تقييم قدرة معالجة الدهون في الجسم كله في الفئران

Summary

توفر هذه الورقة ثلاثة اختبارات سهلة ويمكن الوصول إليها لتقييم استقلاب الدهون في الفئران.

Abstract

تقييم التمثيل الغذائي للدهون هو حجر الزاوية في تقييم وظيفة التمثيل الغذائي، ويعتبر أساسيا لدراسات التمثيل الغذائي في الجسم الحي. الدهون هي فئة من العديد من الجزيئات المختلفة مع العديد من المسارات المشاركة في التوليف والتمثيل الغذائي. هناك حاجة إلى نقطة انطلاق لتقييم الهموستاسي الدهون للتغذية والسمنة البحوث. تصف هذه الورقة ثلاث طرق سهلة ويمكن الوصول إليها تتطلب القليل من الخبرة أو الممارسة لإتقانها ، ويمكن تكييفها من قبل معظم المختبرات لفحص تشوهات التمثيل الغذائي للدهون في الفئران. هذه الطرق هي (1) قياس العديد من جزيئات الدهون في مصل الصيام باستخدام مجموعات تجارية (2) القياس لقدرة على التعامل مع الدهون الغذائية من خلال اختبار التسامح داخل الدهون عن طريق الفم، و (3) تقييم الاستجابة لمجمع الصيدلانية، CL 316،243، في الفئران. معا، ستوفر هذه الطرق نظرة عامة عالية المستوى على قدرة التعامل مع الدهون في الفئران.

Introduction

الكربوهيدرات والدهون هما ركائز رئيسية لعملية التمثيل الغذائي للطاقة. يؤدي التمثيل الغذائي للدهون الشاذة إلى العديد من الأمراض البشرية، بما في ذلك داء السكري من النوع الثاني، وأمراض القلب والأوعية الدموية، وأمراض الكبد الدهنية، والسرطانات. يتم امتصاص الدهون الغذائية ، والدهون الثلاثية بشكل رئيسي ، من خلال الأمعاء في الجهاز اللمفاوي وتدخل الدورة الدموية الوريدية في chylomicrons بالقرب من القلب¹. يتم حمل الدهون بواسطة جزيئات البروتين الدهني في مجرى الدم ، حيث يتم تحرير مويتات الأحماض الدهنية من خلال عمل ليباز البروتين الدهني في الأعضاء الطرفية مثل العضلات والأنسجة الدهنية². يتم مسح الجسيمات المتبقية الغنية بالكوليسترول من الكبد^3. وقد استخدمت الفئران على نطاق واسع في المختبرات كنموذج للبحوث لدراسة التمثيل الغذائي للدهون. مع مجموعة أدوات وراثية شاملة متاحة ودورة تربية قصيرة نسبيا ، فهي نموذج قوي لدراسة كيفية امتصاص الدهون وتوليفها واستقلابها.

نظرا لتعقيد عملية التمثيل الغذائي للدهون ، وعادة ما تستخدم دراسات الدهون المتطورة أو دراسات التتبع النظيري لتحديد مجموعات من أنواع الدهون أو التدفقات الأيضية ذات الصلة بالدهون والمصائر^4،5. وهذا يخلق تحديا هائلا للباحثين دون معدات متخصصة أو خبرة. في هذه الورقة، نقدم ثلاثة اختبارات يمكن أن تكون بمثابة اختبارات أولية قبل استخدام التقنيات الصعبة تقنيا. وهي إجراءات غير نهائية للفئران ، وبالتالي مفيدة للغاية لتحديد الاختلافات المحتملة في قدرة التعامل مع الدهون وتضييق العمليات المتأثرة.

أولا، يمكن لقياس جزيئات الدهون في مصل الصيام أن يساعد المرء على التأكد من الملف الشخصي العام للدهون في الماوس. يجب صائم الفئران ، لأن العديد من أنواع الدهون ترتفع بعد الوجبات ، ويتأثر مدى الزيادة بشدة بتكوين النظام الغذائي. يمكن قياس العديد من جزيئات الدهون، بما في ذلك الكوليسترول الكلي والدهون الثلاثية والأحماض الدهنية غير الم استرضد (NEFA)، باستخدام عدة تجارية وقارئ لوحة التي يمكن قراءة امتصاص.

ثانيا، يقوم اختبار التسامح داخل الدهون عن طريق الفم بتقييم القدرة على التعامل مع الدهون كأثر صافي للامتصاص والتمثيل الغذائي. يسبب الدهون الداخلية المدارة عن طريق الفم ارتفاعا في مستويات الدهون الثلاثية المتداولة (1-2 ساعة) ، وبعد ذلك تعود مستويات الدهون الثلاثية في المصل إلى المستويات القاعدية (4-6 ساعات). يقدم هذا المقايسة معلومات حول مدى تمكن الماوس من التعامل مع الدهون الخارجية. القلب والكبد والأنسجة الدهنية البنية هي المستهلكين النشطين من الدهون الثلاثية، في حين أن الأنسجة الدهنية البيضاء يخزن كاحتياطي للطاقة. ستؤدي التغييرات في هذه الوظائف إلى اختلافات في نتائج الاختبار.

وأخيرا، يعتبر تعزيز تحلل الدهون لتعبئة الدهون المخزنة استراتيجية محتملة لفقدان الوزن. مستقبل β3-adrenergic مسار الإشارات في الأنسجة الدهنية يلعب دورا هاما في انحلال الدهون الدهون, وعلم الوراثة البشرية قد حددت فقدان وظيفة تعدد الأشكال Trp64Arg في مستقبلات β3-الأدرينالية المرتبطة السمنة⁶. CL 316,243, محددة وقوية β3-adrenergic مستقبلات ناهض, يحفز تحلل الدهون الأنسجة الدهنية والإفراج عن الجلسرين. تقييم استجابة الماوس لCL 316,243 يمكن أن توفر معلومات قيمة عن تطوير, تحسين, وفهم فعالية المركب.

بشكل جماعي ، يمكن استخدام هذه الاختبارات كشاشة أولية للتغيرات في الحالة الأيضية للدهون للفئران. ويتم اختيارهم لسهولة الوصول إلى الأجهزة والكواشف. مع النتائج المستمدة من هذه المقايسات، يمكن للباحثين تشكيل صورة عامة للياقة الأيضية لحيواناتهم واتخاذ قرار بشأن نهج أكثر تطورا واستهدافا.

Protocol

يتم إيواء الحيوانات في ظروف موحدة بعد رعاية الحيوانات والبروتوكولات التجريبية التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه في كلية بايلور للطب (BCM). يتم تغذية الحيوانات بنظام غذائي قياسي أو خاص ، و libitum إعلان الماء ، ويتم الاحتفاظ بها مع دورة نهارية / ليلية لمدة 12 ساعة.

1. قياس الدهون مصل الصيام

1. نقل الفئران إلى قفص جديد بعد الساعة 5 مساء وبسرعة مع حرية الوصول إلى الماء، بين عشية وضحاها (مع حوالي 16 ساعة من الصيام قبل التجربة). يضمن الصيام الليلي إفراغا كاملا لمسالك الجهاز الهضمي للفئران.
   ملاحظة: تأكل الفئران برازها أثناء الصيام، لذلك لا يمكن لسحب الطعام ضمان صيامها بشكل كاف.
2. في صباح اليوم التالي، أمسك الماوس من الذيل ووضعه على السطح. سحب بلطف على ذيل الماوس لوضع الماوس في المقيد. ضع ضبط النفس الأنف لإعادة تدريب حركة الماوس في حين لا يزال يسمح الماوس للتنفس. شد مقبض الأنف. مراقبة حركات الصدر للتأكد من أن الحيوان يتنفس بشكل طبيعي وتقليل الوقت الذي يقضيه الفأر في التقييد.
3. إجراء شق سطحي (نيك) في الوريد الذيل من الماوس حرة الحركة، ورسم 25 ميكرولتر من الدم من شق في الشعرية الزجاجية (ملء حوالي 1/3 من الشعرية) دون كبح جماح الماوس. بسرعة تفجير الدم في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
4. وقف النزيف باستخدام مساحيق ستاستيك، وإعادة ملء الأعلاف في القفص، وتأكد من الفئران تظهر أي علامات الإجهاد.
5. أكمل سحب الدم لجميع الفئران.
6. السماح للدم لتجلط عن طريق تركها دون عائق في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. تدور عينات الدم المتخثر في 2000 x ز في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في جهاز الطرد الدقيق على مقاعد البدلاء المبردة، ونقل supernatant (المصل) للتحليل.
   ملاحظة: يمكن تخزين المصل عند -20 درجة مئوية لعدة أسابيع حتى التحليل. للتخزين على المدى الطويل، والحفاظ على المصل في -70 درجة مئوية.
7. تحليل كل المستقلب الدهون باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة المقدمة.

2. اختبار التسامح داخل الدهون عن طريق الفم

1. بعد الساعة 5 مساء، قم بوزن الفئران لحساب الحجم داخل الدهون الذي سيتم إعطاؤه لهم في اليوم التالي. ثم، نقل الفئران إلى قفص جديد وسريع لهم بين عشية وضحاها (16 ساعة).
2. في صباح اليوم التالي، وضع علامة ذيول الفئران الموجودة في قفص واحد للمساعدة في التعرف عليها في خطوات النزيف اللاحقة.
3. جعل في الوريد الذيل ورسم 15 ميكرولتر من الدم من شق في الشعيرات الدموية الزجاجية (ملء حوالي 1/5 من الشعرية)، وتفجير الدم بسرعة في أنبوب الطرد الدقيق لT = 0 المصل.
   ملاحظة: ليست هناك حاجة لوقف النزيف أثناء الفحص ما لم تظهر الفئران النزيف الزائد.
4. فئران Gavage 20٪ داخل الدهون باستخدام إبرة غافاج 18G بنسبة 15 ميكرولتر لكل غرام من وزن الجسم، وذلك باستخدام وزن الجسم قبل الصيام. مكدس كل ماوس من قبل 1 دقيقة.
   ملاحظة: وزن الحيوان وتحديد حجم إبرة gavage المناسبة. عموما، إبرة gavage قياس 18 مناسبة للفئران >25 غرام، وإبرة gavage قياس 20-22 سيكون أكثر ملاءمة للحيوانات الصغيرة. قف على الفأر، وأمسك الجلد على الكتفين لعقد رأس الحيوان في مكانه. ضع إبرة الغافاج في الفم ثم تقدم بلطف على طول الحنك العلوي ، حتى يتم الوصول إلى المريء. يجب أن يمر الأنبوب دون مقاومة. بمجرد الوصول إلى العمق المناسب ، يمكن إدارة Intralipid ببطء. إزالة بلطف الإبرة التالية نفس الزاوية أثناء إدخال إبرة بعد إدارة Intralipid. إعادة الحيوان إلى القفص ورصد لعلامات التنفس شاقة أو غيرها من الضيق.
   ملاحظة: يمكن للباحثين الذين يفتقرون إلى الخبرة مع تقنيات نزيف الفم أو الذيل كومة كل فأر من قبل 2 دقيقة أو حتى لفترة أطول.
5. سحب الدم في T = 1 و 2 و 3 و 4 و 5 و 6 ساعات: ارسم 15 ميكرولتر من الدم (1/5 شعرية) لكل فأر من خلال نزيف الذيل ، وفجر الدم بسرعة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
6. قم بتدفير عينات الدم عند 2000 × غرام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في جهاز طرد دقيق. نقل supernatant، بما في ذلك طبقة الدهون العائمة، إلى أنبوب PCR للتخزين. يمكن تخزين الناسخة الفائقة عند -20 درجة مئوية لعدة أسابيع حتى التحليل.
   ملاحظة: يجب أن يكون الناتسخة الفائقة البلازما. إذا كانت بعض العينات قد تخثرت بالفعل بحلول وقت الطرد المركزي ، فإنه لا يؤثر على قياس الدهون الثلاثية.
7. بعد جمع الدم الأخير، وقف النزيف باستخدام مساحيق ستاستيك، إعادة ملء الأعلاف في القفص، وتأكد من الفئران تظهر أي علامات الإجهاد الشديد.
8. تحميل 2 ميكرولتر من معيار الدهون الثلاثية وجمع الفلورات في لوحة 96 جيدا.
9. إضافة 200 ميكرولتر من كاشف الدهون الثلاثية والسماح للوح حضانة لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية لتطوير اللون.
10. قياس الامتصاص في 500 نانومتر مع الطول الموجي المرجعي من 660 نانومتر في قارئ لوحة المختبر، وحساب تركيز العينة.

3. β3 مستقبلات الأدرينالية ناهض CL 316,243 حفز تحلل الدهون المقايسة

1. إعداد CL 316,243 كمحلول مخزون من 5 ملغم/مل (50x) في المالحة المعقمة، وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2. في الصباح ، وزن الفئران لحساب كمية محلول CL 316243 المخفف اللازم للتجربة. سوف يتلقى الماوس 10 ميكرولتر لكل غرام من وزن الجسم من CL المخفف 316,243، لجرعة نهائية من 1 ملغم/ كجم وزن الجسم.
3. نقل الفئران إلى قفص جديد مع حرية الوصول إلى الماء، وبسرعة لهم لمدة 4 ساعات.
4. جعل ما يكفي من محلول 1x CL 316,243 من المخزون 50x باستخدام المالحة. التركيز النهائي لل1x CL 316,243 الحل هو 0.1 ملغم/ مل. استخدام المالحة لمجموعة العلاج السيطرة.
5. وضع علامة على ذيول الفئران الموجودة في نفس القفص لسهولة التعرف عليها أثناء خطوات النزيف.
6. جعل في الوريد الذيل، ورسم 15 ميكرولتر من الدم من شق في الشعيرات الدموية الزجاجية (ملء حوالي 1/5 من الشعيرات الدموية)، وتفجير الدم بسرعة في أنبوب الطرد الدقيق لT = 0 عينة.
   ملاحظة: ليست هناك حاجة لوقف النزيف أثناء الفحص ما لم تظهر الفئران النزيف الزائد.
7. حقن محلول CL 316,243 المخفف (أو التحكم إذا تم تضمينه في التجربة) intraperitoneally بحجم 10 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم. مكدس كل ماوس من قبل 1 دقيقة. استخدم 5 فئران كحد أقصى لكل تجربة مدتها 60 دقيقة، أو 10 فئران لفريق من شخصين.
8. سحب الدم في T = 5، 15، 30، 60 دقيقة: رسم 15 ميكروغرام من الدم (1/5 الشعيرات الدموية) لكل فأر من خلال نزيف الذيل.
9. بعد جمع الدم الأخير، وقف النزيف باستخدام مساحيق ستاستيك، إعادة ملء الأعلاف في القفص، وتأكد من الفئران تظهر أي علامات الإجهاد الشديد.
10. تدور عينات الدم في 2000 x ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في جهاز الطرد المركزي المبردة. نقل supernatant إلى أنبوب PCR للتخزين. يمكن تخزين الناسخة الفائقة عند -20 درجة مئوية لعدة أسابيع حتى التحليل.
11. تحميل 1 ميكرولتر من 2x معايير الجلسرين المخففة تسلسليا (0.156, 0.312, 0.625, 1.25, و 2.5 ملغ / مل تركيزات مكافئ Trioleine) وجمعت الفلورات في لوحة 96 جيدا. إضافة 100 ميكرولتر من كاشف الجلسرين مجانا، والسماح للوح حضانة لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية للون لتطوير.
12. قياس الامتصاص في 540 نانومتر باستخدام قارئ لوحة المختبر، وحساب تركيز العينة.

النتائج

نظهر مع ثلاثة مقتطفات أن كل مقايسة تقدم معلومات قيمة حول التمثيل الغذائي للدهون الفئران. بالنسبة للفئران الذكور C57BL/6J ، التي تواجه تحديا من ثمانية أسابيع من التغذية الغنية بالدهون (HFD) بدءا من عمر ثمانية أسابيع ، كانت مستويات الكوليسترول الإجمالي مرتفعة بشكل كبير ، في حين أن ثلاثي الدهون في...

Discussion

تعمل المقايسات الثلاثة الموصوفة بقوة في المختبر ، مع بعض الاعتبارات الحرجة. الصيام بين عشية وضحاها مطلوب لتحديد مستويات الدهون في مصل الصيام واختبار التسامح داخل الدهون عن طريق الفم. لاختبار التسامح داخل الدهون عن طريق الفم، فمن الأهمية بمكان أن تدور الدم في درجة حرارة الغرفة لتقليل تشكي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
20% Intralipid	Sigma Aldrich	I141
BD Slip Tip Sterile Syringes 1ml	Shaotong	B07F1KRMYN
CL 316,243 Hydrate	Sigma-Aldrich	C5976
Curved Feeding Needles (18 Gauge)	Kent Scientific	FNC-18-2-2
Free Glycerol Reagent	Sigma Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma	G7793
HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT A	Fujifilm Wako Diagnostics	999-34691
HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT B	Fujifilm Wako Diagnostics	991-34891
HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A	Fujifilm Wako Diagnostics	995-34791
HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B	Fujifilm Wako Diagnostics	993-35191
Matrix Plus Chemistry Reference Kit	Verichem	9500
Micro Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-222-168
Microhematrocrit Capillary Tube, Not Heparanized	Fisher Scientific	22-362-574
NEFA STANDARD SOLUTION	Fujifilm Wako Diagnostics	276-76491
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
Thermo Scientific Triglycerides Reagent	Fisher Scientific	TR22421
Total Cholesterol Reagents	Thermo Scientifi	TR13421