Évaluation de la capacité de manipulation des lipides du corps entier chez la souris

Résumé

Cet article fournit trois tests faciles et accessibles pour évaluer le métabolisme des lipides chez la souris.

Résumé

L’évaluation du métabolisme des lipides est une pierre angulaire de l’évaluation de la fonction métabolique et est considérée comme essentielle pour les études in vivo sur le métabolisme. Les lipides sont une classe de nombreuses molécules différentes avec de nombreuses voies impliquées dans leur synthèse et leur métabolisme. Un point de départ pour évaluer l’hémostase lipidique pour la recherche sur la nutrition et l’obésité est nécessaire. Cet article décrit trois méthodes faciles et accessibles qui nécessitent peu d’expertise ou de pratique pour être maîtrisées, et qui peuvent être adaptées par la plupart des laboratoires pour dépister les anomalies du métabolisme des lipides chez la souris. Ces méthodes sont (1) la mesure de plusieurs molécules lipidiques sériques à jeun à l’aide de kits commerciaux (2) le dosage de la capacité de manipulation des lipides alimentaires par un test de tolérance intralipidique par voie orale, et (3) l’évaluation de la réponse à un composé pharmaceutique, CL 316,243, chez la souris. Ensemble, ces méthodes fourniront un aperçu de haut niveau de la capacité de manipulation des lipides chez la souris.

Introduction

Les glucides et les lipides sont deux substrats majeurs pour le métabolisme énergétique. Le métabolisme aberrant des lipides entraîne de nombreuses maladies humaines, y compris le diabète de type II, les maladies cardiovasculaires, les maladies du foie gras et les cancers. Les lipides alimentaires, principalement les triglycérides, sont absorbés par l’intestin dans le système lymphatique et pénètrent dans la circulation veineuse dans les chylomicrons près du cœur¹. Les lipides sont transportés par des particules de lipoprotéines dans la circulation sanguine, où les fractions d’acides gras sont libérées par l’action de la lipoprotéine lipase au niveau des organes périphériques tels que les muscles et le tissu adipeux². Les particules restantes riches en cholestérol restantes sont éliminées par le foie³. Les souris ont été largement utilisées en laboratoire comme modèle de recherche pour étudier le métabolisme des lipides. Avec des outils génétiques complets disponibles et un cycle de reproduction relativement court, ils constituent un modèle puissant pour étudier comment les lipides sont absorbés, synthétisés et métabolisés.

En raison de la complexité du métabolisme des lipides, des études lipidomiques sophistiquées ou des études de traceurs isotopiques sont généralement utilisées pour quantifier des collections d’espèces lipidiques ou des flux métaboliques et des destins liés aux lipides^4,5. Cela crée un énorme défi pour les chercheurs sans équipement ou expertise spécialisés. Dans cet article, nous présentons trois tests qui peuvent servir de tests initiaux avant que des techniques techniquement difficiles ne soient utilisées. Ce sont des procédures non terminales pour les souris, et donc très utiles pour identifier les différences potentielles dans la capacité de manipulation des lipides et réduire les processus affectés.

Tout d’abord, la mesure des molécules lipidiques sériques à jeun peut aider à déterminer le profil lipidique global d’une souris. Les souris doivent être à jeun, car de nombreuses espèces lipidiques augmentent après les repas et l’ampleur de l’augmentation est fortement affectée par la composition du régime alimentaire. De nombreuses molécules lipidiques, y compris le cholestérol total, les triglycérides et les acides gras non estérifiés (NEFA), peuvent être mesurées à l’aide d’un kit commercial et d’un lecteur de plaques pouvant lire l’absorbance.

Deuxièmement, un test de tolérance aux intralipides par voie orale évalue la capacité de manipulation des lipides en tant qu’effet net de l’absorption et du métabolisme. Un intralipide administré par voie orale provoque un pic dans les taux de triglycérides circulants (1 à 2 heures), après quoi les taux sériques de triglycérides reviennent aux niveaux basaux (4 à 6 heures). Ce test offre des informations sur la façon dont une souris peut gérer les lipides exogènes. Le cœur, le foie et le tissu adipeux brun sont des consommateurs actifs de triglycérides, tandis que le tissu adipeux blanc le stocke comme réserve d’énergie. Les changements dans ces fonctions entraîneront des différences dans les résultats des tests.

Enfin, favoriser la lipolyse pour mobiliser les lipides stockés est considéré comme une stratégie possible pour perdre du poids. La voie de signalisation du récepteur β3-adrénergique dans le tissu adipeux joue un rôle important dans la lipolyse adipocytaire, et la génétique humaine a identifié un polymorphisme de perte de fonction Trp64Arg dans le récepteur β3-adrénergique corrélé à l’obésité⁶. CL 316,243, un agoniste spécifique et puissant des récepteurs β3-adrénergiques, stimule la lipolyse du tissu adipeux et la libération de glycérol. L’évaluation de la réponse d’une souris au CL 316 243 peut fournir des informations précieuses sur le développement, l’amélioration et la compréhension de l’efficacité du composé.

Collectivement, ces tests peuvent être utilisés comme un dépistage initial des changements dans l’état métabolique lipidique des souris. Ils sont choisis pour l’accessibilité des instruments et des réactifs. Avec les résultats dérivés de ces tests, les chercheurs peuvent se faire une idée globale de la capacité métabolique de leurs animaux et décider d’approches plus sophistiquées et ciblées.

Protocole

Les animaux sont logés dans des conditions normalisées selon des protocoles de soins et d’expérimentation approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Baylor College of Medicine (BCM). Les animaux sont nourris avec un régime alimentaire standard ou spécial, de l’eau ad libitum, et gardés avec un cycle jour/nuit de 12 heures.

1. Mesure des lipides sériques à jeun

1. Transférer les souris dans une nouvelle cage après 17 heures et rapidement avec un accès libre à l’eau, pendant la nuit (avec environ 16 heures de jeûne avant l’expérience). Le jeûne nocturne assure la vidange complète du tractus gastro-intestinal des souris.
   REMARQUE: Les souris mangent leurs excréments pendant le jeûne, de sorte que le sevrage alimentaire ne peut pas garantir qu’ils sont correctement à jeun.
2. Le lendemain matin, saisissez la souris par la queue et placez-la sur une surface. Tirez doucement sur la queue de la souris pour placer la souris dans le frein. Placez le dispositif de retenue nasale pour réentraîner le mouvement de la souris tout en permettant à la souris de respirer. Serrez le bouton du dispositif de retenue nasale. Surveillez les mouvements de la poitrine pour vous assurer que l’animal respire normalement et minimisez le temps qu’une souris passe dans les contentions.
3. Faites une incision superficielle (entaille) dans la veine caudale de la souris en mouvement libre et tirez 25 μL de sang de l’incision dans un capillaire en verre (remplissant environ 1/3 du capillaire) sans retenir la souris. Soufflez rapidement le sang dans un tube de microcentrifugation.
4. Arrêtez le saignement en utilisant des poudres styptiques, remplissez l’aliment dans la cage et assurez-vous que les souris ne montrent aucun signe de stress.
5. Complétez le prélèvement sanguin pour toutes les souris.
6. Laissez le sang coaguler en le laissant intact à température ambiante pendant 1 heure. Faire tourner les échantillons de sang coagulé à 2 000 x g à 4 °C pendant 10 minutes dans une microcentrifugeuse de paillasse réfrigérée et transférer le surnageant (sérum) pour analyse.
   REMARQUE: Le sérum peut être conservé à -20 ° C pendant plusieurs semaines jusqu’à l’analyse. Pour un stockage à long terme, conservez le sérum à –70°C.
7. Analysez chaque métabolite lipidique à l’aide du protocole fourni par le fabricant.

2. Test de tolérance intralipidique orale

1. Après 17 heures, peser les souris pour le calcul du volume intralipidique à leur donner le lendemain. Ensuite, transférez les souris dans une nouvelle cage et jeûnez-les pendant la nuit (16 heures).
2. Le lendemain matin, marquez les queues des souris logées dans une cage pour aider à les identifier dans les étapes de saignement suivantes.
3. Faites une entaille dans la veine de la queue et tirez 15 μL de sang de l’incision dans un capillaire en verre (remplissant environ 1/5 du capillaire), et soufflez rapidement le sang dans un tube de microcentrifugation pour T = 0 sérum.
   REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’arrêter le saignement pendant le test, sauf si les souris présentent un saignement excessif.
4. Souris Gavage 20% intralipides à l’aide d’une aiguille gavage 18G à un rapport de 15 μl par gramme de poids corporel, en utilisant le poids corporel pré-jeûne. Empilez chaque souris de 1 minute.
   REMARQUE: Pesez l’animal et déterminez la taille appropriée de l’aiguille de gavage. Généralement, une aiguille de gavage de calibre 18 convient aux souris >25 g, et une aiguille de gavage de calibre 20-22 serait plus appropriée pour les petits animaux. Frottez la souris, en saisissant la peau sur les épaules pour maintenir la tête de l’animal en place. Placez l’aiguille de gavage dans la bouche, puis avancez doucement le long du palais supérieur, jusqu’à ce que l’œsophage soit atteint. Le tube doit passer sans résistance. Une fois la profondeur appropriée atteinte, l’intralipide peut être administré lentement. Retirez doucement l’aiguille en suivant le même angle lors de l’insertion de l’aiguille après administration de l’intralipide. Revez l’animal dans la cage et surveillez les signes de respiration laborieuse ou d’autres détresses.
   REMARQUE: Les chercheurs qui n’ont pas d’expérience avec les techniques de gavage oral ou de saignement de la queue peuvent empiler chaque souris de 2 minutes ou même plus.
5. Prélever du sang à T = 1, 2, 3, 4, 5 et 6 heures : Prélever 15 μL de sang (1/5 capillaire) par souris en saignant la queue et souffler rapidement le sang dans un tube de microcentrifugation.
6. Faire tourner les échantillons de sang à 2 000 x g à température ambiante pendant 10 minutes dans une microcentrifugeuse. Transférer le surnageant, y compris la couche de graisse flottante, dans un tube PCR pour le stockage. Le surnageant peut être conservé à –20 °C pendant plusieurs semaines jusqu’à l’analyse.
   REMARQUE: Le surnageant doit être du plasma. Si certains échantillons ont déjà coagulé au moment de la centrifugation, cela n’affecte pas la mesure des triglycérides.
7. Après la dernière collecte de sang, arrêtez le saignement à l’aide de poudres styptiques, remplissez l’aliment dans la cage et assurez-vous que les souris ne montrent aucun signe de stress extrême.
8. Chargez 2 μL de triglycérides étalons et de surnageants collectés dans une plaque de 96 puits.
9. Ajouter 200 μL de réactif triglycérides et laisser la plaque incuber pendant 5 minutes à 37 °C pour le développement de la couleur.
10. Mesurez l’absorbance à 500 nm avec une longueur d’onde de référence de 660 nm dans un lecteur de plaques de laboratoire et calculez la concentration de l’échantillon.

3. β3 Agoniste des récepteurs adrénergiques CL 316 243 Test de lipolyse stimulé

1. Préparer CL 316,243 sous forme de solution type de 5 mg/mL (50x) dans une solution saline stérile et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
2. Le matin, pesez les souris pour calculer la quantité de solution diluée de CL 316 243 nécessaire à l’expérience. La souris recevra 10 μL par gramme de poids corporel de CL 316 243 dilué, pour une dose finale de 1 mg/kg de poids corporel.
3. Transférez les souris dans une nouvelle cage avec un accès libre à l’eau et jeûnez-les pendant 4 heures.
4. Faire suffisamment de 1x CL 316,243 solution à partir de 50x stock en utilisant une solution saline. La concentration finale de 1x CL 316,243 solution est de 0,1 mg/mL. Utilisez une solution saline pour le groupe de traitement témoin.
5. Marquez la queue des souris logées dans la même cage pour une identification facile pendant les étapes de saignement.
6. Faites une entaille dans la veine caudale et tirez 15 μL de sang de l’incision dans un capillaire en verre (remplissant environ 1/5 du capillaire), puisez rapidement le sang dans un tube de microcentrifugation pour T = 0 échantillon.
   REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’arrêter le saignement pendant le test, sauf si les souris présentent un saignement excessif.
7. Injecter une solution diluée de CL 316 243 (ou un témoin si inclus dans l’expérience) par voie intrapéritonéale à un volume de 10 μL/g de poids corporel. Empilez chaque souris de 1 minute. Utilisez un maximum de 5 souris pour chaque expérience de 60 minutes, ou 10 souris pour une équipe de deux personnes.
8. Prélever du sang à T = 5, 15, 30, 60 minutes : prélever 15 μL de sang (1/5 capillaire) par souris par saignement de la queue.
9. Après la dernière collecte de sang, arrêtez le saignement à l’aide de poudres styptiques, remplissez l’aliment dans la cage et assurez-vous que les souris ne montrent aucun signe de stress extrême.
10. Faire tourner les échantillons de sang à 2 000 x g à 4 °C pendant 5 minutes dans une microcentrifugeuse réfrigérée. Transférez le surnageant dans un tube PCR pour le stockage. Le surnageant peut être conservé à -20°C pendant plusieurs semaines jusqu’à l’analyse.
11. Charger 1 μL de 2x étalons de glycérol dilués en série (concentrations équivalentes à la trioléine de 0,156, 0,312, 0,625, 1,25 et 2,5 mg/ml d’équivalent trioléine) et recueillir les surnageants dans une plaque de 96 puits. Ajouter 100 μL de réactif glycérol libre et laisser la plaque incuber pendant 5 minutes à 37 °C pour que la couleur se développe.
12. Mesurez l’absorbance à 540 nm à l’aide d’un lecteur de plaques de laboratoire et calculez la concentration de l’échantillon.

Résultats

Nous montrons avec trois extraits que chaque test offre des informations précieuses sur le métabolisme lipidique des souris. Pour les souris mâles C57BL/6J, confrontées à huit semaines d’alimentation riche en graisses (HFD) à partir de l’âge de huit semaines, les taux de cholestérol total étaient significativement élevés, tandis que les triglyycérides sériques et les NEFA ne l’étaient pas(tableau 1),ce qui suggère que les triglycérides et les NEFA dans le sang ne sont pas principale...

Discussion

Les trois tests décrits fonctionnent de manière robuste en laboratoire, avec quelques considérations critiques. Le jeûne nocturne est nécessaire pour déterminer les taux sériques de lipides à jeun et le test de tolérance intralipidique orale. Pour le test de tolérance intralipidique orale, il est essentiel de faire tourner le sang à température ambiante pour minimiser la formation d’une couche de graisse, en particulier aux points de temps de 1 et 2 heures; il est important de ne pas jeter cette couche de g...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
20% Intralipid	Sigma Aldrich	I141
BD Slip Tip Sterile Syringes 1ml	Shaotong	B07F1KRMYN
CL 316,243 Hydrate	Sigma-Aldrich	C5976
Curved Feeding Needles (18 Gauge)	Kent Scientific	FNC-18-2-2
Free Glycerol Reagent	Sigma Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma	G7793
HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT A	Fujifilm Wako Diagnostics	999-34691
HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT B	Fujifilm Wako Diagnostics	991-34891
HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A	Fujifilm Wako Diagnostics	995-34791
HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B	Fujifilm Wako Diagnostics	993-35191
Matrix Plus Chemistry Reference Kit	Verichem	9500
Micro Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-222-168
Microhematrocrit Capillary Tube, Not Heparanized	Fisher Scientific	22-362-574
NEFA STANDARD SOLUTION	Fujifilm Wako Diagnostics	276-76491
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
Thermo Scientific Triglycerides Reagent	Fisher Scientific	TR22421
Total Cholesterol Reagents	Thermo Scientifi	TR13421