferiore della tasca. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Ipersensibilità meccanica dopo danni ai raggi UV. (A) Schema della progettazione sperimentale per testare la sensibilizzazione. Il terzo instar medio è stato trattato in modo fittizio (non UV) o irradiato dai raggi UV. Il saggio di nocicezione meccanica è stato quindi eseguito in diversi punti di tempo (2 h, 4 h, 8 h, 16 h e 24 h) dopo un finto trattamento o irradiazione. (B) Allodinia meccanica: La percentuale di larve che mostrano laminazione avversa dopo il sondaggio con uno stimolo meccanico normalmente sottoteso o non noxioso (200 kPa, 1,57 mN) nei punti di tempo indicati dopo il trattamento simulato o l'irradiazione UV. (C) Iperalgesia meccanica: La percentuale di larve che mostrano laminazione avversa dopo aver sondato con uno stimolo meccanico normalmente soprateso o noxioso (462 kPa, 3,63 mN) nei punti di tempo indicati dopo il trattamento simulato o l'irradiazione UV. Le barre di errore indicano che per l'analisi statistica è stato utilizzato il test t nonaccoppiato a due code medio +/- SEM: *p < 0,05, **p < 0,01; ns: non significativo. Ogni punto rosso, nei pannelli B e C, rappresenta la proporzione media di 10 larve, n = 3-6 insiemi per punto/condizione di tempo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Normale locomozione delle larve di Drosophila. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2: Stimolazione meccanica noxious delle larve di Drosophila. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 3: Stimolazione meccanica subreshold delle larve di Drosophila. Clicca qui per scaricare questo video.

Discussione

Abbiamo modificato un saggio meccanico^{stabilito 1,2,16} utilizzando sonde meccaniche personalizzate fabbricate con filamenti di nitinolo. Questa lega metallica ci consente di utilizzare filamenti di diametro inferiore che sono appropriati alle dimensioni delle larve di Drosophila. I monofilamenti a base di lenza hanno dominato il campo della nocicezione meccanica a mosca^{fino ad oggi 2,5,6,16}. I nostri filamenti di nitinolo mantengono la loro forma e la pressione misurata per circa ~ 3-5 mesi (nella nostra esperienza). Variando la lunghezza e il diametro dei filamenti di nitinolo, l'utilizzatore può generare un'ampia gamma di pressioni che vanno dalla sottosoglie ad una risposta di laminazione quasi completa. In particolare, rendere le sonde di sottosoglie è più semplice con i filamenti di nitinolo di diametro inferiore. Usando queste sonde, abbiamo scoperto che la pressione, piuttosto che la forza, suscita risposte comportamentali nocifensive più coerenti⁴. Qui dimostriamo, utilizzando un consolidato modello di sensibilizzazione nocicettiva indotta dai raggi UV^7,10,13, che questi filamenti sono anche uno strumento utile per studiare l'ipersensibilità meccanica- allodinia e iperalgesia.

Studi precedenti che utilizzano sonde meccaniche fabbricate dalla lenza hanno portato a una certa variabilità nella reattività comportamentale^2,6,16,17. Diversi fattori possono tenere conto di questo. In primo luogo, poiché la pressione è la variabile importante, la lucidatura della punta del filamento in modo che sia arrotondata e non abbia bordi affilati è fondamentale. In secondo luogo, la segnalazione dei valori di pressione piuttosto che della sola forza è importante per la riproducibilità degli esperimenti, perché diverse sonde meccaniche che generano forze simili possono provocare pressioni disparate⁴. In terzo luogo, è fondamentale applicare una sola stimolazione meccanica per larva utilizzando sonde ose, perché tali sonde producono un danno tissutale dipendente dalla dose ai livelli neuronale epidermico⁴ e sensoriale (Figura 2E). Un secondo o successivo stimolo meccanico noxioso, dopo che il danno tissutale è stato indotto, potrebbe presumibilmente compromettere la funzione dei neuroni sensoriali periferici colpiti e suscitare una risposta comportamentale alterata. In un altro studio, le larve stimolate due volte con sonde meccaniche noxious mostravano principalmente una risposta comportamentale^{migliorata 5}, suggerendo lo sviluppo di una sensibilizzazione meccanica acuta (iperalgesia), che potrebbe derivare dal danno tissutale provocato dal primo stimolo meccanico noxious. Al contrario, altri autori^{6 hanno} riportato una risposta comportamentale mista (aumentata o diminuita), indicando che la risposta comportamentale alterata potrebbe essere dovuta a danni / disfunzioni del tessuto neuronale. Stimolare ogni larva solo una volta elimina la possibile varianza nelle risposte comportamentali derivanti dalla sensibilizzazione o dai danni ai tessuti. In quarto luogo, abbiamo stimolato meccanicamente il segmento A8, che è più posteriore rispetto agli studi precedenti (aree preferite A3-A4)^2,5,16. Le sonde tra ~3.900 kPa e 5.300 kPa applicate a entrambi i segmenti A2 o A8 non hanno mostrato differenze comportamentali⁴. Inoltre, A8, rispetto all'A2-A4, è più facile da stimolare con sonde meccaniche che generano pressioni più basse (<300 kPa) perché la larva è più sottile in questa regione e quindi più facilmente compressa. Altri studi hanno dimostrato che la stimolazione meccanica nocivia dell'estremità posteriore della larva (erogata da un perno rigido, tenuto con pin) per lo più evocava la locomozione in avanti, piuttosto che una risposta avversa o^{rotolante 18}. Questa diversa risposta comportamentale potrebbe essere dovuta a differenze nelle proprietà dei materiali usati (filamento di nitinolo piegabile vs perno insetto incomprimibile) o a diverse pressioni consegnate alle larve (il valore di pressione del perno dell'insetto non è stato segnalato).

Lo sviluppo di un saggio di nocicezione meccanica per le larve di Drosophila ha permesso al campo di scoprire che diversi canali ionici sensoriali meccanici e circuiti neurali mediano la nocicezione^{meccanica 5,6,16,17}. Tuttavia, lo studio dell'ipersensibilità meccanica (allodinia e iperalgesia) è in ritardo, rispetto alla sensibilizzazione delle altre modalità sensoriali - calore 7^,8,10,13,14,^{freddo 9}e chimico³. Questo ritardo può essere dovuto in parte all'assenza di sonde meccaniche idonee in grado di generare un intervallo di risposta completo che si estende sottosoglia alle pressioni soprasospese. Di particolare importanza, specialmente per la valutazione dell'allodinia meccanica, sono sonde sottosoglie che non suscitano una risposta di rotolamento avversa da parte di larve illese. Il significato delle nostre sonde meccaniche migliorate è che possono essere fabbricate per coprire stimoli innocui (sottosoglie ~174 kPa-200 kPa) o la gamma noxious da bassa ad alta (soprasoprareshold da ~225 kPa a ~5.116 kPa). Qui, dimostriamo usando i filamenti simili al nitinol von Frey che le larve di Drosophila sviluppano sia allodinia meccanica che iperalgesia meccanica dopo l'irradiazione UV. La sensibilizzazione meccanica mostra alcune differenze rispetto alla sensibilizzazione termica. Sia l'esordio che il picco di sensibilizzazione meccanica sono precedenti (~4 h) rispetto alla sensibilizzazione termica (termica) (~8 h per l'iperalgesia e ~24 h per l'allodinia)⁷. Inoltre, l'allodinia meccanica e l'iperalgesia sono concomitanti (entrambi picco a ~4 h). Inoltre, mentre la sensibilizzazione al calore (allodinia e iperalgesia) si risolve completamente nei punti 7 del tempo^successivo,l'ipersensibilità meccanica ha mostrato una lunga coda che è rimasta leggermente al di sopra della linea di base. La sensibilizzazione a freddo in Drosophila comporta un passaggio nei comportamenti evocati a freddo^{9 e l'emergere} di nuovi comportamenti evocati dal freddo, un fenomeno che non si osserva con la stimolazione meccanica. Queste differenze nell'insorgenza, nella durata e nei comportamenti osservati suggeriscono che ogni modalità sensoriale può essere controllata da diverse vie di segnalazione. Combinare il saggio di sensibilizzazione qui descritto con i potenti strumenti genetici disponibili in Drosophila dovrebbe consentire una precisa dissezione genetica dell'ipersensibilità meccanica (allodinia e iperalgesia) osservata.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker	Fisher Scientific	02-540C	Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do.
Black (Arkansas) bench stone	Dan’s Whetstone	SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C	Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/
Confocal microscope	Olympus	FV1000	Any equivalent confocal microscope will do
Coplin Jar	Fisher Scientific	08-816	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816
Diethyl ether	Fisher Scientific	E138-500	For anesthetizing larvae.
Etherization chamber			This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape.
Fiber Optic Light Guide	Schott AG	A08575	Schott Dual Gooseneck 23 inch
Forceps	Fine Science Tool	FS-1670	For transferring larvae
Glue	Aleene's	N/A	Aleene's® Wood Glue, formerly called (Aleene's All-Purpose Wood Glue) https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue
Graspable holder	Loew Cornell	N/A	Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces.
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898-100ML
Hypodermic needle 30G 1/2"L	Fisher Scientific	NC1471286	BD Precisionglide® syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires
Large Petridish	Falcon	351007	60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish
Microscope (Zeiss) Stemi 2000	Carl Zeiss, Inc.	NT55-605	Any equivalent microscope will do
Microscope Cover Glass 22x22	Fisher	12-545-B
Microscope Cover Glass 22x40	Corning	2980-224	Tickness 1 1/2
Microscope Slides	Globe Scientific Inc.	1358Y
Mini Diagonal Cutter	Fisher Scientific	S43981	For cutting nitinol filaments
Nitinol filaments, Diameters: 0.004”, 0.006”, 0.008”	Mailin Co	N/A	Fifteen pieces of each diameter of 12” length were ordered. https://malinco.com/
Piece of black vinyl	Office Depot	N/A	We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva
Small Petridish	Falcon	351008	35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish
Spatula	Fisher Scientific	21-401-10	Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish
Wipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture.
W1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605	Control strain for behavioral assays
ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP	Bloomington Drosophila Stock Center	8749	Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons